減毒沙門菌vnp20009在基因表達(dá)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種減毒沙門菌VNP20009在基因表達(dá)中的應(yīng)用，具體涉及一種以減毒沙門菌VNP20009為載體來傳遞效應(yīng)基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門菌是一種侵襲性胞內(nèi)菌，它與宿主之間的反應(yīng)通過III型分泌機(jī)制介導(dǎo)，這種機(jī)制使細(xì)菌的效應(yīng)蛋白能直接轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞發(fā)揮作用，使其可以傳遞表達(dá)效應(yīng)基因并同時(shí)表達(dá)多種治療性蛋白。巨噬細(xì)胞是沙門菌的天然靶點(diǎn)，不僅在局部形成沙門菌的細(xì)胞靶點(diǎn)，而且建立細(xì)胞儲存庫使細(xì)菌系統(tǒng)性擴(kuò)散。沙門菌侵入淋巴系統(tǒng)，通過血液循環(huán)定居在脾臟和肝臟等器官。
[0003]VNP20009是一種將野生型鼠沙門菌通過基因修飾構(gòu)建的基因工程沙門菌，部分刪除了編碼脂質(zhì)體A的末端序列msbB(明顯減低誘導(dǎo)血液中單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的能力)，并敲除purl基因(由于pur系列基因編碼嘌呤合成途徑中的一系列酶，purl基因缺失將影響嘌呤合成，進(jìn)而影響DNA的合成從而使細(xì)菌毒性降低)，兩種突變使細(xì)菌毒力降低10000倍，同時(shí)沒有影響沙門菌的腫瘤正常組織比(>1000:1)，并保持了它們在原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)生長能力。
[0004]目前蛋白表達(dá)主要采用原核表達(dá)和真核表達(dá)系統(tǒng)，但有些蛋白卻不易表達(dá)，本研宄采用以減毒沙門菌VNP20009為載體，自行構(gòu)建表達(dá)減毒沙門體系來有效地傳遞多種效應(yīng)基因，避免了蛋白不易表達(dá)和主要表達(dá)在包涵體的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種種減毒沙門菌VNP20009在基因表達(dá)中的應(yīng)用，具體為以減毒沙門菌VNP20009為載體來傳遞效應(yīng)基因的方法。
[0006]本發(fā)明所述應(yīng)用包括下列步驟:
1、沙門氏菌感受態(tài)制備:挑取沙門氏菌VNP20009單菌落接種至3mL無抗性LB培養(yǎng)中，37° C 200 rpm搖床培養(yǎng)過夜(約16 h)，次日將400 uL活化菌液加到40 mL無抗性LB液體培養(yǎng)基中，37° C 200 rpm搖床培養(yǎng)100 min至OD 600到達(dá)0.4左右將培養(yǎng)物冰上放置0.5 h，同時(shí)離心機(jī)預(yù)冷，5000 rpm離心5 min棄上清，沉淀用10%甘油10 mL懸浮細(xì)胞，冰上放置10 min重復(fù)離心，上述步驟再重復(fù)一次，最后一次離心的沉淀用400 uL 10%甘油重新懸浮細(xì)胞，感受態(tài)置冰上備用；
2、疫苗菌株構(gòu)建:用電轉(zhuǎn)化法將C20重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入感受態(tài)沙門氏菌VNP20009中，電轉(zhuǎn)化條件:電壓2.5kv、電容25 u F、電阻200 Q ；
3、細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn):！1印62.2.15細(xì)胞以1父1O5細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，用無抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，重組質(zhì)粒細(xì)菌接種于I 00 ng / mL Amp抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C恒溫?fù)u床200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，至對數(shù)生氏晚期(0D600>3)，PBS清洗后用含有10% FBS的無抗性1640細(xì)胞培養(yǎng)基重懸；5X 10 7菌落形成單位的重組疫苗細(xì)菌加入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)感染HepG2.2.15細(xì)胞，并且以空載體細(xì)菌作為對照，細(xì)菌與細(xì)胞共孵育3 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清，并用PBS清洗三遍，添加雙抗(100 U / mL氨芐青霉素和100 U / mL硫酸鏈霉素)去除沒有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，培養(yǎng)1-2天后，檢測細(xì)胞分泌乙肝表面抗原的量。
[0007]4、Elisa法檢測乙型肝炎病毒表面抗原:
(I)加樣:根據(jù)檢驗(yàn)要求，將選擇的預(yù)包被板條固定于板架，加入25ul樣品稀釋于板架，加入25ul樣品稀釋液于反應(yīng)孔中。每次檢驗(yàn)設(shè)陰性對照3孔、陽性對照2孔，加陰性、陽性對照各75ul ;設(shè)空白對照I孔，不加樣品，其余孔加入待測樣品75ul，振蕩混勻。
[0008](2)溫育:置37 ± 1° C溫浴60分鐘。
[0009](3)加酶:空白對照孔不加酶標(biāo)記物，其余孔加入酶標(biāo)記物50ul，振蕩混勻。
[0010](4)溫育:置37±1° C溫育30分鐘
(5)洗滌:棄去孔內(nèi)液體，將稀釋后的洗液注滿各孔，靜置30-60秒，棄去孔內(nèi)洗液。重復(fù)洗6次后拍干。
[0011](6)顯色:每孔加入底物緩沖液50ul，再加入底物液50ul，振蕩混勻，置37±1° C溫育30分鐘。
[0012](7)終止:每孔加入終止液50ul，輕拍混勻。
[0013](8)讀值:用酶標(biāo)儀讀值，在單波長450nm (須以空白對照孔校零)或雙波長450nm/620nm-700nm 下讀取各孔 A 值。
[0014]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明以減毒沙門菌VNP20009為載體來傳遞效應(yīng)基因，既可攜帶原核表達(dá)質(zhì)粒也可攜帶真核表達(dá)質(zhì)粒，簡單方便，快速高效，適用于一些不易表達(dá)或主要表達(dá)在包涵體的蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明所述應(yīng)用包括下列步驟:
1、沙門氏菌感受態(tài)制備:挑取沙門氏菌VNP20009單菌落接種至3mL無抗性LB培養(yǎng)中，37° C 200 rpm搖床培養(yǎng)過夜(約16 h)，次日將400 uL活化菌液加到40 mL無抗性LB液體培養(yǎng)基中，37° C 200 rpm搖床培養(yǎng)100 min至OD 600到達(dá)0.4左右將培養(yǎng)物冰上放置0.5 h，同時(shí)離心機(jī)預(yù)冷，5000 rpm離心5 min棄上清，沉淀用10%甘油10 mL懸浮細(xì)胞，冰上放置10 min重復(fù)離心，上述步驟再重復(fù)一次，最后一次離心的沉淀用400 uL 10%甘油重新懸浮細(xì)胞，感受態(tài)置冰上備用；
2、疫苗菌株構(gòu)建:用電轉(zhuǎn)化法將C20重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入感受態(tài)沙門氏菌VNP20009中，電轉(zhuǎn)化條件:電壓2.5kv、電容25 u F、電阻200 Q ；
3、細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn):！1印62.2.15細(xì)胞以1父1O5細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，用無抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，重組質(zhì)粒細(xì)菌接種于I 00 ng / mL Amp抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C恒溫?fù)u床200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，至對數(shù)生氏晚期(0D600>3)，PBS清洗后用含有10% FBS的無抗性1640細(xì)胞培養(yǎng)基重懸；5X 10 7菌落形成單位的重組疫苗細(xì)菌加入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)感染HepG2.2.15細(xì)胞，并且以空載體細(xì)菌作為對照，細(xì)菌與細(xì)胞共孵育3 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清，并用PBS清洗三遍，添加雙抗(100 U / mL氨芐青霉素和100 U / mL硫酸鏈霉素)去除沒有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，培養(yǎng)1-2天后，檢測細(xì)胞分泌乙肝表面抗原的量。
[0016]4、Elisa法檢測乙型肝炎病毒表面抗原: (I)加樣:根據(jù)檢驗(yàn)要求，將選擇的預(yù)包被板條固定于板架，加入25ul樣品稀釋于板架，加入25ul樣品稀釋液于反應(yīng)孔中。每次檢驗(yàn)設(shè)陰性對照3孔、陽性對照2孔，加陰性、陽性對照各75ul ;設(shè)空白對照I孔，不加樣品，其余孔加入待測樣品75ul，振蕩混勻。
[0017](2)溫育:置37 ± 1° C溫浴60分鐘。
[0018](3)加酶:空白對照孔不加酶標(biāo)記物，其余孔加入酶標(biāo)記物50ul，振蕩混勻。
[0019](4)溫育:置37±1° C溫育30分鐘
(5)洗滌:棄去孔內(nèi)液體，將稀釋后的洗液注滿各孔，靜置30-60秒，棄去孔內(nèi)洗液。重復(fù)洗6次后拍干。
[0020](6)顯色:每孔加入底物緩沖液50ul，再加入底物液50ul，振蕩混勻，置37±1° C溫育30分鐘。
[0021 ] (7)終止:每孔加入終止液50ul，輕拍混勻。
[0022](8)讀值:用酶標(biāo)儀讀值，在單波長450nm (須以空白對照孔校零)或雙波長450nm/620nm-700nm 下讀取各孔 A 值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種減毒沙門菌VNP20009在基因表達(dá)中的應(yīng)用，其特征是: A、沙門氏菌感受態(tài)制備:挑取沙門氏菌VNP20009單菌落接種至3mL無抗性LB培養(yǎng)中，37° C 200 rpm搖床培養(yǎng)過夜(約16 h)，次日將400 uL活化菌液加到40 mL無抗性LB液體培養(yǎng)基中，37° C 200 rpm搖床培養(yǎng)100 min至OD 600到達(dá)0.4左右將培養(yǎng)物冰上放置0.5 h，同時(shí)離心機(jī)預(yù)冷，5000 rpm離心5 min棄上清，沉淀用10%甘油10 mL懸浮細(xì)胞，冰上放置10 min重復(fù)離心，上述步驟再重復(fù)一次，最后一次離心的沉淀用400 uL 10%甘油重新懸浮細(xì)胞，感受態(tài)置冰上備用； B、疫苗菌株構(gòu)建:用電轉(zhuǎn)化法將C20重組質(zhì)粒分別導(dǎo)入感受態(tài)沙門氏菌VNP20009中，電轉(zhuǎn)化條件:電壓2.5kv、電容25 u F、電阻200 Q ； C、細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn):！1印62.2.15細(xì)胞以1父1O5細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，用無抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，重組質(zhì)粒細(xì)菌接種于I 00 ng / mL Amp抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C恒溫?fù)u床200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜，至對數(shù)生氏晚期(0D600>3)，PBS清洗后用含有10% FBS的無抗性1640細(xì)胞培養(yǎng)基重懸；5X 10 7菌落形成單位的重組疫苗細(xì)菌加入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)感染HepG2.2.15細(xì)胞，并且以空載體細(xì)菌作為對照，細(xì)菌與細(xì)胞共孵育3 h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清，并用PBS清洗三遍，添加雙抗(100 U / mL氨芐青霉素和100 U / mL硫酸鏈霉素)去除沒有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，培養(yǎng)1-2天后，檢測細(xì)胞分泌乙肝表面抗原的量； D、Elisa法檢測乙型肝炎病毒表面抗原: (1)加樣:根據(jù)檢驗(yàn)要求，將選擇的預(yù)包被板條固定于板架，加入25ul樣品稀釋于板架，加入25ul樣品稀釋液于反應(yīng)孔中； 每次檢驗(yàn)設(shè)陰性對照3孔、陽性對照2孔，加陰性、陽性對照各75ul ;設(shè)空白對照I孔，不加樣品，其余孔加入待測樣品75ul，振蕩混勻； (2)溫育:置37± 1° C溫浴60分鐘； (3)加酶:空白對照孔不加酶標(biāo)記物，其余孔加入酶標(biāo)記物50ul，振蕩混勻； (4)溫育:置37±1° C溫育30分鐘； (5)洗滌:棄去孔內(nèi)液體，將稀釋后的洗液注滿各孔，靜置30-60秒，棄去孔內(nèi)洗液，重復(fù)洗6次后拍干； (6)顯色:每孔加入底物緩沖液50ul，再加入底物液50ul，振蕩混勻，置37±1°C溫育30分鐘； (7)終止:每孔加入終止液50ul，輕拍混勻； (8)讀值:用酶標(biāo)儀讀值，在單波長450nm(須以空白對照孔校零)或雙波長450nm/620nm-700nm 下讀取各孔 A 值。
【專利摘要】一種減毒沙門菌VNP20009在基因表達(dá)中的應(yīng)用包括：沙門氏菌感受態(tài)制備；疫苗菌株構(gòu)建；細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn)；Elisa法檢測乙型肝炎病毒表面抗原。本發(fā)明以減毒沙門菌VNP20009為載體來傳遞效應(yīng)基因，既可攜帶原核表達(dá)質(zhì)粒也可攜帶真核表達(dá)質(zhì)粒，簡單方便，快速高效，適用于一些不易表達(dá)或主要表達(dá)在包涵體的蛋白。<b/>
【IPC分類】C12R1-42, C12N15-74, C12N15-51
【公開號】CN104805113
【申請?zhí)枴緾N201510223921
【發(fā)明人】陳廷濤, 鄧侃, 辛洪波
【申請人】南昌大學(xué)
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月6日