專利名稱：番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗，屬于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
番鴨細(xì)小病毒病(俗稱“三周病”)是1987年在我省首次發(fā)生的1-3周齡雛番鴨以喘瀉為臨床癥狀的一種新疫病。該病主要侵害7-21日齡的雛番鴨，發(fā)病率27-62%和病死率22-43%，病愈鴨大部分成為僵鴨，給番鴨業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。番鴨呼腸孤病毒病(俗 稱“肝白點(diǎn)病”、“花肝病”、“白點(diǎn)病”、“肝脾白點(diǎn)病”和“番鴨壞死性肝炎”等)是1997年以來，在福建省莆田、福清、福州、長樂和浙江金華、廣東佛山等地番鴨飼養(yǎng)區(qū)發(fā)生一種臨床上以軟腳為主要癥狀，以肝、脾表面有多量白點(diǎn)、腎臟腫大、出血、表面有黃色條斑為主要病理變化的傳染病。該病只發(fā)生于番鴨，發(fā)病日齡為7 45日齡，以10 30日齡的雛番鴨為最甚。發(fā)病率為30 90%，病死率為60 80%，發(fā)病未死鴨耐過后成為僵鴨，給番鴨業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失。目前，番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病仍是嚴(yán)重危害番鴨養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病，疫苗的免疫接種可有效控制這二種新發(fā)疫病，而多次免疫對(duì)番鴨群易造成不良的應(yīng)激反應(yīng)。為此，本發(fā)明在國內(nèi)外首次研制出番鴨呼腸孤病毒病和番鴨細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的a、來源于人工致弱的番鴨細(xì)小病毒弱毒Pl株(MPV-P1株)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,簡稱CCTCC),保藏單位CCTCC地址在中國武漢市武漢大學(xué)，保藏日2010年6月2日，保藏編號(hào)CCTCCN0 :V201013 ；b、來源于人工致弱的番鴨肝白點(diǎn)病(番鴨呼腸孤病毒病)弱毒MWCA株，該毒株保藏在在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日2001年12月18日，保藏編號(hào)CGMCC0667 ；將上述的番鴨肝白點(diǎn)病弱毒MWCA株和番鴨細(xì)小病毒弱毒Pl株應(yīng)用于制備番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以番鴨細(xì)小病毒弱毒Pl株(MPV-P1株)和番鴨肝白點(diǎn)病弱毒MWCA株(即番鴨呼腸孤病毒弱毒CA株)為種毒，分別應(yīng)用番鴨胚成纖維細(xì)胞和SPF雞胚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)增殖病毒，收獲細(xì)胞毒液，按適當(dāng)比例混合后加凍干保護(hù)劑冷凍干燥，研制成遺傳性穩(wěn)定、安全性好、免疫原性強(qiáng)且成本低的二聯(lián)活疫苗，在流行番鴨三周病和肝白點(diǎn)病的番鴨養(yǎng)殖地區(qū)應(yīng)用，能達(dá)到一次免疫接種即可同時(shí)預(yù)防和控制這二種疫病的目的，1-2日齡雛番鴨免疫一次即可有效預(yù)防番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病，不僅減少了人力物力，也減少因多次免疫注射對(duì)鴨群造成的不良應(yīng)激反應(yīng)；本發(fā)明適于GMP條件下的大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。(但不是對(duì)本發(fā)明的限制)。a、來源于人工致弱的番鴨細(xì)小病毒弱毒Pl株(MPV-P1株)，是利用番鴨胚和番鴨胚成纖維細(xì)胞交替?zhèn)鞔壬锛夹g(shù)人工選育致弱而成，已失去對(duì)一日齡雛番鴨的致病性，并具有如下特性(I)病毒效價(jià)=MPV-Pl株對(duì)番鴨胚成纖維單層細(xì)胞TCID5tl彡10_5°/0. Iml ；(2)安全性用I日齡健康易感雛番鴨10羽，每羽腿部肌肉注射毒種原液0.2毫升，觀察20天，應(yīng)全部存活；(3)免疫原性一日齡健康敏感雛番鴨，腿部肌肉注射O. 2毫升，其最小免疫量為100TCID5(i。MPV-Pl株保藏在CCTCC，保藏日2010年6月2日，保藏編號(hào)CCTCCV201013； b來源于人工致弱的番鴨肝白點(diǎn)病(番鴨呼腸孤病毒病)弱毒MWCA株，是利用番鴨胚成纖維細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞傳代誘變選育致弱而成，已失去對(duì)一日齡雛番鴨的致病性，并具有如下特性(I)病毒效價(jià)=MWCA株對(duì)雞胚成纖維單層細(xì)胞TCID5tl彡10_5°/0· Iml ；
(2)安全性用I日齡健康易感雛番鴨10羽，每羽腿部肌肉注射毒種原液O. 2毫升，觀察20天，應(yīng)全部存活；(3)免疫原性一日齡健康易感雛番鴨，腿肌注射O. 2毫升，其最小免疫量為300TCID5Q。該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，(現(xiàn)名中國普通微生物菌種保藏管理中心，China General Microbiological Culture CollectionCenter，簡稱CGMCC)，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院中國科學(xué)院微生物研究所，保藏H 2001年12月18日，保藏編號(hào)CGMCC0667。(見已授權(quán)中國專利號(hào)01144485. 1，授權(quán)公告號(hào)CN1179751C ;番鴨肝白點(diǎn)病(番鴨呼腸孤病毒病)弱毒MWCA株在該專利文獻(xiàn)中也稱CGMCCO667 毒株)；將上述的番鴨細(xì)小病毒弱毒Pl株和番鴨肝白點(diǎn)病(番鴨呼腸孤病毒病)弱毒MWCA株用于制備番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗。上述的番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗的具體制備方法如下(I)MPV-Pl株增殖，將MPV-Pl株種毒按培養(yǎng)液量的I %同步接種番鴨胚成纖維細(xì)胞(MDEF)，37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)75%以上，收獲MPV-Pl細(xì)胞毒。(2)MDRV-CA株增殖，將MDRV-CA株種毒接培養(yǎng)液量的I %同步接種SPF雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至細(xì)胞病變述75%以上，收獲MDRV-CA細(xì)胞毒。(3)病毒含量 TCID5tl 測(cè)定，MDRV-CA 和 MPV-Pl 的 TCID50 分別彡 1(Γ50/0· Iml 和彡10_4 5/0. Iml以上時(shí)，可用于配制疫苗。(5)疫苗配制，將MPV-Pl和MDRV-CA按適當(dāng)比例混合后加凍干保護(hù)劑冷凍干燥而成。使每羽份疫苗中各種成份的病毒含量分別達(dá)MDRVCA103·5TCID5tl和MPV-Pl 103°TCID5(I。本發(fā)明的疫苗應(yīng)用于防治番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病，其免疫學(xué)指標(biāo)測(cè)定如下I.無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進(jìn)行，無菌生長。2.安全性測(cè)定用I日齡健康易感雛番鴨10羽，每羽腿部肌肉注射10倍劑量三聯(lián)疫苗，觀察20天，接種鴨均未見飲食欲和精神異常，且生長發(fā)育良好，全部存活。
3.免疫力測(cè)定隨機(jī)取一日齡易感雛番鴨20羽，腿肌接種I羽份二聯(lián)活疫苗，其中10羽免疫鴨于接種O天、7天、14天、21天、28天、60天、90天、150天、180天連同不免疫對(duì)照鴨采血分離血清，供抗MPV-LPAI抗體效價(jià)測(cè)定；另10羽免疫鴨于接種后7天連同不免疫對(duì)照組同時(shí)攻擊MDRV強(qiáng)毒，觀察20天，記錄發(fā)病死亡情況。結(jié)果①一日齡雛番鴨二聯(lián)苗免疫后5天產(chǎn)生抗體，免疫后7天血清中的抗MPV-LPAI抗體均為22_1以上，能有效抵抗MPV強(qiáng)毒攻擊，至免疫后28天達(dá)到高峰的抗體水平分別為26_°，隨后抗體水平仍雛持在較高水平，并一直持續(xù)至免疫后180天，此時(shí)已超過番鴨出欄日齡。②一日齡雛番鴨二聯(lián)苗免疫后7天連同不免疫對(duì)照組同時(shí)攻擊MDRV強(qiáng)毒O. 2ml/羽，對(duì)照攻毒鴨的發(fā)病率80% (8/10)、死亡率30% (3/10);而免疫攻毒鴨的發(fā)病率10% (1/10)、死亡率0%;表明一日齡雛番鴨免疫二聯(lián)疫苗后7天能有效抵抗MDRV強(qiáng)毒的攻擊。③二聯(lián)疫苗的免疫力測(cè)定結(jié)果表明，疫苗免疫力良好，免疫產(chǎn)生期7天，免疫持續(xù)期為180天以上。一次免疫即可保護(hù)雛番鴨安全渡過易感期，達(dá)到I次免疫注射可同時(shí)預(yù)防番鴨細(xì)小病毒病(番鴨三周病)和番鴨呼腸孤病毒病(番鴨肝白點(diǎn)病)，不僅減少人力物力財(cái)力，也減少因多次免疫注射導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)。本發(fā)明的應(yīng)用效果評(píng)價(jià)在曾流行番鴨三周病和番鴨肝白點(diǎn)病的試驗(yàn)鴨場(chǎng)共免疫 注射6500多羽份一日齡雛番鴨，跟蹤觀察20d，未見免疫鴨出現(xiàn)不良反應(yīng)；且免疫組番鴨未發(fā)生番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病，成活率達(dá)97. 5%以上；而650羽的對(duì)照組番鴨均不同程度發(fā)生番鴨肝白點(diǎn)病和三周病，成活率僅73%。進(jìn)一步證明本發(fā)明的二聯(lián)活疫苗安全、有效，可用于臨床上預(yù)防番鴨呼腸孤病毒病(番鴨肝白點(diǎn)病)和番鴨細(xì)小病毒病(番鴨三周病)。
權(quán)利要求
1.番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗，其特征在于，所述的番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗是采用 a、來源于人工致弱的番鴨細(xì)小病毒弱毒Pl株，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日2010年6月2日，保藏編號(hào)CCTCCNO V201013 ； b、來源于人工致弱的番鴨肝白點(diǎn)病弱毒MWCA株，該毒株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日2001年12月18日，保藏編號(hào)CGMCC0667 ； 將上述的番鴨細(xì)小病毒弱毒Pl株和番鴨肝白點(diǎn)病弱毒MWCA株用于制備番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗，其特征在于，所述的番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)活疫苗制備方法如下
a.MPV-Pl株增殖，將MPV-Pl株種毒按培養(yǎng)液量的I %同步接種番鴨胚成纖維細(xì)胞，37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)75%以上，收獲MPV-Pl細(xì)胞毒； b MDRV-CA株增殖，將MDRV-CA株種毒按培養(yǎng)液量的I %同步接種SPF雞胚成纖維細(xì)胞，37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)75%以上，收獲MDRV-CA細(xì)胞毒； c、病毒含量TCID50 測(cè)定，MPV-Pl 和 MDRV-CA 的 TCID50 分別彡 1(Γ4 5/0· Iml 和彡ΙΟ-5.0/?！?Iml以上時(shí)，用于配制疫苗； e.疫苗配制，將MPV-Pl和MDRV-CA按適當(dāng)比例混合后加凍干保護(hù)劑冷凍干燥而成，使每羽份疫苗中各種成份的病毒含量分別達(dá)MDRV CA IO3-5TCID50和MPV-Pl 103_°TCID5(I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的番鴨呼腸孤病毒病和番鴨細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗在防治番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了番鴨細(xì)小病毒病和番鴨呼腸孤病毒病二聯(lián)疫苗的制備及應(yīng)用，該二聯(lián)疫苗以番鴨細(xì)小病毒弱毒P1株(保藏編號(hào)CCTCC V201013)和番鴨肝白點(diǎn)病(番鴨呼腸孤病毒病)弱毒MWCA株(保藏編號(hào)CGMCC 0667)為種毒，分別應(yīng)用番鴨胚成纖維細(xì)胞和SPF雞胚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)增殖病毒，收獲細(xì)胞毒液，按適當(dāng)比例混合后加凍干保護(hù)劑冷凍干燥，制成二聯(lián)活疫苗，在流行番鴨三周病和肝白點(diǎn)病的番鴨養(yǎng)殖地區(qū)應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/295GK102847147SQ201210046139
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者陳少鶯, 程曉霞, 林鋒強(qiáng), 陳仕龍, 胡奇林, 林天龍, 程由銓 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所