基因重組沙門氏菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種包含s499_789基因重組沙門氏菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉疾病（Porcine epidemic diarrhea，PED)的病 原，該病以產(chǎn)房1-7日齡仔豬淡黃色水樣腹瀉、嚴(yán)重脫水為主，剖檢可見仔豬腸道內(nèi)脹氣、 有黃色乳凝塊。PEDV主要通過糞-口途徑傳播，產(chǎn)房仔豬通過消化道攝入病毒后，病毒主要 入侵空腸和回腸部位小腸黏膜上皮細(xì)胞，并開始病毒復(fù)制。PEDV的感染導(dǎo)致上皮細(xì)胞膜表 面的雙糖酶（乳糖酶、蔗糖酶、麥芽糖酶）、氨肽酶、堿性磷酸酶的活性下降；同時(shí)，腸絨毛上 皮細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)破壞并發(fā)生細(xì)胞破碎，造成腸絨毛萎縮，腸道表面積減少，從而導(dǎo)致小腸消 化不良、吸收不良等機(jī)能障礙，誘發(fā)仔豬發(fā)生腹瀉并脫水。
[0003] PEDV最早在英國(guó)發(fā)現(xiàn)，并流行于歐洲從上世紀(jì)八十年代以后，中國(guó)、日本、韓國(guó)也 開始有所報(bào)導(dǎo)。2010年至今，該病已廣泛流行于中國(guó)、韓國(guó)、泰國(guó)、美國(guó)等國(guó)。該病對(duì)產(chǎn)房仔 豬極高的發(fā)病率和致死率、較高的治療成本及防控成本，以及病毒基因發(fā)生變異造成強(qiáng)毒 株的出現(xiàn)，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。
[0004] 隨著PEDV分子生物學(xué)研宄的深入，PEDV免疫機(jī)理基本清楚，屬于典型的局部黏膜 免疫為主，存在于血清中PEDV IgG不能提供有效保護(hù)，而腸道黏膜免疫所產(chǎn)生的分泌型抗 體（SIgA)才能抵抗PEDV感染，仔豬通過初乳來獲得母源SIgA，從而產(chǎn)生對(duì)流行性腹瀉的被 動(dòng)免疫保護(hù)。
[0005] 目前大多都是傳統(tǒng)型滅活苗和弱毒苗，但是它存在毒力返強(qiáng)及散毒的風(fēng)險(xiǎn)，需要 改進(jìn)。為了研制出更為安全、高效、成本低廉、保存和使用方法簡(jiǎn)易的豬流行性腹瀉疫苗，人 們開始利用基因工程手段開發(fā)黏膜免疫疫苗，以期達(dá)到進(jìn)一步預(yù)防和控制該病的目的。如， 徐麗麗等構(gòu)建了可表達(dá)PEDV S蛋白C0E區(qū)域、SD區(qū)域的減毒沙門氏菌重組疫苗，其包含的 抗原基因長(zhǎng)，菌株穩(wěn)定性越差，同時(shí)其包含crp毒力基因，安全性難以保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的重組菌株。
[0007] 本發(fā)明提供了一種如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
[0008] 本發(fā)明重組載體，包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述的重組載體 是重組pVAXl。
[0009] 本發(fā)明重組菌，其特征在于：它包含權(quán)利要求2或者3所述的重組載體。
[0010] 所述的重組菌為重組沙門氏菌或者重組大腸桿菌。
[0011] 所述的重組沙門氏菌為重組減毒沙門氏菌SL7207。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種重組蛋白，它是由SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列編碼。它 的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0013] 目的基因S499_789核苷酸序列（SEQ ID NO :1):
[0014] Gttactttgccatcat ttaatgatca ttcttttgtt aatattactg tctctgcggc ttttggtggt cttagtagtg ccaatctcgt tgcatctgac actactatca atgggtttag ttctttctgt gttgacacta gacaatttac cattacactg ttttataatg ttacaaacag ttatggttat gtgtctaaat cacaggatag taattgtcct ttcaccttgc aatctgttaa tgattacctg tcttttagca aattttgtgt ttcaaccagc cttttggctg gtgcttgtac catagatctt tttggttacc ctgcgttcgg tagtggtgtt aagttgacgt ccctttattt tcaattcaca aaaggtgagt tgattactgg cacgcctaaa ccacttgaag gtatcacaga cgtttctttt atgactctgg atgtgtgtac caagtatact atctatggct ttaaaggtga gggtattatt acccttacaa attctagcat tttggcaggt gtttattata catctgattc tggacagttg ttagccttta agaatgtcac tagtggtgct gtttattctg tcacgccatg ttctttttca gagcaggctg catatgttaa tgatgatata gtgggtgtta tttctagttt gtctaactcc acttttaaca atactaggga gttgcctggt ttcttctacc attctaatga cggctccaat tgtacagagc ctgtgttggt gtatagtaac ataggtgttt gtaaatctgg cagtattggc tatgttccat ctcagtatgg ccaagtcaag attgcaccca cggttactgg gaatattagt attcccacca actttagtat gagtatt
[0015]對(duì)應(yīng)的S499_789氨基酸序列（SEQ ID NO :2):
[0016] VKLVKAKARGPRQAGICEVRYTSLVVGSTTKVVSKRVENANVNLVVVDEDVTLNTTGRTVVVDGLAFFE SDGFYRHLADADWIEHPVYKSACELKPVroCDPIPDFPLPVAASVAELCVQTDLLLKNYNTPYKTYSCWRGDKCC ITCTLQFKAPSYVEDAVNFVDLCTKNIGTAGFHEFYITAHEQQDLQGFLTTCCTMSGFECFMPTIPQCPAVLEEIDG GSIWRSFITGLNTMWDFCKRLKVSFGLDGIVVTVARKFKRLGALLAEMYNTYLSTVVENLVLAGVSFK
[0017] 在研宄過程中，發(fā)明人根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選擇S蛋白的第499-789段基因片段，制備得到了 免疫原性非常強(qiáng)的重組菌株，其產(chǎn)生的針對(duì)豬流行性腹瀉病毒特異性SIgA抗體高于滅活 疫苗，可以有效預(yù)防豬流行性腹瀉疾病，取得了意料不到的技術(shù)效果。
[0018] 本發(fā)明包含SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的重組沙門氏菌免疫豬后，可以產(chǎn)生大 量針對(duì)豬流行性腹瀉病毒特異性SIgA抗體，用其制備的疫苗對(duì)豬流行性腹瀉病毒為豬流 行性腹瀉疾病有良好的保護(hù)作用，且SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列短，制備的重組菌株穩(wěn)定 性好，不包含crp毒力基因，安全性好，臨床應(yīng)用前景優(yōu)良。
[0019] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0020]圖1 S499_789基因擴(kuò)增。M :DNA Marker III ;1，2S 499_789基因擴(kuò)增；
[0021]圖2 pMD19-T-S499_789的鑒定。M :DNA Marker III ;1:S 499_789基因擴(kuò)增； 2:pMD19-T-S499_789雙酶切鑒定；
[0022]圖3 pVAX-S499_789的鑒定。M :D