一種豬流行性腹瀉病毒的多重rt-pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物監(jiān)測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測(cè) 試劑盒，具體為針對(duì)PEDV、PSV和SaV -步法三重RT-PCR的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來仔豬腹瀉病廣泛流行于全國各地，患病仔豬發(fā)病率、死亡率均高達(dá)80%以 上，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。冠狀病毒科豬流行性腹瀉病毒（PHW)、傳染性胃腸炎 病毒（TGEV)以及呼腸孤病毒科豬A群輪狀病毒（GARV)是導(dǎo)致豬腹瀉的三種主要病毒性 病原。在腹瀉病因的調(diào)查中常呈混合感染，關(guān)于這三種病毒的多重檢測(cè)方法有很多文獻(xiàn)報(bào) 道。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道豬博卡病毒（PBoV)、豬薩佩羅病毒（PSV)和豬札幌病毒（SaV)可以引起 豬的腹瀉，但相對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道較少也沒有引起足夠的重視。PSV是單股正鏈RNA病毒，屬于小 RNA病毒科，《病毒分類-國際病毒分類委員會(huì)（ICTV)第八次報(bào)告》最終將其命名為薩佩 羅病毒屬，該屬包括豬薩佩羅病毒、禽薩佩羅病毒和猿薩佩羅病毒。該病毒能引起中度或 嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、腹瀉、繁殖障礙和肺炎。PSV能在豬腸道上皮細(xì)胞繁殖，并隨著糞便 排出體外，使該病毒在環(huán)境中大量存在，感染豬在康復(fù)后可繼續(xù)排毒，因此在飼養(yǎng)豬群中感 染率較高。該病毒若與其他病原如豬瘟病毒（CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)以 及豬細(xì)小病毒（PPV)等混合感染，將造成病豬嚴(yán)重的臨床癥狀。豬腸道杯狀病毒（Porcine enteric calicivirus，PECV)包括豬諾如病毒（norovirus，NoV)和豬札幌病毒（Porcine sapovirus，SaV)。豬NoV只感染成年豬，且無臨床癥狀；而豬SaV感染各年齡的豬尤其斷奶 仔豬，并引起仔豬腹瀉，給養(yǎng)殖業(yè)帶來一定損失。SaV分為5個(gè)基因群（GI-GV)，其中GIII 為豬SaV，其余為人SaV，世界首例豬SaV(Sw/SV/Cowden/80/US)于1980年在美國報(bào)道，英 國、委內(nèi)瑞拉和韓國等國家也陸續(xù)有暴發(fā)該病的報(bào)道，黃澤彬等于2009年首次報(bào)道該病也 存在于我國的豬群中。
[0003] 多重PCR是在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物對(duì)多個(gè)目的基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增的試 驗(yàn)方法。該項(xiàng)技術(shù)具有省時(shí)、省力、降低成本、減少產(chǎn)物污染等優(yōu)點(diǎn)。多重PCR能夠捕獲更 多的信息，使應(yīng)用范圍更加廣泛，分析的基因更加復(fù)雜。因此建立一種能夠同時(shí)檢測(cè)PEDV、 PSV和SaV多重RT-PCR方法有助于快速鑒別診斷疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于立一種快速、敏感的鑒別診斷PEDV、PSV和SaV多重RT-PCR檢測(cè) 方法。
[0005] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括引物組合物： PEDV-Pl :5' -CTGCCAATGTATTTGCCAC-3'、PEDV-P2 :5' -GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3' ； PSV-Pl :5' -TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3'、PSV-P2 :5' -GCCCTGCACAACTGCTTTC-3' ；SAV-P1 : 5' -TACGGGGGAATAGGTTT-3'、SAV-P2 :5' -CAGCCACATCTGGGTAGT-3'。
[0007] 本發(fā)明所述的RT-PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為為：PrimeScript lstep Enzyme Mix (內(nèi)含 PrimeScript Reverse Transcriptase、TaKaRa Ex Taq Hot Start 及 RNase Inhibitor)2yl、2X lstep Buffer(內(nèi)含反應(yīng) Buffer 和dNTP Mixture(終濃度 400 μ M) )25 μ 1、上游引物（10 μ M)各I μ 1、下游引物（10 μ M)各I μ 1、模板RNA 5 μ 1，加 DEPC 水至 50 μ 1。
[0008] 針對(duì)上述反應(yīng)體系，反應(yīng)條件具體為：50°C 30min ;94°C 2min ;94°C 30sec， 55°C 30sec，72°C 30sec，35 個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后再 72°C IOmin0
[0009] 本發(fā)明所述的引物組合物根據(jù)GenBank收錄的PEDV序列（CV777) SI基因、PSV序 列（YC2011)保守基因和SAV序列Cowden(AF182760)VPl基因設(shè)計(jì)得到。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種豬流行性腹瀉病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0011] 1)病料的處理：用IOmmol · L 1PBS緩沖液將糞樣稀釋10倍，在渦旋儀上振蕩混勻 5min后，12000r · min 1離心5min，取上清液備用；
[0012] 2)RNA的提?。簩悠贩謩e依次利用氯仿、異丙醇萃取離心，棄上清，在沉淀中加 入冰乙醇混勻，室溫下靜置，沉淀即為總RNA ;
[0013] 3) RT-PCR反應(yīng)體系的建立
[0014] 反應(yīng)體系為 50 μ I :PrimeScript lstep Enzyme Mix (內(nèi)含 Prime Script Reverse Transcriptase、TaKaRa Ex Taq Hot Start 及 RNase In hibitor)2 μ1、2X lstep Buffer(內(nèi)含反應(yīng) Buffer 和 dNTP Mixture(終濃度 400 μΜ))25 μ 1、上游引物 (10μΜ)1μ1、下游引物（10μΜ)1μ1、模板RNA 5μ1，加 DEPC水至 50μ1 ;
[0015] 反應(yīng)參數(shù)為：5〇Γ 3Omin ;94°C 2min ;94°C 3〇sec，55°C 3Ose c，72°C 3Osec,35 個(gè) 循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后再72°C IOmin ;
[0016] 4)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
[0017] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的引物組 合物，所述的引物組合物包括：PEDV-P1 :5' -CTGCCAATGTATTTGCCAC-3'、PEDV-P2 : 5, -GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3' ；PSV-P1 :5, -TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3，、PSV-P2 : 5? -GCCCTGCACAACTGCTTTC-3, ；SAV-P1 -TACGGGGGAATAGGTTT-3 \ SAV-P2 ： 5' -CAGCCACATCTGGGTAGT-3'。
[0018] 本發(fā)明所述的豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉病毒、豬薩佩羅病毒和豬札幌病 毒。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明建立的PEDV、PSV、SAV-步法多重RT-PCR檢測(cè)方法， 特異性強(qiáng)，敏感度高，將RT和PCR兩步反應(yīng)一步進(jìn)行，既節(jié)省了時(shí)間和步驟，同時(shí)也大大減 少了對(duì)RNA的污染和降解機(jī)率，可以在同一體系中同時(shí)檢測(cè)3種引起豬腹瀉的病毒，大大降 低了檢測(cè)成本，為臨床上病原感染性調(diào)查研究提供了簡(jiǎn)便、快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，具有重 要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0020] 圖1是PEDV、PSV和SAV單項(xiàng)RT-PCR不同退火溫度的電泳圖；M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ; 1 ~8、9 ~16 和 17 ~24 的 Tm 值分別為 51. 0、5L 5、52. 4、53. 8、55. 5、56. 8、57. 6、58. (TC 8 個(gè)梯度；1~8為等量PEDV RNA模板；9~16 :為等量PSV RNA模板；17~24 :為等量SAV RNA模板；
[0021] 圖2是PEDV、PSV和SAV單項(xiàng)RT-PCR不同引物濃度的電泳圖；M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ; 1~8、9~16和17~24加入的引物量分別為L 5、L 35、L 2、L 0、0· 75、0· 5、0· 35和 0. 2 μ 1 ;1~8為等量SAV RNA模板；9~16 :為等量PSV RNA模板；17~24 :為等量PEDV R NA模板；
[0022] 圖3是多重RT-PCR不同退火溫度的電泳圖；M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ; 1~8的Tm值分 別為 53. 0、53· 8、54· 5、55· 0、55· 5、56· 0、56· 8、57. 5°C 8 個(gè)梯度；
[0023] 圖4是不同混合模板的多重RT-PCR的電泳圖；M. DNA標(biāo)準(zhǔn)D L2000 ;1.為PEDV、 PSV 和 SAV 混合 RNA 模板；2 ~6 :為 PEDV-TGEV-GARV 三聯(lián)弱毒疫苗 RNA、PSV、SAV、CSFV、 PRRSV RNA 模板；7 ~10 :PCV2、PRV、PPV DNA 模板以及 H2O ;
[0024] 圖5是PEDV、PSV和SAV混合RNA模板不同濃度的電泳圖；M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ; 1~ 7 :PEDV、PSV 和 SAV 混合 RNA 模板稀釋度依次為 10°、101、102、103、104、10 5、106、107。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0026] 實(shí)驗(yàn)材料
[0027] 病毒：豬瘟病毒（CSFV)和豬圓環(huán)病毒II型（PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)、豬偽狂犬病毒（PRV)弱毒疫苗和豬薩佩羅病毒（PSV)、豬札幌病毒（SaV)由作者 實(shí)驗(yàn)室保存，豬細(xì)小病毒（PPV)、豬流行性腹瀉病毒（PHW)、流行性腹瀉-豬傳染性胃腸 炎-豬A群輪狀病毒三聯(lián)弱毒株由浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。
[0028] 主要試劑及儀器：RNAiso Plus (Total RNA extraction reagent)(批號(hào)： v201301Da)、PrimeScriptTM One St印 RT-PCR Kit Ver. 2(批號(hào)：v201309Da、AK3402)、 TaKaRa Ex Taq Hot Start (批號(hào)：NA501CA)和 DL2000DNA Marker 購自大連寶生物工程有 限公司；氯仿、異丙醇、冰乙醇購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司。S1000TM Ther mal Cycler PCR 儀、Bio-RAD Gel DocTM XR+紫外凝膠成像分析系統(tǒng)和核酸電泳儀為美國Bio-RAD公司產(chǎn) 品。
[0029] 實(shí)施例1 RT-PCR反應(yīng)體系的建立
[0030] 1)根據(jù)GenBank收錄的PEDV序列（cv777) Sl基因