一種鴨細(xì)小病毒毒株及其活疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及動(dòng)物病毒學(xué)領(lǐng)域，提供了一種鴨細(xì)小病毒毒株及其活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴨細(xì)小病毒是細(xì)小病毒的一種，主要侵害1~3周齡的維鴨，臨床W腹瀉、呼吸困 難和腳軟為主要癥狀，一年四季均有發(fā)生，給鴨飼養(yǎng)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失，是鴨飼養(yǎng)中主要 的疾病之一，發(fā)病率和死亡率也較高。
[0003] 2015年3月W來，我國山東、江蘇和安徽等地肉鴨群出現(xiàn)了一種疾病，經(jīng)驗(yàn)證為鴨 細(xì)小病毒，該病W鴨瞭發(fā)育不良，舌頭外伸為特征，本病主要發(fā)生在14日齡W上的商品鴨， 鴨群發(fā)病率為10% -20%，最高可達(dá)50%，大群感染率最高可達(dá)100%，但該病不造成患鴨 死亡。患鴨發(fā)育遲緩，體溫略升高，瞭短，彈性降低，舌腫脹，外伸，感染后期患鴨腔骨和翅骨 易發(fā)生骨折。該病主要導(dǎo)致鴨群料肉比上升，養(yǎng)殖成本升高，鴨出欄合格率降低。對(duì)肉鴨養(yǎng) 殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 國內(nèi)外對(duì)水禽細(xì)小病毒的防控主要采用滅活疫苗和弱毒活疫苗。研究證實(shí)，該病 毒與碟細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒抗體中和效價(jià)較低，不能采用上述兩種病毒的疫苗進(jìn)行該 病的防控。因此，提供一種針對(duì)性的疫苗來防治該病成為亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述情況，本發(fā)明的發(fā)明人提供了一種鴨細(xì)小病毒毒株及其活疫苗和制備方 法，該毒株為鴨細(xì)小病毒，具體命名為GT2015V株，其生物保藏編號(hào)為CCTCCNo:V201528 ; 利用該毒株制備的疫苗有效解決了我國當(dāng)前該病無法預(yù)防的現(xiàn)狀，通過鴨胚連續(xù)傳代連續(xù) 傳代對(duì)中等毒力分離株進(jìn)行致弱，使其失去對(duì)鴨的致病性，并保持良好的免疫原性，能夠安 全、有效地預(yù)防和控制鴨細(xì)小病毒感染，降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，保障養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。
[0006] 發(fā)明人首先對(duì)患病病鴨體內(nèi)的病毒進(jìn)行了分離和鑒定，最終確定上述疾病為鴨 細(xì)小病毒值UCkParvovirusDPV)感染引起的一種鴨細(xì)小病毒病。進(jìn)而發(fā)明人獲得了一 株新鴨細(xì)小病毒毒株，通過毒種的分離培養(yǎng)、碟胚中和試驗(yàn)、病毒的PCR檢測(cè)及病毒的測(cè)序 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，確定該毒株為一株新的鴨細(xì)小病毒，命名為鴨細(xì)小病毒GT2015株，發(fā)明人對(duì)該 毒株進(jìn)行了生物保藏，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，生物保藏編號(hào)為CCTCCNo: V201527,發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該毒株為中等毒力分離株，無法直接作為活疫苗使用，因此發(fā)明人將 該毒株經(jīng)鴨胚克隆純化傳代40代次，獲得了的一株新的弱毒疫苗株，命名為GT2015V，并 對(duì)該弱毒疫苗株進(jìn)行了生物保藏，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，生物保藏編號(hào)為 CCTCCNo:V201528。
[0007] 在分離獲得上述GT2015V弱毒株的基礎(chǔ)上，發(fā)明人進(jìn)一步獲得了該弱毒株的活疫 苗，同時(shí)提供了該活疫苗的制備方法，具體步驟如下：
[0008] 將鴨細(xì)小病毒致弱毒GT2015V株接種9日齡鴨胚，37°C解化5日，收獲病毒尿囊 液，加入凍干保護(hù)劑，經(jīng)真空冷凍干燥，制備成鴨細(xì)小病毒活疫苗。
[0009] 上述活疫苗株的制備采用了常規(guī)的凍干制備方法，具體步驟發(fā)明人在此不再寶 述。
[0010] 獲得活疫苗之后即可通過各種手段檢驗(yàn)疫苗的效果，結(jié)果如下：
[0011] 免疫保護(hù)力檢驗(yàn)
[0012] 給鴨接種有效劑量的疫苗，能使接種的鴨獲得對(duì)鴨細(xì)小病毒中等毒力株有效的免 疫力。 陽〇1引安全性檢驗(yàn)
[0014] 給鴨接種不同劑量的疫苗，接種鴨不表現(xiàn)出臨床癥狀和較強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)。
[0015] 穩(wěn)定性檢驗(yàn)
[0016] 將制備的弱毒株在鴨體內(nèi)連續(xù)傳代，不出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象。
[0017] 無菌檢驗(yàn)
[001引將收獲的尿囊液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，無菌落出現(xiàn)。
[0019] 可見本發(fā)明獲得的鴨細(xì)小病毒弱毒GT2015V株具有良好的免疫原性和安全性，審U 備的鴨細(xì)小病毒弱毒活疫苗能夠安全、有效地預(yù)防和控制鴨細(xì)小病毒感染，降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)， 保障養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。
[0020] 發(fā)明人對(duì)本發(fā)明所公開的鴨細(xì)小病毒GT2015和GT2015V進(jìn)行了生物保藏，保藏單 位為中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，具體保藏信息如下：
[0021] 保藏信息
[0022] 保藏時(shí)間：2015年8月28日
[0023] 保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、CCTCC
[0024]保藏編號(hào)：CCTCCNO:V201527
[0025] 保藏單位地址：中國武漢大學(xué) 陽0%] 分類命名：鴨細(xì)小病毒GT2015
[0027] 保藏時(shí)間：2015年8月28日
[0028] 保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、CCTCC
[0029] 保藏編號(hào)：CCTCCNO:V201528
[0030] 保藏單位地址：中國武漢大學(xué)
[0031] 分類命名：鴨細(xì)小病毒GT2015V。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例1GT2015病毒的分離和鑒定
[0033] 2015年4月，對(duì)采集自山東高唐地區(qū)的患鴨，臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩，上下瞭萎縮 等，取肝臟經(jīng)研磨、凍融、過濾除菌后，接種于9日齡鴨胚，進(jìn)行病毒分離，并對(duì)分離株進(jìn)行 PCR、EID50毒價(jià)測(cè)定、動(dòng)物回歸試驗(yàn)等鑒定。結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增得到目的片段；病毒毒力 為10& 7EID50/0. 2mL;動(dòng)物感染試驗(yàn)的接種鴨出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和病理變化，與臨床發(fā)病 鴨一致。由此確定分離株為鴨細(xì)小病毒，命名為GT2015株，發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行生物保藏，保藏 編號(hào)CCTCCNo:V201527。
[0034] 實(shí)施例2GT2015V病毒的獲得及其生物學(xué)特性的鑒定
[0035]GT2015V病毒的獲得
[0036] 將鴨細(xì)小病毒GT2015株接種9日齡鴨胚連續(xù)傳代40代，克隆純化得到弱毒株，命 名為GT2015V株。測(cè)得病毒毒力效價(jià)為106'6EID50/0. 2mL。說明該弱毒株在鴨胚中具有良 好的繁殖能力。發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行了生物保藏，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，生物保 藏編號(hào)為CCTCCNo:V201528。
[0037] 鴨細(xì)小病毒GT2015V的生物學(xué)特性
[0038] 1安全性試驗(yàn)：1日齡維鴨100只平均分為5組，分別肌肉接種10巧ID50的F10、 F20、F30和F40代毒株，并設(shè)定空白對(duì)照組。觀察癥狀并稱重，連續(xù)25天。每隔五天每組 隨機(jī)剖殺兩只，觀察剖檢變化并制作病理切片，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)，評(píng)價(jià)其安全性。結(jié)果 顯示，F(xiàn)lO代組仍出現(xiàn)2羽短瞭長舌綜合征維鴨；F20代組出現(xiàn)輕微的組織學(xué)變化；F30代和 F40代組均未出現(xiàn)任何臨床癥狀和顯微組織病變。
[0039] 表1不同代次毒株接種維鴨安全性試驗(yàn)
[0040]
[0042] 2穩(wěn)定性試驗(yàn)：將鴨細(xì)小病毒GT2015V株連續(xù)在維鴨體內(nèi)傳5代，肝臟研磨后過濾 除菌，按照0. 2mL/羽接種1日齡維鴨，第十二日齡剖殺后觀察，各代次接種鴨均未見發(fā)病， 說明毒力未返強(qiáng)。
[0043] 表2GT2015V株穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0044]
[0045] 3免疫原性試驗(yàn)：將鴨細(xì)小病毒GT2015V株接種9日齡鴨胚，5日后收集病毒尿囊 液，加入常規(guī)凍干保護(hù)劑（《中國獸藥典》）與病毒液的體積比按照1 :1混合，分裝后經(jīng)真空 冷凍干燥制備凍干疫苗。將該用滅菌生理鹽水稀釋至0.ImL含1羽份，經(jīng)肌肉注射1日齡維 鴨20羽，同時(shí)設(shè)定10羽為對(duì)照組。7天后用親本毒株中等毒力GT2015株（約106'2EID50) 攻擊10羽免疫組鴨和10羽對(duì)照組鴨，攻毒后每天觀察臨床癥狀（瞭），免疫組、免疫攻毒組 和對(duì)照組每天均稱量體重，=個(gè)分組于3、6、9、12、15天采集血清樣本檢測(cè)中和抗體效價(jià)， 20天后剖殺所有鴨，觀察胸腺、肝臟病變。結(jié)果顯示，免疫組均未出現(xiàn)短瞭長舌癥狀，攻毒組 中2羽出現(xiàn)短瞭長舌癥狀。在體重增加方面，免疫組與免疫攻毒組無明顯差異，均明顯高于 攻毒組。未攻毒組中和抗體效價(jià)呈不斷上升至較高水平，免疫攻毒組中和抗體在攻毒后上 升趨勢(shì)略低于未攻毒組。
[0046] 實(shí)施例3疫苗成品制備
[0047] 將鴨細(xì)小病毒致弱毒GT2015V株接種9日齡鴨胚，37°C解化5日，收獲病毒尿囊 液，加入凍干保護(hù)劑，經(jīng)真空冷凍干燥，制備成鴨細(xì)小病毒活疫苗。
[0048] 本發(fā)明所提供的鴨細(xì)小病毒活疫苗的制備方法，是將鴨細(xì)小病毒致弱毒GT2015V 株接種鴨胚，收獲病毒培養(yǎng)物，加入穩(wěn)定保護(hù)劑，經(jīng)真空干燥而制成。
[0049] 疫苗毒株的增殖：病毒增殖選用發(fā)育良好的9日齡健康鴨胚，鴨細(xì)小病毒致弱毒 GT2015V株病毒液按照0. 2血/胚接種，37°C培養(yǎng)5天，收集病毒尿囊液，-20°C保存。
[0050] 半成品的檢驗(yàn)：
[0051] 無菌檢驗(yàn)：取各組樣品，按《中國獸藥典》二O-O年版=部進(jìn)行，為無菌生長。
[0052] 病毒含量測(cè)定海病毒含量> 10巧ID50。
[0053] 表3疫苗株接種鴨胚EID50測(cè)定
[0054]
陽化5] 配苗與凍干：將檢驗(yàn)合格的鴨細(xì)小病毒液與5%薦糖脫脂乳混合按配苗羽份要求 的比例量混合，分裝后進(jìn)行冷凍真空干燥，共凍干3批。
[0056] 實(shí)施例4疫苗成品檢驗(yàn)
[0057] 1. 3批凍干疫苗均呈淡黃色海綿狀固體，震蕩后易與瓶壁分離，加入稀釋液后迅速 溶解。
[0058] 2.按《中國獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，3批疫苗均無菌生長。
[0059] 3.按《中國獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行支原體檢驗(yàn)，3批疫苗均無支原體生長。
[0060] 4.按《中國獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)，3批疫苗均無外源病毒污染。
[0061] 5.安全性檢驗(yàn)：將疫苗稀釋0. 1血/羽份，肌肉接種10羽1日齡易感維鴨，觀察15 日。接種鴨均健康存活，未見全身和局部反應(yīng)，剖殺后觀察并制備病理切片，無微觀病理組 織學(xué)變化。
[0062] 6.免疫效力檢驗(yàn)：
[0063] (1)疫苗病毒含量檢驗(yàn)：將病毒按照0. 2mL含1羽份稀釋，作10倍系列稀釋后，取 10 4、10嘴10 6濃度病毒液分別接種5枚9日齡鴨胚，并設(shè)定對(duì)照。接種后5天，采用PCR檢 測(cè)結(jié)果，根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算EID50,進(jìn)行立次檢驗(yàn)，結(jié)果如表4所示，3次檢驗(yàn)的病 毒含量相似，說明用于制備疫苗的病毒株具有穩(wěn)定性，含毒量較高，適合于滅活疫苗生產(chǎn)。 W64] 似1日齡維鴨按照0.5、1、1.5和2羽份劑量免疫，每組20羽，7日后肌肉注射 IO6EIDSO鴨細(xì)小病毒中等毒力GT2015株，并設(shè)定不免疫組作對(duì)照，同時(shí)設(shè)定不免疫不攻毒 組為空白組，觀察20天，每天稱重。免疫組與空白組體重?zé)o明顯差異，均未出現(xiàn)短瞭長舌癥 狀。不免疫對(duì)照組體重顯著低于其他兩組，并且出現(xiàn)7羽短瞭長舌癥狀患鴨。結(jié)果如表5 顯示，疫苗能夠100%保護(hù)維鴨。 W65] 表4鴨細(xì)小病毒活疫苗EID50的測(cè)定
[0066]
[0067] 表5最低使用劑量的安全性和免疫效力檢測(cè)
[0068]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鴨細(xì)小病毒毒株，命名為鴨細(xì)小病毒GT2015v株，其保藏編號(hào)為：CCTCC No : V201528。2. -種鴨細(xì)小病毒活疫苗，其特征在于，所采用的毒株為鴨細(xì)小病毒GT2015V株，其保 藏編號(hào)為：CCTCC No :V201528。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨細(xì)小病毒活疫苗，其特征在于，所述的疫苗為凍干疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明涉及動(dòng)物病毒學(xué)領(lǐng)域，提供了一種鴨細(xì)小病毒毒株及其活疫苗和制備方法，該毒株為鴨細(xì)小病毒，具體命名為GT2015v株，其生物保藏編號(hào)為CCTCC？No：V201528；利用該毒株制備的疫苗有效解決了我國當(dāng)前該病無法預(yù)防的現(xiàn)狀，通過鴨胚連續(xù)傳代對(duì)中等毒力分離株進(jìn)行致弱，使其失去對(duì)鴨的致病性，并保持良好的免疫原性，能夠安全、有效地預(yù)防和控制鴨細(xì)小病毒感染，降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，保障養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。CCTCC NO： V20152720150828
【IPC分類】C12R1/93, C12N7/00, A61P31/20, A61K39/23
【公開號(hào)】CN105154410
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510606547
【發(fā)明人】刁有祥, 陳浩, 于相龍, 竇硯國, 鄭肖強(qiáng), 牛曉宇, 楊晶
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月21日