一種快速定量檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的免疫熒光試紙條及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速定量檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的免疫熒光試紙條及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea, PED)是由冠狀病毒科豬流行性腹 瀉病毒引起的一種侵害豬腸道的急性傳染病。能夠引起各年齡的豬發(fā)生嘔吐、腹瀉和脫 水。各年齡豬均易感，尤其是對(duì)1周齡內(nèi)的新生仔豬危害最大。新生仔豬的發(fā)病率可達(dá) 60%-100%，死亡率高達(dá)100%。導(dǎo)致仔豬的大批死亡，生豬出欄率下降，造成市場(chǎng)豬肉供應(yīng)不 足，影響豬肉價(jià)格穩(wěn)定。本病在歐洲和亞洲傳播非常廣泛，每年都會(huì)給一些國(guó)家和地區(qū)造成 嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害。2013年和2014年P(guān)EDV分別席卷了美國(guó)和 加拿大的養(yǎng)豬業(yè)。加拿大食品檢驗(yàn)局（CFIA)于2014年3月份發(fā)布公告認(rèn)為血漿蛋白粉有 可能是豬流行性腹瀉的罪魁禍?zhǔn)住Ｒ驗(yàn)樽胸i飼料生產(chǎn)中會(huì)添加血漿蛋白粉，所以為PEDV的 大規(guī)模傳播提供了潛在的機(jī)會(huì)。為了降低飼料中攜帶PEDV病原的風(fēng)險(xiǎn)，我們急需一種簡(jiǎn)單 快速的方法對(duì)原料中的PEDV病原進(jìn)行檢測(cè)，降低飼料攜帶病原的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)對(duì)疾病做出早 期診斷，提前采取防控措施，也是降低養(yǎng)殖戶因疾病帶來的損失的最好途徑。
[0003] 目前常用的檢測(cè)PEDV的方法有病毒分離鑒定、RT-PCR、ELISA法、免疫熒光法（IF) 和膠體金。其中病毒分離鑒定、RT_PCR、ELISA法、免疫熒光法（IF)必須結(jié)合實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn) 行確診，操作繁瑣費(fèi)時(shí)，需要專門的試驗(yàn)技術(shù)人員和儀器設(shè)備，只能用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。不適 合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和基層獸醫(yī)工作人員的使用。另外，由于PEDV可造成持續(xù)感染，這給PEDV的 臨床檢測(cè)帶來了巨大的困難。
[0004] 關(guān)于PEDV的快速診斷試紙條我國(guó)目前還沒有同類產(chǎn)品上市，市場(chǎng)上有韓國(guó)進(jìn)口 的PEDV膠體金檢測(cè)試紙條在銷售，但其只能進(jìn)行PEDV的定性不能定量，且成本過于昂貴， 普通養(yǎng)殖戶使用不起；且其靈敏度不是很高。因此建立PEDV的快速檢測(cè)方法，用于PEDV的 感染早期和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，有利于對(duì)感染PEDV的母豬進(jìn)行及時(shí)免疫，防止疾病的擴(kuò)散，有 利于養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展；同時(shí)對(duì)飼料原料血漿蛋白的污染源進(jìn)行質(zhì)量控制，降低從飼料途 徑造成PEDV流行的風(fēng)險(xiǎn)。以抗PEDV的納米抗體研制PEDV病原的快速檢測(cè)方法，在國(guó)內(nèi)外 尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述存在的問題，本發(fā)明通過研宄，制備了一種特異性高、靈敏度高的納 米抗體(抗PEDV單域抗體)，并基于此抗體制備了一種能夠快速定量檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒 的免疫熒光檢測(cè)試紙條。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速定量檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的免疫熒光試紙條。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的單域抗體，其氨基酸序列為如SEQ ID NO :6所示。
[0008] -種用于檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的單域抗體，編碼該單域抗體氨基酸序列的核苷 酸序列如SEQ ID NO :3所示。
[0009] -種快速定量檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的免疫熒光試紙條，包含附著于底板上且 依次緊密相連的樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊；所述結(jié)合墊上含有熒光微球標(biāo)記的抗 PEDV單域抗體；所述層析膜上設(shè)置有一條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，檢測(cè)線靠近結(jié)合墊，質(zhì)控 線靠近吸水墊，檢測(cè)線上包被有抗PEDV的多克隆抗體，質(zhì)控線上包被有能與熒光微球標(biāo)記 的抗PEDV單域抗體結(jié)合的蛋白； 其中所述的抗PEDV單域抗體為上述所述的單域抗體。
[0010] 進(jìn)一步的，上述質(zhì)控線上包被的能與熒光微球標(biāo)記的抗PEDV單域抗體結(jié)合的蛋 白為兔抗雙峰駝IgG。
[0011] 進(jìn)一步的，上述樣品墊為玻璃纖維膜。
[0012] 進(jìn)一步的，上述層析膜為硝酸纖維素膜。
[0013] 進(jìn)一步的，上述吸水墊為吸水紙。
[0014] 進(jìn)一步的，上述質(zhì)控線和檢測(cè)線之間的距離為4. 5~5. 5mm。
[0015] 進(jìn)一步的，上述質(zhì)控線用0. 5~I. 5mg/mL兔抗雙峰蛇IgG進(jìn)行包被，用量為1 μι/ cm 〇
[0016] 進(jìn)一步的，上述檢測(cè)線用0. 8~I. 2 mg/mL抗PEDV多克隆抗體包被，用量為2μLν cm 〇
[0017] 本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明制備的免疫熒光快速試紙技術(shù)是應(yīng)用納米熒光顆粒(熒光微球標(biāo)記的PEDV 單域抗體)構(gòu)建出一種可定性同時(shí)定量的快速檢測(cè)試紙。操作者無需培訓(xùn)和專業(yè)知識(shí)，操作 簡(jiǎn)單，5~10分鐘即可獲得結(jié)果，若與熒光定量?jī)x連用，可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，同時(shí)該技術(shù)靈敏度 明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的膠體金檢測(cè)試紙技術(shù)，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
[0018] 2)抗體作為免疫試紙條檢測(cè)技術(shù)的核心部分，其特異性及親和力決定了測(cè)定結(jié)果 的準(zhǔn)確性和靈敏度。本發(fā)明采用了特定制備的高靈敏的、PEDV特異性的單域重鏈（VHH)抗 體，研制成檢測(cè)PEDV病原的快速檢測(cè)試紙，目前在國(guó)內(nèi)外均未見報(bào)道。
【附圖說明】
[0019] 圖1為實(shí)施例1中RT-PCR擴(kuò)增VHH基因片段的結(jié)果圖； 圖2為SDS-PAGE檢測(cè)PEDV單域抗體的結(jié)果； 圖3為PEDV免疫熒光快速檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為塑料底板，2為樣品墊， 3為結(jié)合墊，4為硝酸纖維素膜，5為吸水紙，6為檢測(cè)線T，7為質(zhì)控線C。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1豬流行性腹瀉病毒重鏈單域抗體的制備 1)動(dòng)物免疫 在雙峰駝?lì)i背部皮下和雙側(cè)后腿皮下進(jìn)行多點(diǎn)接種PEDV滅活疫苗。首次免疫劑量為 ImL/頭，共2頭；7天后二免，2 mL/頭；之后間隔14天免疫一次，每次免疫4 mL，共免疫3 次，全程共免疫5次。最后一次免疫后7天采血500 mL分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA進(jìn)行下 一步實(shí)驗(yàn)。
[0021] 2)單域抗體庫的構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增VHH基因片段，通過前期大量實(shí)驗(yàn)研宄篩選出效果最好的引物，其序列 如下： VHH-F :5' - CCTTTCTATGCAGGCCCAGCCGGCCGCA-3'（SEQ ID NO :1); VHH-R:5' - GTTATTATTATTCAGATTATTATGCGGCC-3' （SEQ ID N0: