專利名稱：大菱鲆呼腸孤病毒全基因組及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水生動物病毒，具體涉及一種大菱鲆呼腸孤病毒基因組，還涉及一種 大菱鲆呼腸孤病毒基因組在病毒檢測中的應(yīng)用，特別涉及從大菱鲆呼腸孤病毒S7節(jié)段克 隆的一個誘導(dǎo)細胞融合蛋白的功能用途。
背景技術(shù)：
呼腸孤病毒是具有分節(jié)段的雙鏈RNA基因組的病毒，能廣泛感染人、其他脊椎動 物、昆蟲和植物。病毒病的早期診斷與疫苗免疫對病毒病的預(yù)防起著關(guān)鍵作用，而病毒基因 組的核酸序列可以作為檢測體內(nèi)、外病毒的特異性分子標記，亦是研制抗病毒藥物的靶標 及病毒疫苗的基本素材。因此，分離、鑒定水生呼腸孤病毒及其基因組是對水生動物病毒病 進行分子診斷及研制病毒疫苗的前提條件。水生呼腸孤病毒是感染水生動物的呼腸孤病毒。目前已從多種患病水生動物中分 離到呼腸孤病毒，如從患出血病的草魚中分離到草魚呼腸孤病毒病原，這類病毒病原已對 包括我國在內(nèi)的亞洲各地區(qū)草魚養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重危害。根據(jù)RNA-RNA blot雜交分析及基因 組序列相似度，水生呼腸孤病毒屬病毒已被分為六個亞型(水生呼腸孤病毒A-F)。目前為 止，已經(jīng)獲得全基因組序列信息的水生呼腸孤病毒有草魚出血病病毒873株(Grass carp reovirus 873，GCRV 873)，美洲金體鳊魚呼腸孤病毒(Golden shiner reoviru, GSRV)，美 國草魚呼腸孤病毒(American grass carp reovirus, AGCRV)。另有一些病毒株部分序列 已測定(Attoui，H et al, (2002)，普通病毒學雜志(Journal of General Virology) ,83 1941-1951 ；Mohd Jaafar, F et al, (2008)，病毒學(Virology), 373 :310_321)?；蚪M序 列信息的獲得為進一步研究各病毒株之間的關(guān)系以及病毒的功能基因提供了堅實的基礎(chǔ)。病毒感染的癥狀與其致病力有密切相關(guān)性。現(xiàn)已知水生呼腸孤病毒感染細胞時， 可誘導(dǎo)細胞融合，導(dǎo)致產(chǎn)生合胞體，這也是呼腸孤病毒感染細胞時所引起的典型病變。大 菱鲆呼腸孤病毒(Scophthalmus maximus reovirus, SMReV)是由我們首次從患病大菱 鲆中分離鑒定的呼腸孤病毒病原，屬于呼腸孤病毒科(reoviridae)水生呼腸孤病毒屬 (aquareovirus)成員，主要感染重要的經(jīng)濟魚類大菱鲆，此病毒的基因組序列信息及功能 基因還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種大菱鲆呼腸孤病毒全基因組，其由11條分節(jié)段 的雙鏈RNA組成，總長24042bp。各節(jié)段大小分別為:Ll，3947bp ；L2，3866bp ；L3，3687bp ； M4，2640bp ；M5，2241bp ；M6，2057bp ；S7,1399bp ；S8,1317bp ；S9，1118bp ；S10，986bp ；Sll, 784bp。其中，Li，L2，L3，M5，M6，S8，SlO節(jié)段分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，而其它節(jié)段編碼病 毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。運用本發(fā)明獲得的基因組，通過現(xiàn)有的技術(shù)可制成可利用的制劑或產(chǎn)品， 應(yīng)用于大菱鲆呼腸孤病毒的檢測及免疫預(yù)防等方面。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種大菱鲆呼腸孤病毒全基因在病毒檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種大菱鲆呼腸孤病毒編碼的誘導(dǎo)細胞融合 蛋白作為制備用于細胞融合誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施一種大菱鲆呼腸孤病毒基因組序列的制備方法，其步驟是A、大菱鲆呼腸孤病毒核酸的提取使用Trizol Reagent試劑(Invitrogen)提取大菱鲆呼腸孤病毒dsRNA核酸，詳 見試劑使用手冊。B、連接人工接頭提純的病毒核酸于(W/V)瓊脂糖凝膠電泳，將各節(jié)段對應(yīng)的條帶切下，使用凝 膠回收試劑盒(Fermentas)回收各節(jié)段dsRNA?；厥盏暮怂岵捎媚┒思游卜y定序列。使用T4RNA ligase (Takara)將人工合成 的寡核苷酸接頭P1連接到各節(jié)段dsRNA的3’末端。連接產(chǎn)物用等體積的酚/氯仿抽提純 化，溶于20iUTE溶液。C、逆轉(zhuǎn)錄連上人工接頭的dsRNA使用引物P2 (5 ’ AGTCTAAGTGAGGATGGCGGG3，)逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物中的RNA成分用終濃度為0. 1M的NaOH水解除去，用HC1中和反應(yīng)。加入Tris_HCl 緩沖液(PH7. 5)至終濃度20mM。cDNA在68°C退火20小時，酚/氯仿抽提純化，溶于lOiUTE溶液。D、PCR擴增及序列測定取2iil cDNA PCR擴增。PCR循環(huán)之前預(yù)先于72°C延伸2min。PCR產(chǎn)物于(W/ V)瓊脂糖凝膠電泳，將擴增條帶切下，回收后連接到PMD18-T載體(Takara)，挑選陽性克隆 測序。得到各節(jié)段的序列信息。E、NS22基因在魚類培養(yǎng)細胞內(nèi)的表達及起始密碼子的確定將S7節(jié)段1-613堿基的核苷酸序列于pcDNA3. 1載體(Invitrogen)設(shè)計構(gòu)建成 真核表達質(zhì)粒。構(gòu)建成功的質(zhì)粒使用LipofectamindOOO轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染到 魚類細胞系中，按試劑操作手冊進行。轉(zhuǎn)染后24h，使用核酸染料H0echst33342染核，于熒 光顯微鏡下觀察。按上述方法，分別將S7節(jié)段11-613，14-613，15-613,18-613堿基的核苷酸序列插 入pcDNA3. 1載體，轉(zhuǎn)染魚類培養(yǎng)細胞系，觀察現(xiàn)象。跟據(jù)細胞融合現(xiàn)象的出現(xiàn)確定NS22基 因的起始密碼子。結(jié)果表明NS22基因起始于非經(jīng)典的起始密碼子CUG，編碼的蛋白可以誘 導(dǎo)細胞的融合。一種分離的大菱鲆呼腸孤病毒全基因組，其序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列，其中1-3947為L1節(jié)段序列，3948-7813為L2節(jié)段序列，7814-11500為L3節(jié)段序列， 11501-14140為M4節(jié)段序列，14141-16381為M5節(jié)段序列，16382-18438為M6節(jié)段序列， 18439-19837為S7節(jié)段序列，19838-21154為S8節(jié)段序列，21155-22272為S9節(jié)段序列， 22273-23258為S10節(jié)段序列，23259-24042為S11節(jié)段序列。在步驟D中獲得，由11條分節(jié) 段的雙鏈RNA組成，總長24042bp。各節(jié)段大小分別為:Ll，3947bp ；L2，3866bp ；L3，3687bp ； M4，2640bp ；M5，2241bp ；M6，2057bp ；S7,1399bp ；S8,1317bp ；S9,1118bp ；S10，986bp ；S11,
4784bp。其中丄1，1^2丄3^5^6，58，310節(jié)段分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，而其它節(jié)段編碼病 毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。該基因組為首次獲得，其序列及編碼的蛋白可用于病毒的特異性檢測。一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID W). 2所示的氨基酸序列，在步驟E中獲得， 由大菱鲆呼腸孤病毒S7節(jié)段包含的基因NS22編碼。通過PCR擴增得到NS22基因全長，并 通過缺失突變確定了該基因的起始密碼子。該基因cDNA全長597bp，編碼198個氨基酸，起 始于一個非經(jīng)典的起始密碼子CTG，含有一個跨膜區(qū)。該基因編碼的蛋白可應(yīng)用于細胞融合 誘導(dǎo)劑的制備。一種大菱鲆呼腸孤病毒基因序列及其編碼蛋白在制備大菱鲆呼腸孤病毒診斷試 劑中的用途。病毒的基因組序列及其蛋白可以用來特異性的檢測該病毒的存在，以S11節(jié)段編 碼蛋白為例闡明了病毒基因序列在制備病毒檢測藥物中的應(yīng)用，通過將S11節(jié)段編碼基因 克隆到原核表達載體pET32a (Novagen)中，體外表達，純化蛋白，將純化的蛋白免疫動物， 制備抗血清，考察了抗病毒蛋白的血清在病毒診斷試劑中的應(yīng)用。結(jié)果表明抗病毒蛋白的 抗血清可以作為一種藥物試劑檢測病毒的存在。一種大菱鲆呼腸孤病毒編碼的誘導(dǎo)細胞融合蛋白作為一種細胞融合誘導(dǎo)劑中的 用途。通過將NS22基因克隆到真核表達載體pcDNA3. 1 (Invitrogen)中，于體外培養(yǎng)的 魚類細胞中表達，考察了該基因的表達對魚類細胞的影響。結(jié)果表明該基因的表達引起 魚類培養(yǎng)細胞出現(xiàn)明顯的融合現(xiàn)象，細胞出現(xiàn)合胞體。說明該基因可誘導(dǎo)魚類細胞的融合。 由于NS22基因編碼的蛋白在魚類細胞中表達時，可以引起明顯的細胞融合現(xiàn)象，因此該基 因可以作為一種細胞融合誘導(dǎo)劑，在誘導(dǎo)多種細胞的融合中起重要作用。本發(fā)明的優(yōu)點1.首次獲得了大菱鲆呼腸孤病毒基因組的全部序列結(jié)構(gòu)信息，運用獲得的序列信 息，可特異的檢測大菱鲆呼腸孤病毒病，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可得到廣泛應(yīng)用；病毒核酸材料可程 序化制備，批量生產(chǎn)。2.提供了運用大菱鲆呼腸孤病毒基因組序列及其蛋白制備病毒特異性診斷試劑 的用途，建立大菱鲆呼腸孤病毒病特異、敏感、定位的診斷方法，可規(guī)范操作，快速診斷大菱 鲆呼腸孤病毒病。3. S7節(jié)段編碼誘導(dǎo)細胞融合蛋白的鑒定，提供了一種新型細胞融合誘導(dǎo)劑的研制 的用途。在多種魚類細胞中的表達說明，其可誘導(dǎo)多種魚類細胞之間的融合，因而可作為新 型的細胞融合誘導(dǎo)劑廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)其它細胞的融合。


圖1為大菱鲆呼腸孤病毒基因組電泳圖譜，以及病毒基因組織結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為S11節(jié)段的原核表達及大菱鲆呼腸孤病毒western檢測。圖A為S11節(jié)段的原核表達M, marker ；1，對照；2，誘導(dǎo)表達。圖B為western檢測病毒1為對照，2為病 感染的細胞。
圖3為在魚類細胞中表達NS22基因及其缺失片段。圖a，b，c為相差顯微鏡觀察；圖d，e，f為細胞核熒光染色觀察；
圖g，h，i為相差與熒光觀察圖片的重合。顯微觀察表明NS22基因可以誘導(dǎo)魚類細胞的融合，而且序列15-613及序列 18-613均不能誘導(dǎo)細胞融合，根據(jù)S7節(jié)段14-19位序列AUCCUG與真核生物起始密碼子保 守序列iVeNNAUG比較分析，說明NS22基因使用非經(jīng)典的起始密碼子CUG起始蛋白合成。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例子對本發(fā)明作進一步說明，但并不作為對本發(fā)明權(quán)利范圍 的限制。實施例1 一種大菱鲆呼腸孤病毒全基因的制備方法，其步驟是A、大菱鲆呼腸孤病毒核酸的提取使用Trizol Reagent試劑(Invitrogen)提取大菱鲆呼腸孤病毒dsRNA核酸，詳見 試劑使用手冊。將100 μ 1病毒懸液加入900 μ 1 Trizol試劑，顛倒混勻5-10次，15-30°c靜 置5min，徹底裂解病毒蛋白。加0. 2ml氯仿，用力搖動Eppdorf管15s，15_30°C靜置2-3min ； 2-8°C以不超過12，OOOg離心15min ；小心取出上層水相到另一干凈的Eppdorf管中，加等 體積的異丙醇混勻，15-30°C靜置IOmin ；2-8°C以不超過12，OOOg離心IOmin ；沉淀用Iml 75% (V/V)的乙醇洗滌，搖勻后在2-8°C以不超過7，500g離心5min ；棄乙醇，空氣中干燥 IOmin ；加20 μ 1 DEPC處理水，_80°C保存?zhèn)溆谩、連接人工接頭提純的病毒核酸于1 % (W/V)瓊脂糖凝膠電泳，將各節(jié)段對應(yīng)的條帶切下，使用凝 膠回收試劑盒(Fermentas)回收各節(jié)段dsRNA?；厥盏暮怂岵捎媚┒思游卜y定序列。使用T4RNA ligase (Takara)將人工合成 的寡核苷酸接頭 Pl (5 ‘ P04-CCCGCCATCCTCACTTAGACT"NH23 ‘)連接到各節(jié)段 dsRNA 的 3， 末端。按試劑盒方法進行，20 μ 1連接體系包括50mM Tris-HCl (PH7. 8)，IOOng dsRNA, IOmM MgCl2, IOmM DTT, IOmM ATP,50pM Pl, 40 % DMS0,10 % PEG6000, 20U T4RNA連接酶，15°C過夜 連接。連接產(chǎn)物用等體積的酚/氯仿抽提純化，溶于20 μ ITE溶液。C、逆轉(zhuǎn)錄連上人工接頭的dsRNA使用引物Ρ2 (5 ’ AGTCTAAGTGAGGATGGCGGG 3 ’)逆轉(zhuǎn)錄。 dsRNA 10μ 1加入P2引物1μ 1，二甲基亞砜4μ 1，混勻后94°C變性5min。然后在終體積為 25 μ 1的體系中加入反應(yīng)緩沖液5 μ 1，RNA酶抑制劑1 μ 1，dNTPl μ 1，匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1， H2O 2 μ L· 42°C保溫1小時進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的RNA成分用終濃度為0. IM的NaOH 水解除去，用HCl中和反應(yīng)。加入Tris-HCl緩沖液(PH7. 5)至終濃度20mM。cDNA在68°C 退火20小時，酚/氯仿抽提純化，溶于10 μ ITE溶液。D、PCR擴增及序列測定取2 μ 1 cDNA 力口 入 IOxPCR 緩沖液 5 μ 1，dNTP 2 μ 1，弓 | 物 P21 μ 1，Ex Taq 酶 (Takara) 1 μ 1于50 μ 1反應(yīng)體系中進行PCR擴增。PCR循環(huán)之前預(yù)先于72°C延伸2min。PCR循環(huán)如下94°C變性4min后，以94°C 30s,58°C 30s,72°C 2min反應(yīng)32個循環(huán)，最后72°C延 伸lOmin。PCR產(chǎn)物于(W/V)瓊脂糖凝膠電泳，將擴增條帶(約1. 4kb)切下，回收后連 接到pMD18-T載體(Takara)，挑選陽性克隆測序。E、NS22基因在魚類培養(yǎng)細胞內(nèi)的表達及起始密碼子的確定將S7節(jié)段1-613堿基的核苷酸序列于pcDNA3. 1載體設(shè)計構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒 使用引物 P3/P4(P3 :5，ACTGGTACCGTTTTAGTCAATCATCCTG 3’ ；P4 :5’ ATTCTCGAGTAAAGTC AACGGAAG 3’)擴增，擴增產(chǎn)物與pcDNA3. 1載體同時雙酶切，使用內(nèi)切酶Kpn I和Xho I。 酶切產(chǎn)物使用T4DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆。構(gòu)建成功的質(zhì)粒使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染到魚類細 胞系中，按試劑操作手冊進行。轉(zhuǎn)染后24h，使用核酸染料H0echst33342染核，于熒光顯微 鏡下觀察。按上述方法，分別將S7節(jié)段11-613，14-613，15-613，18-613堿基的核苷酸序列插 入pcDNA3. 1載體，轉(zhuǎn)染魚類培養(yǎng)細胞系，觀察現(xiàn)象以確定NS22基因的起始密碼子。結(jié)果表 明NS22基因起始于非經(jīng)典的起始密碼子CUG，編碼的蛋白可以誘導(dǎo)細胞的融合。F、實驗結(jié)果從lOOul大菱鲆呼腸孤病毒懸液中獲得了高純度的病毒核酸材料，如圖1所示，在 瓊脂糖凝膠電泳中顯示了清晰的10條基因組條帶，并首次得到了大菱鲆呼腸孤病毒基
因組信息，如表1所示。表1大菱鲆呼腸孤病毒基因組信息 實施例2 大菱鲆呼腸孤病毒基因序列及其編碼蛋白應(yīng)用于大菱鲆呼腸孤病毒診 斷試劑的制備。下面以S11節(jié)段編碼蛋白為例說明大菱鲆呼腸孤病毒基因組序列在病毒檢測藥 物中的應(yīng)用A、S11節(jié)段的體外表達將S11節(jié)段編碼基因的核苷酸序列于pET32a載體設(shè)計構(gòu)建成原核表達質(zhì)粒使用引物 P5/P6(P5 :5，GAAGAATTCGGAGCAGGAATG 3，；P6 :5，GCCAAGCTTACTCAAGACTCTACTC 3，) 擴增，擴增產(chǎn)物與pET32a載體同時雙酶切，使用內(nèi)切酶EcoR I和Hind III。酶切產(chǎn)物使用 T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E. coli DE3，挑選陽性克隆。陽性克隆菌培養(yǎng)至對數(shù)期，加入終濃度為lmmol/L的IPTG在37°C誘導(dǎo)4_8h，表達的蛋白可使用親和層析純化。B、抗血清制備純化的蛋白采用腹腔注射法免疫小鼠，每次注射量為50ug。首次免疫使用弗氏完 全佐劑，后4次使用不完全佐劑。第5次免疫后3天取小鼠血液。將血液于37°Clh后放 4°C過夜，4000g離心IOmin后，吸取上層多抗血清，_80°C保存?zhèn)溆谩、免疫學方法檢測大菱鲆呼腸孤病毒免疫學方法檢測可分為ELISA，Western等，下面以Western為例來闡述病毒蛋白 多抗血清在病毒檢測藥物中的應(yīng)用將需檢測的蛋白樣品經(jīng)12 % (ff/V) SDS-PAGE膠分離；電泳結(jié)束后按照 MiniTrans-Blot電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)操作指南裝配轉(zhuǎn)膜Sandwich，安裝電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，以70V電壓 冰浴轉(zhuǎn)膜40min，將蛋白轉(zhuǎn)移至孔徑為0. 45 μ m的PVDF膜上；麗春紅染色轉(zhuǎn)膜后的PVDF，標 出Marker后，用TBST溶液洗膜三次，每次IOmin ；5 % (W/V)脫脂奶粉(溶于TBST中)室 溫封閉Ih;以1 500稀釋比例(根據(jù)抗體效價調(diào)整)將抗血清稀釋于TBST中，室溫孵育 2h ；TBST洗膜3次，每次IOmin ；以1 1000稀釋比例加入堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG(或 羊抗鼠)，室溫孵育Ih ；TBST洗膜3次，每次IOmin ；采用NBT/BCIP顯色試劑盒進行顯色，隨 時觀察顯色情況，目的帶出現(xiàn)時用流水沖洗終止反應(yīng)；膜晾干以后，用凝膠掃描分析系統(tǒng)掃 描存圖。D、檢測結(jié)果使用Sll節(jié)段編碼的蛋白作為抗原成功制備了抗病毒蛋白的血清，如圖2A所示， 構(gòu)建的原核表達菌株在誘導(dǎo)6h后得到了大量的表達蛋白(圖2A泳道2)。使用該抗血清 以1 500稀釋后仍能特異有效的檢測到病毒蛋白的存在，如圖2B泳道2所示，顯色后得 到了特異的條帶。檢測的總蛋白約10ug，因而檢測病毒蛋白的精度可達到微克級，具有很高 的靈敏性，概況如表2。表2抗Sll蛋白血清檢測病毒蛋白 “_”表示無檢測陽性信號，“ + ”的數(shù)量表示檢測陽性信號的強弱。實施例3 :NS22基因作為人工的細胞融合誘導(dǎo)劑Ajf S7節(jié)段1-613堿基的核苷酸序列于pcDNA3. 1載體設(shè)計構(gòu)建成真核表達質(zhì) 粒使用弓I物 P3/P4 (P3 :5，ACTGGTACCGTTTTAGTCAATCATCCTG 3' ；P4 5，ATTCTCGAGTAAAGTC AACGGAAG 3，)進行 PCR 擴增；B、擴增產(chǎn)物與pcDNA3. 1載體同時雙酶切，使用內(nèi)切酶Kpn I和Xho I。酶切產(chǎn)物 使用T4DNA連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑選陽性克??；C、構(gòu)建成功的克隆于含氨芐的培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)12h，使用去內(nèi)毒素的質(zhì)粒提 取試劑盒(OMEGA)提取質(zhì)粒，按操作手冊進行；D、構(gòu)建成功的質(zhì)粒使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染到魚類 細胞系中，按試劑操作手冊進行。轉(zhuǎn)染后24h，使用核酸染料H0echst33342染核，于熒光顯 微鏡下觀察。E、使用約2ug含NS22基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，在24h內(nèi)，細胞出現(xiàn)明顯的融合現(xiàn) 象，如圖3g，h所示，表現(xiàn)為相鄰細胞的細胞膜融合到一起，細胞核聚集形成合胞體。并且在 同種魚的不同細胞及不同魚的細胞中均能引起細胞的融合。根據(jù)觀察結(jié)果(圖3)，NS22基因的原核或真核表達產(chǎn)物，可作為一種人工設(shè)計的 細胞融合誘導(dǎo)劑，用于誘導(dǎo)其它魚類細胞或動物細胞的融合。也可以用于促進外源物質(zhì)與 細胞膜的融合，進而有利于外源物質(zhì)進入細胞。表3NS22蛋白誘導(dǎo)不同細胞融合概況
權(quán)利要求
一種分離大菱鲆呼腸孤病毒全基因，其序列為SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的一種分離大菱鲆呼腸孤病毒全基因在制備病毒檢測藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的一種分離的蛋白質(zhì)在制備誘導(dǎo)細胞融合蛋白藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大菱鲆呼腸孤病毒全基因組及及制備方法和應(yīng)用，其步驟是A、大菱鲆呼腸孤病毒核酸的提取，使用Trizol Reagent試劑提取大菱鲆呼腸孤病毒dsRNA核酸。B、連接人工接頭，提純的病毒核酸于瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠回收試劑盒，回收各節(jié)段dsRNA。C、逆轉(zhuǎn)錄，連上人工接頭的dsRNA使用引物逆轉(zhuǎn)錄；D、PCR擴增及序列測定，取2μl cDNA PCR擴增，將擴增條帶切下，回收后連接到載體，挑選陽性克隆測序；E、NS22基因在魚類培養(yǎng)細胞內(nèi)的表達及起始密碼子的確定，將S7節(jié)段1-613堿基的核苷酸序列于載體設(shè)計構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒。一種大菱鲆呼腸孤病毒基因序列及其編碼蛋白在制備大菱鲆呼腸孤病毒診斷試劑或作為細胞融合誘導(dǎo)劑中的用途。
文檔編號C12N15/46GK101864435SQ20101016234
公開日2010年10月20日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者張奇亞, 柯飛 申請人:中國科學院水生生物研究所