山羊IGFBP3基因cDNA編碼序列克隆的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種山羊IGFBP3基因cDNA編碼序列克隆的方法，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，包括以下步驟：A1、提取山羊背最長(zhǎng)肌組織中的總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；A2、引物的設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增：以綿羊該基因的序列為模板在起始密碼子上游區(qū)域和終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)的引物為：正向引物：5'AGCTCGCTGCCGCCCAGT3'，反向引物：5'GCTGATCATGTCCTTGGCAG3'；A3、PCR產(chǎn)物的純化回收；A4、克隆。本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)捷的獲取山羊IGFBP3基因cDNA編碼序列的方法，為進(jìn)一步研究該基因在山羊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的作用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】山羊IGFBP3基因 cDNA編碼序列克隆的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地說(shuō)涉及一種從山羊肌肉組織中克隆 IGFBP3 (Insulin-like growth factor binding protein 3)基因 cDNA 編碼區(qū)序列的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（IGFBPs)作為胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)的一員，其與 胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs)之間是一個(gè)復(fù)雜的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)軸=IGFBPs與IGFs和酸敏感亞單元 (ALS)結(jié)合形成三元復(fù)合物來(lái)運(yùn)載IGFs，而且通過(guò)IGFBPs不同的親和力與IGFs結(jié)合以調(diào) 節(jié)游離IGFs的生物學(xué)活性，IGFBP-3是血液中濃度最高的胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白，同 時(shí)也是血清IGFs的主要載體，IGFBP-3主要和IGF- I結(jié)合，有助于維持IGF-I的生物利用 度，保證IGF-I的生物功效。因此IGFBP3基因在動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝過(guò)程中起著重要 的作用。
[0003] RT-PCR克隆：是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT)和CDNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及分子克隆相 結(jié)合的一種技術(shù)。首先利用反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增我們需要 的目的基因片段，然后將此片段與載體連接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆，獲得的質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。此技術(shù)利用PCR技術(shù)能在體外進(jìn)行有效的基因擴(kuò)增，而不需要內(nèi)切酶消化 和連接酶處理，能夠快速獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化法難于得到的PCR產(chǎn)物；同時(shí)該 方法能克服普通PCR產(chǎn)物測(cè)序引物近端的十幾個(gè)堿基無(wú)法測(cè)序獲得的缺點(diǎn)。與RACE (cDNA 末端快速擴(kuò)增）技術(shù)相比較而言，目的基因片段的長(zhǎng)度明確，成本較低，工作量小。該技術(shù) 的關(guān)鍵是PCR引物的設(shè)計(jì)，在起始密碼子的上游設(shè)計(jì)正向引物，在終止密碼子的下游設(shè)計(jì) 反向引物，使得PCR產(chǎn)物能包含完整的基因編碼區(qū)全序列。
[0004] 分段PCR克隆法：將目的基因分成幾個(gè)片段來(lái)分別克隆，然后再通過(guò)亞克隆測(cè)序 將其拼接起來(lái)，此方法成本較高，耗時(shí)多且工作量大，一個(gè)基因分成幾段就需要做幾次克 隆，然后再進(jìn)行序列拼接。
[0005] 獲得目的基因編碼區(qū)序列一般采用克隆或RACE技術(shù)，RACE技術(shù)是基于PCR技術(shù) 基礎(chǔ)上由已知的一段cDNA片段，通過(guò)向兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3'端和5'端。但該 技術(shù)與克隆技術(shù)相比，目的基因片段的長(zhǎng)度不明確，試驗(yàn)成本高，工作量大，對(duì)于提取的RNA 質(zhì)量要求較高，因此應(yīng)用相對(duì)較少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種山羊IGFBP3基因 cDNA編碼序列克隆的方法。填補(bǔ)在山羊上該基因研究的空白，為進(jìn)一步研究其在山羊上的 功能奠定基礎(chǔ)。
[0007] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 山羊IGFBP3基因 cDNA編碼序列克隆的方法，包括以下步驟： AU從山羊背最長(zhǎng)肌組織中提取總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ; A2 :以綿羊該基因的序列為模板在起始密碼子上游區(qū)域和終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì) 引物； A3 :以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； A4 :擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收和純化； A5 :純化的產(chǎn)物進(jìn)行克隆與測(cè)序，即能得到山羊IGFBP3基因 cDNA編碼序列。
[0008] 所述的方法，步驟Al包括以下步驟：取用液氮研磨好的組織粉末約80mg，加入預(yù) 先盛有ImL Trizol的EP管中，振蕩混勻后，室溫靜置5min ;加氯仿0. 2mL(必須按總體積 的1/5)，旋渦儀振蕩混勻15s，室溫靜置5min ;4°C下12000rpm離心15min ;轉(zhuǎn)移上層水相 45〇μ?于另一個(gè)新的I. 5mLEP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置IOmin ;4°C下 12000rpm離心IOmin ;棄去上層清液后，加入4°C預(yù)冷的75%乙醇(用DEPC處理水配制)lmL， 靜置5min，4°C下7500g離心5min ;棄上清，用槍吸取多余的液體，空氣干燥約3min ;加入 3〇μ? DEPC處理水，吹打混勻，充分溶解RNA，然后立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0009] 所述的方法，步驟A2中引物為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1是山羊IGFBP3基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。
[0011] 圖2是山羊IGFBP3基因編碼區(qū)的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0013] 具體實(shí)施步驟： 1、組織樣的采集 選取出生后120d的南江黃羊進(jìn)行宰殺，取其背最長(zhǎng)肌組織樣品后迅速置于液氮中保 存待用。
[0014] 2、總RNA的提取和cDNA的合成 (1) 取用液氮研磨好的組織粉末80mg，加入預(yù)先盛有ImL Trizol的EP管中，振蕩混勻 后，室溫靜直5min ; (2) 加氯仿0. 2mL(必須按總體積的1/5)，旋渦儀振蕩混勻15秒，室溫靜置5min ; (3) 4°C下 12000rpm 離心 15min ; (4) 轉(zhuǎn)移上層水相45〇μ?于另一個(gè)新的I. 5mLEP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后 室溫靜置IOmin ; (5) 4?下 12000rpm 離心 IOmin ; (6) 棄去上層清液后，加入4°C預(yù)冷的75%乙醇(用DEPC處理水配制）lmL，靜置5min， (7) 4°C下 7500g 離心 5min ; (8) 棄上清，用槍吸取多余的液體，空氣干燥約3min ;加入3〇μ? DEPC處理水，吹打混 勻，充分溶解RNA。
[0015] (9)用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)總RNA的質(zhì)量，效果好的立即反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0016] 3、目的基因片段的擴(kuò)增 (1) 引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的綿羊（6￥i5· aries )的IGFBP3 (NM_001134302)基因序列，采用Primer Premier 5. O軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)的引物為： 正向引物：5' AGCTCGCTGCCGCCCAGT 3' 反向引物：5' GCTGATCATGTCCTTGGCAG 3' (2) PCR的反應(yīng)體系和條件：反應(yīng)體系（25μυ :0.25 μ?的TaKaRa Taq酶，12. 5 μ?的 2XGC Buffer I，4 μ? 的 dNTP Mixture，正反向引物各 0.5 μ?，6.25 μ? 的滅菌 CldH2O，模板 cDNA 1 μ?。反應(yīng)條件為 95°C 預(yù)變性 4 min，35 個(gè)循環(huán)（94°C，45 s;53.4°C，30 s;72°C，90 s)，最后72°C 7 min ;PCR產(chǎn)物用I. 5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。
[0017] 4、PCR產(chǎn)物的回收和純化 PCR產(chǎn)物用上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化回收，具體步驟為： (1)通過(guò)1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，然后用干凈 的手術(shù)刀將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊切下，放入I. 5 mL離心管中。
[0018] (2)稱量凝膠的重量，根據(jù)膠塊的重量和濃度，按每IOOmg瓊脂糖加40〇μ?的比例 加入 Binding Buffer II。
[0019] (3)將離心管置于55 °C金屬恒溫浴中5~10 min，間或混勻，直至膠塊完全溶化。
[0020] (4)(可選步驟)當(dāng)目的片段<500bp時(shí)，加入所使用的Binding Buffer II 1/3體 積的異丙醇混勻。當(dāng)目的片段>500bp時(shí)，此步驟可以省略，直接進(jìn)行步驟（5)。
[0021] (5)將溶化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放在2ml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，室溫放置2 min。 8000 rpm室溫離心I min。
[0022] (6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，力口 入 500 KL Wash Solution，10000 rpm 室溫離心 I min。
[0023] (7)重復(fù)步驟（6) -次。
[0024] (8)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中， 12000 rpm 室溫離心 2 min。
[0025] (9)將UNIQ-10柱放入一新的I. 5 mL離心管中，在吸附膜中央加30 μ? Elution Buffer,室溫放置1?2 min。12000 rpm室溫離心I min,離心管中的液體即為回收的DNA片 段。
[0026] (10)取收集的DNA 2μ?，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)回收的DNA質(zhì)量。
[0027] 4、產(chǎn)物的克隆 (1)目的片段與載體連接 將膠回收產(chǎn)物與PMD19-T載體連接。將載體在冰上融化，短暫離心裝有載體的離心管， 以免液體掛在管壁上。在超凈操作臺(tái)上按照如下體系配置連接液：

【權(quán)利要求】
1. 山羊IGFBP3基因 cDNA編碼序列克隆的方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一：從山羊肌肉組織樣品中提取總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ; 步驟二：擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)：以綿羊該基因的序列為模板在起始密碼子上游 區(qū)域和終止密碼子的下游區(qū)域設(shè)計(jì)引物；設(shè)計(jì)的引物為： 正向引物：5' AGCTCGCTGCCGCCCAGT3' 反向引物：5' GCTGATCATGTCCTTGGCAG3' 用cDNA為模板先進(jìn)行梯度PCR反應(yīng)，退火溫度范圍選擇50°C到60°C共8個(gè)溫度點(diǎn)，優(yōu) 化普通PCR的條件。 2. PCR反應(yīng)體系為 25μ?體系：0.25 μ? 的 TaKaRa Taq酶，12.5 μ? 的 2XGC Bufferll， 4 μ? 的 dNTP Mixture，正反向引物各 0.5 μ?，6·25 μ? 的滅菌 ddH20，模板 cDNA 1 μ?。
3. 反應(yīng)條件為 95°C預(yù)變性 4 min，35 個(gè)循環(huán)（94°C，45 s;53.4°C，30 s;72°C，90 s)， 最后 72°C 7 min ; 步驟三：擴(kuò)增產(chǎn)物的回收和純化； 步驟四：純化的產(chǎn)物進(jìn)行克隆與測(cè)序，得到882bp的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO: 1所示，即為山羊IGFBP3基因的編碼區(qū)全序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104293766SQ201310294920
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月15日
【發(fā)明者】占思遠(yuǎn), 張紅平, 李利, 王林杰, 仲濤 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)