專利名稱：一種良種奶山羊多基因聚合的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及ー種良種奶山羊多基因聚合的選育方法， 該方法應(yīng)用PCR-SSCP和DNA測序技術(shù)檢測被檢個體催乳素受體(PRLR)基因和促黃體素 beta亞基(LHP)基因的單鏈DNA堿基突變多態(tài)性，通過分析高產(chǎn)奶山羊個體(Fl代)多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系確定適宜的分子標(biāo)記，分析高產(chǎn)奶山羊個體(Fl)的不同基因型組合與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系，井上溯親代(H)代)，跟蹤子代(F2代)，檢測母羊個體的基因型組合與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系，研究不同基因型在多胎性狀形成中的貢獻(xiàn)率，然后挑選高產(chǎn)個體的基因型組合，分析高產(chǎn)個體基因型組合形成的選配方式，再應(yīng)用這些選配方式形成奶山羊多羔的多基因聚合良種核心群。
背景技術(shù)：
多胎性狀的選育是奶山羊育種的重要目標(biāo)之一，多胎性狀是由微效多基因決定的數(shù)量性狀，遺傳カ很低(約為0. 23左右)，常規(guī)育種手段在較短時期內(nèi)難以取得明顯進(jìn)展， 這在很大程度上限制了我國奶山羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。隨著動物基因組學(xué)的發(fā)展，大量的DNA 分子標(biāo)記已被開發(fā)和應(yīng)用，動物基因組圖譜繪制逐步完善，越來越多的具有重要經(jīng)濟(jì)意義的功能基因相繼被挖掘出來，與山羊繁殖性狀緊密相關(guān)的研究也取得很大進(jìn)展。基因聚合 (Gene pyramiding)是通過基因工程手段，將分散在不同品種或品系中的優(yōu)良基因通過雜交、回交、復(fù)合雜交等手段聚合到同一個品種中。畜禽的大部分經(jīng)濟(jì)性狀具有加性效應(yīng)，基因表達(dá)呈累加作用，即集中到一個品種中的同效基因越多表達(dá)越充分。目前，國內(nèi)外關(guān)于羊分子育種的研究主要集中在羊的分子標(biāo)記檢測及其與性狀的相關(guān)性方面，對于基因聚合育種技術(shù)大多數(shù)仍然僅停留于概念上，對其理論的研究相對滯后。單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotide Polymorphisms, SNP)就是指基因組 DNA 序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。SNPs可以是兩個或多個等位基因的多態(tài)，因此，通常所說的SNPs包括堿基的插入、缺失、插入/缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。ー個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換 (以ー種嘧啶置換另ー種嘧啶或一種嘌呤置換另ー種嘌呤)以及顛換(嘌呤與嘧啶互換) 所引起。具有顛換型變異的SNPs約占2/3，其他幾種SNP在相似的水平上，因為CpG(核苷酸對，其中G在D NA鏈中緊隨C后)二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發(fā)生突變的位點， 其中大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因內(nèi)或附近都可能找到數(shù)量不等的SNPs，根據(jù)它們在基因組中分布的位置可分為基因編碼區(qū) SNPs(cSNPs)、基因周邊SNPs(pSNPs)和基因間SNPs(iSNPs)等三類。總的說來，cSNP比較少，因為在編碼區(qū)內(nèi)的變異率僅占有周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關(guān)注。根據(jù)對遺傳性狀的影響，cSNPs又可分為兩種ー種是同義cSNPs， 即SNP所致編碼序列的改變并不影響其所翻譯的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的 “含義”相同；另ー種是非同義cSNPs，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。因此，對編碼區(qū)SNPs的非同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響，尤其對于編碼區(qū)突變來說，更可能會導(dǎo)致所編碼的蛋白發(fā)生重大變化，從而影響它的功能的發(fā)揮?；蛐蛄猩蠅A基的插入/缺失突變，同樣將導(dǎo)致所編碼氨基酸的改變從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)序列改變，以致影響到蛋白的生物學(xué)功能， 從而造成對個體的表現(xiàn)型具有重要影響。不僅如此，在群體遺傳研究中，這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。由于SNPs是ニ等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在ー個二倍體生物群體中，SNPs 可能是由2個、3個或4個等位基因構(gòu)成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見， 故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn) SNPs :即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測技術(shù)中，DNA序列測定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測方法， 但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗，所以，DNA序列測定法不是ー種應(yīng)用于生產(chǎn)實際的理想SNP檢測方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測序結(jié)合法檢測SNP可以適當(dāng)降低檢測費用，但是， PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陰性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段;AS-PCR方法作為ー種新型的SNP檢測方法，在未來的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同吋， 檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測SNP位點，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強(qiáng)。催乳素(prolactin，PRL)是ー種垂體前葉肽類激素，已報導(dǎo)的催乳素的作用有 300多種，可將它們分為六大類1)繁殖和泌乳；2)生長和發(fā)育；3)內(nèi)分泌和代謝，4)腦和行為；5)免疫調(diào)節(jié)；6)電解質(zhì)平衡。這些作用由催乳素受體(prolactinreceptor, PRLR) 調(diào)節(jié)。催乳素受體己在包括腦、子宮、胚盤、卵巣在內(nèi)的各種組織中檢測到。以前認(rèn)為不含 PRLR的器官，例如嗅神經(jīng)上皮、胎兒腎上腺皮層、胃、腸及支氣管粘膜、腎管上皮、脈絡(luò)膜叢、 甲狀腺、肝胰上皮也有PRLR的表達(dá)。催乳素受體屬于細(xì)胞因子受體家族成員，這一家族成員還包括一些白細(xì)胞介質(zhì)、顆細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、 白血病抑制因子(LIF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素、肥胖因子等。盡管這些成員在遺傳上明顯無關(guān)，但它們在細(xì)胞外域都含有高度保守的氨基酸序列。鑒于催乳素受體的多種作用，國內(nèi)外對催乳素受體的研究日益深入。促黃體激素(LH)對于維持雄性和雌性動物的繁殖能力來說具有很重要的作用， 哺乳動物排卵主要靠LH的作用。有很多的學(xué)者都在對促黃體激素進(jìn)行更深的探索，并且這些研究都進(jìn)入了分子生物學(xué)的領(lǐng)域。譬如說，對以LH合成為基礎(chǔ)的分子機(jī)制的全面理解需要LHa和LHP啟動子調(diào)控區(qū)域的研究。對亞基基因來說，明顯是多順式元件指導(dǎo)細(xì)胞特異表達(dá)，同時對性類固醇和GnRH作出反應(yīng)，這些研究包括來自3個物種的亞基啟動子。在對促黃體素的生理功能做更廣泛的研究時發(fā)現(xiàn)促黃體激素有一個明顯的特性是它以不連續(xù)的脈沖形式釋放，在排卵前的最后階段形成ー個LH峰促使卵泡成熟和排卵。馬玉林和張壽等的研究數(shù)據(jù)表明，排卵前，在LH的作用下產(chǎn)生的孕酮可以觸發(fā)排卵酶的形成和釋放， 且在LH的作用下，成熟的卵泡能分泌前列腺素，后者可能使成熟卵泡周圍間質(zhì)平滑肌纖維收縮，促使卵泡破裂及排卵。另外，在自然發(fā)情周期中，通常是發(fā)情高潮后的幾個小時出現(xiàn)LH分泌峰，此后的20-24小時排卵。排卵的推遲暗示LH分泌峰和排卵之間的非協(xié)調(diào)作用或 LH分泌峰不足刺激誘導(dǎo)排卵。同時分泌峰能終止顆粒細(xì)胞的生長和成熟，有助于它們分化為黃體顆粒細(xì)胞，促使孕酮的分泌有利于妊娠。因此，當(dāng)綿羊自然發(fā)情、進(jìn)行人工授精的同時給予外源性的LH?？梢约铀袤w內(nèi)LH峰的出現(xiàn)，促使成熟卵泡排卵和排卵后的黃體形成從而達(dá)到提高受胎率的目的。因此，促黃體素是ー種重要的促性腺激素，對于維持雌性和雄性動物的繁殖能力具有很重要的作用。為此，以優(yōu)秀多胎個體為研究起點，通過典型優(yōu)秀母羊個體基因型的上溯和跟蹤， 分析不同基因型和基因型組合在多胎性狀形成中的貢獻(xiàn)率，探索優(yōu)良基因的傳遞規(guī)律及其聚合模式，g在為多胎新品系的建立和分子標(biāo)記輔助多基因聚合育種的實踐提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供ー種良種奶山羊多基因聚合的選育方法。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案ー種良種奶山羊多基因聚合的選育方法，其特征在于，以連續(xù)產(chǎn)2羔及以上的奶山羊基因組DNA為模板，在PCR條件下，利用4對引物PI、P2、P3和P4，分別擴(kuò)增催乳素受體基因和促黃體素beta亞基基因,其中所述的引物Pl如下上游引物IF :5' -TGTCAGTAAGCGTCAGAGGGC-3'；下游引物IR :5' -GGCTGGTGGAAGGTCACTCTT-3'；所述的引物P2如下上游引物2F:5' -CTTACCACAACATTGCTGACG-3'；下游引物2R:5' -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3'；所述的引物P3如下上游引物3F:5' -ACCAGATCTTGGCCCTTG-3'；下游引物3R:5' -CAAAGCCTGAGTCCAAC-3'；所述的引物P4如下上游引物4F:5' -CCTGAGGCACTGGCCTGTCC-3'；下游引物4R:5' -CACCATGCTGGGGCAGTAGCC-3'；引物Pl擴(kuò)增催乳素受體基因內(nèi)含子2，引物P2擴(kuò)增催乳素受體基因外顯子10，用于篩查山羊催乳素受體基因位點的突變；引物P3擴(kuò)增促黃體素beta亞基基因5'非翻譯區(qū)，引物P4擴(kuò)增促黃體素beta亞基基因外顯子1，用于篩查山羊促黃體素beta亞基基因位點的突變；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳對4對引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大小判定，然后采用DNA測序技術(shù)篩查到催乳素受體基因內(nèi)含子2和外顯子10，以及促黃體素beta亞基基因5'非翻譯區(qū)和外顯子I共有4個堿基的突變；再利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對這4個位點的SNPs進(jìn)行基因分型和基因頻率分析， 分析高產(chǎn)奶山羊個體多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系及不同基因型組合與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系，井上溯親代，跟蹤子代，檢測母羊個體的基因型組合與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系，分析不同基因型在多胎性狀形成中的貢獻(xiàn)，挑選高產(chǎn)個體的基因型組合，分析高產(chǎn)個體基因型組合形成的選配方式， 應(yīng)用這些選配方式形成奶山羊多羔的多基因聚合良種核心群。所述的PCR擴(kuò)增的條件是1211し反應(yīng)體系包括0.25じTaq DNA聚合酶，6 ii L的2 XBuffer，0. 4 ii L的山羊基因組DNA樣品，IOpmol/ u L各引物的上、下游引物各0. 4 y L和滅菌超純水4. 7 yしPCR反應(yīng)程序如下I)利用引物Pl的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，68°C退火30s， 72°C延伸30s，如此進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。2)利用引物P2的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C退火30s， 72°C延伸30s，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。3)利用引物P3的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，57°C退火30s， 72°C延伸30s，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。4)利用引物P4的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。所述的催乳素受體基因內(nèi)含子2在114bp存在C — T的突變，外顯子10在319bp 存在C — A的突變；所述的促黃體素beta亞基基因的5'非翻譯區(qū)在153bp存在C — A的突變，外顯子I在64bp存在T — C的突變。所述的基因分型是用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和分析引物PI、P2、P3和P4 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如下引物Pl位點純合型GG在114bp位的堿基是C，雜合型GH在114bp位的堿基是 T\C,純合型HH在114bp位的堿基是T ；引物P2位點純合型CC在319bp位的堿基是C，雜合型⑶在319bp位的堿基是 C\A,純合型DD在319bp位的堿基是A ；引物P3位點純合型QQ在153bp位的堿基是A，雜合型PQ在153bp位的堿基是 C\A,純合型PP在153bp位的堿基是CC ；引物P4位點純合型麗在64bp位的堿基是C，雜合型LM在64bp位的堿基是T\C， 純合型LL在64bp位的堿基是T。所述的高產(chǎn)個體的基因型組合為GGCCPPLL(F1代和F2代)、GGCCPQMM(F1代)和 GGCDPPLL (Fl 代)和 GGCCQQLL (F0 代)。所述的不同基因型在多胎性狀形成中的貢獻(xiàn)率為，CC基因型的聚合效應(yīng)值比CD 基因型的高14. 12%，匪基因型的聚合效應(yīng)值比LM基因型的高3. 8%，PP基因型的聚合效應(yīng)值比QQ基因型的高15. 67%, LL基因型的聚合效應(yīng)值比LM基因型的高11.48% ;PQ基因型的聚合效應(yīng)值比QQ基因型的高11.02%，CD基因型的聚合效應(yīng)值比DD基因型的高 10. 69%與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果提出了與山羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的功能基因PRLR內(nèi)含子2和外顯子10以及LH3基因5' UTR和外顯子I的4個SNPs，這4個SNPs能夠作為ー個分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。
對這兩個基因的SNPs進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，不但分析了 Fl代不同基因型以及基因型組合與產(chǎn)羔性狀之間的關(guān)系，且上溯親代(H)代)，跟蹤子代(F2代)，檢測母羊個體的基因型組合與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系，研究不同基因型在多胎性狀形成中的貢獻(xiàn)率，挑選高產(chǎn)個體的基因型組合，分析高產(chǎn)個體基因型組合形成的選配方式，應(yīng)用這些選配方式形成奶山羊多羔的多基因聚合良種核心群。


圖I是山羊PRLR基因利用引物Pl進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳圖，圖中，M表示Marker I片段，片段長度從上倒下依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp ；圖2是山羊PRLR基因利用引物P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳圖，圖中，M表示=Marker I 片段，片段長度從上倒下依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp ；圖3是山羊LH@基因利用引物P3進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳圖，圖中，M表示Marker I片段，片段長度從上倒下依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp ；圖4是山羊LH@基因利用引物P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增電泳圖，圖中，M表示Marker I片段，片段長度從上倒下依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp ；圖5是山羊PRLR基因利用引物Pl進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP檢測電泳圖，圖中， 1，3表示GH基因型；2表示GG基因型；4，5和6表示HH基因型；圖6是山羊PRLR基因利用引物P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP檢測電泳圖，圖中， 圖中，1，6表示⑶基因型；3，4和5表示CC基因型；2表示DD基因型；圖7是山羊LH3基因利用引物P3進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP檢測電泳圖，圖中， I，3和5表不PP基因型；2和4表不:PQ基因型；6表不:QQ基因型；圖8是山羊LH3基因利用引物P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SSCP檢測電泳圖，圖中， 1，2和4表不LL基因型；3表不LM基因型；5表不MM基因型。以下通過對連續(xù)產(chǎn)2羔及以上的奶山羊基因組DNA的提取、檢測和濃度分析，以及在PCR擴(kuò)增條件下，利用引物P1、P2、P3和P4擴(kuò)增的PRLR內(nèi)含子2和外顯子10以及LH3 基因5' UTR和外顯子I擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯凝膠電泳分析實施例來對本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)說明。
具體實施例方式A、利用引物Pl和P2分別對PRLR內(nèi)含子2和外顯子10以及利用引物P3和P4對 LH^基因5' UTR和外顯子I的PCR擴(kuò)增及其多態(tài)性的檢測I、山羊血樣的采集及處理取山羊血樣5mL,加入0. 2 ii L的AO)(朽1檬酸2. 4g ;梓檬酸三鈉6. 6g ;葡萄糖
7.35g ;定容至50mL，高壓滅菌)抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，_80°C保存?zhèn)溆?。本實施例采用對連續(xù)產(chǎn)2羔及以上的西農(nóng)薩能奶山羊血樣265份，采自陜西省千陽薩能羊種羊場和陜西綠色新世紀(jì)生物有限公司。2、血樣基因組DNA的提取、純化(I)將冷凍血樣室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 ii L至I. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩沖液，充分混勻，12000r/min離心IOmin(4°C ),棄去上清液,重復(fù)上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。(2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 iiL，搖動，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁，37°C水浴Ih0 DNA抽提緩沖液的配制:0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超純水500mL，滅菌，調(diào)pH至8. 0，4°C保存?zhèn)溆谩?3)加蛋白酶K 3iiL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加
IU L蛋白酶K混勻繼續(xù)消化至澄清。(4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 ii L，溫和搖動離心管20min，使其充分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 I. 5mL離心管中，重復(fù)一次。(5)加氯仿500 V- L,充分混勻20min, 4°C, 12000r/min離心IOmin,將上清液轉(zhuǎn)入另一 I. 5mL離心管中。(6)加0. I倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水こ醇，混合轉(zhuǎn)動離心管直至白色的絮狀沉淀析出，-20°C保存30 60min。(7)4°C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70 %的冰冷こ醇漂洗DNA沉淀2次。(8)4°C, 12000r/min離心lOmin,棄去上清液,室溫下使こ醇揮發(fā)干凈。(9)干燥后的DNA溶于80 100 y L的TE-緩沖液或超純水，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-80°C保存。(10) 500 ii L的DNA溶液中加入質(zhì)量濃度10%的SDS，使其終濃度為0. 1%，加入蛋白酶K至終濃度達(dá)到50 u g/mL。(11)5°C保溫 IOh 左右。(12)苯酚、氯仿、異戊醇(25 24 I)混合物和氯仿分別抽提一次，苯酚、氯仿、 異戊醇混合物用量和氯仿等體積。(13) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另ー離心管中。(14)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水こ醇沉淀DNA。(15)倒掉液體，用質(zhì)量濃度70%的こ醇洗滌后晾干，加入60 L滅菌超純水溶解， 4°C待檢測。3、DNA池的構(gòu)建(1)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測選部分DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇DNA樣品條帶均一、無拖尾、無降解的樣品進(jìn)行DNA池的構(gòu)建。(2) OD 值測定用紫外光光度計測定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值，并計算DNA含量和OD26tl/ OD280的比值。如OD26tlAD28tl比值小于I. 6，說明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于I. 8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。DNA 濃度(ii g/mL) = 50 X OD260 值 X 稀釋倍數(shù)(3)品種DNA池的構(gòu)建DNA檢測完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/ u L，然后從西農(nóng)薩能奶山羊265個個體、濃度為50ng/ ii L的DNA的樣品中取5 u L混合構(gòu)建成DNA池。4、PCR擴(kuò)增引物設(shè)計
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物根據(jù)NCBI上GenBank提供的綿羊PRLR基因的序列設(shè)計(登錄號AF042358和AF041257);引物Pl和引物P2，用引物Pl擴(kuò)增PRLR基因內(nèi)含子2，用引物P2擴(kuò)增PRLR基因外顯子10，篩查山羊PRLR基因Pl和P2位點的突變；根據(jù)綿羊LH @基因序列(GenBank登錄號S54695)設(shè)計引物P3和P4，擴(kuò)增促黃體素beta亞基基因5'非翻譯區(qū)和外顯子1，篩查山羊促黃體素beta亞基基因位點的突變；。所述的引物Pl如下上游引物IF :5' -TGTCAGTAAGCGTCAGAGGGC-3'；下游引物IR :5' -GGCTGGTGGAAGGTCACTCTT-3'；所述的引物P2如下上游引物2F:5' -CTTACCACAACATTGCTGACG-3'；下游引物2R:5' -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3'；所述的引物P3如下上游引物3F:5' -ACCAGATCTTGGCCCTTG-3'；下游引物3R:5' -CAAAGCCTGAGTCCAAC-3'；所述的引物P4如下上游引物4F:5' -CCTGAGGCACTGGCCTGTCC-3'；下游引物4R:5' -CACCATGCTGGGGCAGTAGCC-3'；5、PCR 擴(kuò)增分別以西農(nóng)薩能奶山羊群體的DNA池為模版，利用引物Pl和P2在PCR條件下分別擴(kuò)增山羊PRLR內(nèi)含子2和外顯子10，以及利用引物P3和P4分別擴(kuò)增LHP基因5' UTR 和外顯子1，PCR擴(kuò)增條件及程序如下所示PCR擴(kuò)增的條件是12 U L反應(yīng)體系，包括0. 25U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司),6uL 2 X Buffer (內(nèi)含Mg2+、dNTPs等，北京天根科技有限公司Mix)，0. 4 y L的山羊基因組DNA樣品，IOpmol/ U L的各引物的上、下游引物各0. 4 ii L和滅菌超純水4. 7 yしPCR反應(yīng)程序如下(I)引物Pl的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，68°C退火30s， 72°C延伸30s，如此進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。(2)引物P2的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C退火30s， 72°C延伸30s，如此進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。(3)引物P3的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，57°C退火30s， 72°C延伸30s，如此進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。(4)引物P4的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s，如此進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。6、PCR產(chǎn)物純化和測序PCR擴(kuò)增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖I、圖2、圖3和圖4所示，可以清楚看到176bp、203bp、231bp和195bp的條帶，說明目的基因片段擴(kuò)增成功；然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入I. 5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作，具體步驟如下
1
(I)首先向吸附柱中加入500 u L平衡液BL，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中
的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(2)將單ー的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。(3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60°C水浴放置10分鐘左右，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。(4)將上ー步所得溶液加入一個吸附柱中，12000r/min離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。(5)向吸附柱中加入700 u L漂洗液，12000r/min離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱重
新放入收集管中。(6)向吸附柱中加入500 u L漂洗液，12000r/min離心Imin，倒掉廢液，將離心吸附柱放入收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50°C溫箱數(shù)分鐘，徹底晾干。(7)將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2min。12000r/min離心lmin收集DNA溶液。(8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步驟7。把以上以2個山羊群體DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序，對測序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點有兩個不同峰是發(fā)生了單核苷酸突變; PRLR基因內(nèi)含子2 (Pl)在114bp出存在C — T的突變，外顯子10 (P2) 319bp存在C — A的突變；LHP基因5' UTR(P3)在153bp處存在C —A的突變，外顯子1(P4)在64bp處存在 T-C的突變。B、利用引物Pl和P2擴(kuò)增得到的山羊PRLR內(nèi)含子2和外顯子10以及利用引物P3 和P4擴(kuò)增得到的LHP基因5' UTR和外顯子I的4個SNPs的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析利用引物Pl和P2分別對西農(nóng)薩能奶山羊265份基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得 265個包含山羊PRLR內(nèi)含子2和外顯子10的DNA片段；再利用引物P3和P4分別對西農(nóng)薩能奶山羊265份基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得265個包含山羊LHP基因5' UTR和外顯子I的DNA片段，然后利用如下方法對每個山羊的PRLR內(nèi)含子2和外顯子10以及LH3 基因5’ UTR和外顯子I進(jìn)行基因分型，具體方法如下取引物P1、P2、P3和P4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各5 u L，分別與5 u L的變性緩沖液(95% 的甲酰胺、0. 5mol/L的EDTA、0. 025 % ニ甲苯青FF和0. 025 %的溴酚藍(lán))混合，95 V變性 lOmin，然后迅速放入冰水混合物中作用lOmin，最后點樣于10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠溶液中，在4°C的條件下，280V電泳lOmin，之后210V衡壓條件下電泳4. 5h。電泳結(jié)束后， 加入0. I %的硝酸銀溶液中，于搖床上輕搖lOmin，然后用蒸餾水洗滌凝膠2次，加入顯色液 (5g的NaOH,0. Ig的Na2CO3，加入0. 5mL甲醛，定容至250mL)，于搖床上輕搖15min，然后用蒸餾水洗滌凝膠，拍照保存(圖5、圖6、圖7和圖8)。C、SNP位點的頻率統(tǒng)計分析基因型頻率是指ー個群體中某一性狀的某種基因型個體數(shù)占總個體數(shù)的比率。Paa =NAA/N，其中Paa代表某一位點的AA基因型頻率；Nm表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)； N為檢測群體的總數(shù)量(表I和表2)。
D、山羊PRLR基因和LHP基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析生產(chǎn)數(shù)據(jù)西農(nóng)薩能奶山羊第1、2、3和4胎的產(chǎn)羔數(shù)。關(guān)聯(lián)分析樣本有完整產(chǎn)羔性狀記錄的西農(nóng)薩能奶山羊265頭。關(guān)聯(lián)分析模型利用SPSS(13.0)軟件分析品種、年齡、場和基因位點等因素與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性。先對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小ニ乘分析對數(shù)據(jù)校正；根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用t分析、ANOVA或多元線性模型分析基因型效應(yīng)。在數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)影響產(chǎn)羔性狀的因素不同，考慮到場效應(yīng)(Farm)、品種效應(yīng) (Breed)、種公畜效應(yīng)(S)、種公畜內(nèi)母畜間效應(yīng)(SD)、年齡(Age)、基因型效應(yīng)(Genotype) 及相關(guān)的互作效應(yīng)，采用了以下固定模型進(jìn)行分析，同時，根據(jù)實際情況進(jìn)行取舎。完整模型如下Yijtapq = U+Farnii+Breedj+Sp+SDq+Agek+Genotypem+Xn+ewpq其中Jijkmnw :個體表型記錄；U :總體均值！Farmi 場別效應(yīng)！Breedj 品種效應(yīng)；SP :種公畜效應(yīng)；SDq :種公畜內(nèi)母畜間效應(yīng)；Agek :年齡效應(yīng)^enotypem :標(biāo)記基因型效應(yīng)；Xn為各種ニ級和ニ級以上互作效應(yīng)，如FarmXBreed, FarmXAge, FarmXGenotype, BreedXAge, BreedXGenotype, AgeXGenotype, BreedXAgeXGenogype 等 ^jkmnpq :隨機(jī)誤差；運用SPSS (13.0)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用最小二乗法擬合線性模型，對各基因型間產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗。分析結(jié)果如表I和表2所示表I :西農(nóng)薩能奶山羊PRLR基因Pl和P2不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析
權(quán)利要求
1.ー種良種奶山羊多基因聚合的選育方法，其特征在于，以連續(xù)產(chǎn)2羔及以上的奶山羊基因組DNA為模板，在PCR條件下，利用4對引物PI、P2、P3和P4，分別擴(kuò)增催乳素受體基因和促黃體素beta亞基基因,其中所述的引物Pl如下上游引物 IF :5' -TGTCAGTAAGCGTCAGAGGGC-3'；下游引物 IR : 5' -GGCTGGTGGAAGGTCACTCTT-3'；所述的引物P2如下上游引物 2F : 5' -CTTACCACAACATTGCTGACG-3'；下游引物 2R : 5' -GTTTAGCAGAGAACAAGGGGG-3'；所述的引物P3如下上游引物 3F : 5' -ACCAGATCTTGGCCCTTG-3'；下游引物 3R : 5' -CAAAGCCTGAGTCCAAC-3'；所述的引物P4如下上游引物 4F : 5' -CCTGAGGCACTGGCCTGTCC-3'；下游引物 4R : 5' -CACCATGCTGGGGCAGTAGCC-3'；引物Pl擴(kuò)增催乳素受體基因內(nèi)含子2，引物P2擴(kuò)增催乳素受體基因外顯子10，用于篩查山羊催乳素受體基因位點的突變；引物P3擴(kuò)增促黃體素beta亞基基因5'非翻譯區(qū)，引物P4擴(kuò)增促黃體素beta亞基基因外顯子1，用于篩查山羊促黃體素beta亞基基因位點的突變；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳對4對引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大小判定，然后采用DNA測序技術(shù)篩查到催乳素受體基因內(nèi)含子2和外顯子10，以及促黃體素beta亞基基因5'非翻譯區(qū)和外顯子I共有4個堿基的突變；再利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對這4個位點的SNPs進(jìn)行基因分型和基因頻率分析，分析高產(chǎn)奶山羊個體多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系及不同基因型組合與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系，井上溯親代，跟蹤子代，檢測母羊個體的基因型組合與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系，分析不同基因型在多胎性狀形成中的貢獻(xiàn)，挑選高產(chǎn)個體的基因型組合，分析高產(chǎn)個體基因型組合形成的選配方式，應(yīng)用這些選配方式形成奶山羊多羔的多基因聚合良種核心群。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增的條件是 1211し反應(yīng)體系包括0.25じTaq DNA聚合酶，6yL 2 XBuffer，0. 4 ii L的山羊基因組DNA樣品，IOpmol/u L的各引物的上、下游引物各0. 4 y L和滅菌超純水4. 7 u L ；PCR反應(yīng)程序如下1)利用引物PI的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，68 °C退火30s，72 °C 延伸30s，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；2)利用引物P2的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94 V變性30s，58 V退火30s，72 °C 延伸30s，如此進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；3)利用引物P3的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94 V變性30s，57 °C退火30s，72 °C 延伸30s，如此進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存；4)利用引物P4的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，94 V變性30s，60 V退火30s，72 °C 延伸30s，如此進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C充分延伸10min，4°C保存。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的催乳素受體基因內(nèi)含子2在114bp存在C — T的突變，外顯子10在319bp存在C — A的突變；所述的促黃體素beta亞基基因的 5'非翻譯區(qū)在153bp存在C — A的突變，外顯子I在64bp存在T — C的突變。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的基因分型是用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和分析引物PU P2、P3和P4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如下引物Pl位點純合型GG在114bp位的堿基是C，雜合型GH在114bp位的堿基是T\C， 純合型HH在114bp位的堿基是T ；引物P2位點純合型CC在319bp位的堿基是C，雜合型⑶在319bp位的堿基是C\A， 純合型DD在319bp位的堿基是A ；引物P3位點純合型QQ在153bp位的堿基是A，雜合型PQ在153bp位的堿基是C\A， 純合型PP在153bp位的堿基是CC ；引物P4位點純合型匪在64bp位的堿基是C，雜合型LM在64bp位的堿基是T\C，純合型LL在64bp位的堿基是T。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的高產(chǎn)個體的基因型組合為Fl 代和 F2 代GGCCPPLL ；Fl 代GGCCPQMM 和 GGCDPPLL ；FO 代GGCCQQLL0
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述的不同基因型在多胎性狀形成中的貢獻(xiàn)率為CC基因型的聚合效應(yīng)值比⑶基因型的高14. 12% ；匪基因型的聚合效應(yīng)值比LM基因型的高3. 8% ；PP基因型的聚合效應(yīng)值比QQ基因型的高15. 67% ；LL基因型的聚合效應(yīng)值比LM基因型的高11.48% ；PQ基因型的聚合效應(yīng)值比QQ基因型的高11.02%，⑶基因型的聚合效應(yīng)值比DD基因型的高10. 69%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種良種奶山羊多基因聚合的選育方法，以連續(xù)產(chǎn)2羔及以上的奶山羊基因組DNA為模板，利用4對引物分別擴(kuò)增催乳素受體基因內(nèi)含子2和外顯子10，以及促黃體素beta亞基基因5′非翻譯區(qū)(5′UTR)和外顯子1，以瓊脂糖凝膠電泳對各擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行大小判定，采用DNA測序技術(shù)篩查4對引物擴(kuò)增產(chǎn)物的位點突變，然后利用聚丙烯酰胺凝膠電泳對催乳素受體基因和促黃體素beta亞基基因的4個位點的SNPs進(jìn)行基因分型和基因頻率分析，分析高產(chǎn)奶山羊個體(F1代)多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系及不同基因型組合與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系，并上溯親代(F0代)，跟蹤子代(F2代)，檢測母羊個體的基因型組合與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系，分析不同基因型在多胎性狀形成中的貢獻(xiàn)。
文檔編號C12Q1/68GK102605064SQ20121006154
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者侯金星, 安小鵬, 宋宇軒, 崔易虹, 曹斌云, 朱廣琴, 李廣, 楊明明, 王建剛, 王韻斐, 陳秋菊 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)