專利名稱：烈性噬藻體PaV-LD基因組及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及噬藻體基因組學和基因工程領(lǐng)域。更具體涉及一種烈性噬藻體PaV-LD 基因組，同時涉及一種烈性噬藻體PaV-LD全基因的制備方法，還涉及一種烈性噬藻體 PaV-LD全基因在藍藻水華控制中的應(yīng)用，特別涉及烈性噬藻體PaV-LD溶解藍藻功能基因 及其編碼的溶藻蛋白的功能用途。
背景技術(shù)：
藍藻又稱為藍細菌，是海洋、湖泊中最常見的微生物，一毫升海水中藍藻細胞的數(shù) 量超過100萬個。這種單細胞生物沒有葉綠體，僅有十分簡單的光合作用結(jié)構(gòu)裝置，卻能像 高等植物一樣進行光合作用。事實上，藍藻承擔了全球四分之一的光合作用。令人們擔憂 的是，隨著水體環(huán)境的富營養(yǎng)化，藍綠藻形成水華頻繁爆發(fā)，其危害日益嚴重。感染藍藻的病毒(也稱噬藻體，phycophage)，其遺傳物質(zhì)DNA或RNA在入侵藻細 胞后，會修飾自身和藻的DNA，并且控制藻體內(nèi)的各種代謝途徑。多數(shù)噬藻體能裂解宿主藻， 為溶藻性的噬藻體。噬藻體感染藍藻后，在藍藻體內(nèi)大量繁殖子代噬藻體，然后將藍藻裂 解，從而釋放子代，并且繼續(xù)感染其它藍藻。它侵染藍藻細胞時，對其它非宿主水生動植物 不會產(chǎn)生毒害。噬藻體裂解藍藻作為一種生物控藻技術(shù)，有巨大的潛在發(fā)展應(yīng)用前景。由于現(xiàn)有 的治理有害藻華物理、化學和生物方法在藻類控制技術(shù)上存在缺陷或不足，不僅耗費大量 的資金和設(shè)備，而且往往在使用過程中對其它水生生物造成嚴重危害。而利用噬藻體控制 有害藍藻水華可以彌補以上方法的不足。首先，噬藻體具有很高的生長速率，短時間可以大 量獲得擴增，這滿足天然環(huán)境的大規(guī)模需要。其次，它所需要的培養(yǎng)費用較低，設(shè)備簡單，操 作方便。尤其是它能特異性感染引起有害水華的目標藻類，不侵染其它生物類群(Nagasaki et al.，Applied andEnvironmental Microbiology, 1999,65(3) :898_902 ；楊小茹等，應(yīng) 用與環(huán)境生物學報，2005，11 (5) 651-656 ；Deng et al. , Freshwater Biology, 2008, 53 1240-1252)。同時，子代噬藻體隨著宿主藻的減少而逐漸消亡(Nobel andFuhrman, Applied and Environmental Microbiology, 1997,6377-83 ；Wommackand Colwell, Microbiology Reviews, 2000,64 :69_110)，有助于維護生態(tài)平衡。因此，噬藻體作為微生物因子防治 藍藻水華具有明顯的社會和經(jīng)濟效益(Yoshida et al.，Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72 :1239_1247 ；2008，74 :3269_3273 ；張奇亞和桂建芳等，中國科學院 院刊，2009，24 (4) ；414-420)。但由于噬藻體引起宿主快速消亡的機理尚不明晰，因此亟待 從噬藻體基因組序列解析入手，闡明噬藻體的基因組織結(jié)構(gòu)及其功能，進而從基因水平了 解烈性噬藻體裂解藻的過程，篩選并研發(fā)有商業(yè)價值的裂解藻相關(guān)基因產(chǎn)品，就成為當前 水生病毒學研究的熱點之一。迄今，能檢索到的有關(guān)噬藻體全基因組序列不超過10項，且無一項噬藻體基因組 序列專利。因此，在對新鑒定的、能裂解水華藍藻浮絲藻的噬藻體PaV-LD全基因組進行序 列測定、繪制了其基因組織結(jié)構(gòu)圖、并對其裂解藍藻功能基因開展研究的基礎(chǔ)上，我們就
3“烈性噬藻體PaV-LD全基因組序列及其應(yīng)用”提出專利申請。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種烈性噬藻體PaV-LD基因組核苷酸，該基因組特 征在于具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，基因組DNA由95299個堿基對組成，其中 G+C含量為41. 45 %，可編碼含35至1584個氨基酸的多肽或蛋白質(zhì)，共推導142個開放閱 讀框(ORFs)，如圖1A、圖1B、圖1C、圖1D、圖IE所示。該基因組全長序列及組織結(jié)構(gòu)分析， 有助于了解噬藻體PaV-LD增殖及重要調(diào)控功能有關(guān)的基因結(jié)構(gòu)和功能，建立PaV-LD的感 染途徑并找到其與宿主相互作用的分子機理，為利用噬藻體作為微生物制劑生物防控藍藻 水華奠定可靠的理論依據(jù)。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種烈性噬藻體PaV-LD基因組的制備方法， 該方法有效地擴增并純化噬藻體PaV-LD，從而提取完整和高純度的噬藻體PaV-LD基因組 DNA。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種烈性噬藻體PaV-LD基因組在藍藻水華控 制中的應(yīng)用。以此基因組序列和此序列所包含基因表達的多肽或蛋白質(zhì)為目標開展生物制 劑研究，從而為綜合防治藍藻水華產(chǎn)生積極作用。在本發(fā)明的一個實例中公開了一種能降解藍藻藻膽蛋白體光捕復合物的蛋白生 產(chǎn)方法，該蛋白由PaV-LD基因組第13384至13548個核苷酸序列編碼的NblA基因表達獲 得，其在病毒浸染藍藻細胞過程中與宿主光合系統(tǒng)的捕光性能以及病毒自身的增殖密切相 關(guān)。該方法是利用pET32a原核表達系統(tǒng)，NblA基因表達蛋白量高效且為可溶性，有利于工 業(yè)化大量生產(chǎn)和提純。在病毒感染宿主細胞的過程中，該基因序列所編碼的蛋白能特異降 解宿主類囊體膜上的捕光復合體藻膽蛋白體，從而達到控制藍藻生長繁殖。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種烈性噬藻體PaV-LD全基因組的制備方法，其步驟是1.噬藻體的培養(yǎng)一種烈性噬藻體PaV-LD(由本實驗室分離并保存的噬藻體)接種感染指數(shù)生長期 的浮絲藻，經(jīng)3-4天感染裂解后，獲取噬藻體PaV-LD裂解的藻液。2.噬藻體純化噬藻體PaV-LD裂解的藻液離心去細胞碎片，加核酸酶(DNase和RNase)至其終濃 度為ι μ g/ml，室溫(20-25°C以下相同)放置55-65分鐘；每IOOml懸液加入9. 3g聚乙二 醇8000與5. 8g氯化鈉，搖勻至溶解，置4°C，過夜；26000轉(zhuǎn)/分超速離心1. 5h ；噬藻體懸 浮于3-5mlPBS緩沖液，4°C過夜；噬藻體懸液置于蔗糖密度梯度(20%-60% )上，在4°C，以 19000轉(zhuǎn)/分離心40min ；取出噬藻體條帶，用滅菌蒸餾水洗滌，以26000轉(zhuǎn)/分離心1. 5h， 棄上清，留噬藻體沉淀；用2mlTE緩沖液(lOmmol/L Tris-Cl，lmmol/L EDTA，pH7. 4)將沉淀 懸浮，制備成噬藻體PaV-LD懸液，分裝成每管0. 5ml，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?.基因組DNA提取取上述0.5ml噬藻體PaV-LD懸液，加入蛋白酶K(終濃度為Img/μ L)，37°C溫育 Ih ；加等體積的Tris飽和酚，混勻，10000轉(zhuǎn)/分(Sigmal_15K，12024-H型角轉(zhuǎn)頭)，5min 離心，上層清液轉(zhuǎn)入另一新離心管；加等體積Tris飽和酚-氯仿(1 1)，混勻，10000轉(zhuǎn)/分離心5min，上層清液轉(zhuǎn)入另一新離心管；加等體積氯仿-異戊醇(24 1)，混勻，10000 轉(zhuǎn)/分離心5min，上層清夜轉(zhuǎn)入另一新離心管；加0. 4體積乙酸銨和二體積的異丙醇，充分 混勻，室溫放置lOmin，10000轉(zhuǎn)/分離心5min ；棄上清，用預(yù)冷的75% (體積比)乙醇洗 滌沉淀兩次，室溫下晾干；將晾干好的噬藻體PaV-LD基因組DNA溶于30 μ L TE (10mmol/L Tris-Cl, lmmol/L EDTA, ρΗ7· 4)緩沖液中，_20°C保存?zhèn)溆谩?. PaV-LD全基因組序列的測定在由深圳華大基因科技有限公司完成噬藻體PaV-LD基因組大片段測序，獲取含5 個重疊序列群和四個序列缺口的噬藻體PaV-LD基因組序列支架；在每個重疊序列群兩端 設(shè)計向外延伸引物，采用PaV-LD基因組為模板DNA以及上下游引物進行PCR擴增序列缺 口 ；將PCR擴增的目的序列片段連接PMD18-T載體(TaKaRa公司產(chǎn)品)，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài) 細胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)；挑取序列缺口的目的片段陽性克隆菌進行測序；拼接后獲得一種 分離的烈性噬藻體PaV-LD全基因組，其序列為SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列。一種烈性噬藻體PaV-LD全基因在藍藻水華控制中的應(yīng)用，基本步驟是在含量為IO6個/毫升藻細胞培養(yǎng)液中，接種IO6IU/毫升噬藻體PaV-LD，光照度 為30001ux，25°C，光暗比為14 10的條件下連續(xù)培養(yǎng)，每天定時計數(shù)藻細胞量，一段時間 (4-5天)后，被感染的藍藻細胞被裂解死亡，圖3所示烈性噬藻體PaV-LD對藍藻細胞致死 效果。一種表達降解藍藻藻膽蛋白體光捕復合物NblA基因的方法，基本步驟是1.引物設(shè)計針對表達載體pET32a(InVitrogen公司產(chǎn)品)的酶切位點設(shè)計兩條引物，其一為 5，端帶KpnI酶切位點的上游表達引物PaVF =T GTT GGTACCCTT ATA ACAGCG GAA3，;其二為 3，端帶XhoI酶切位點的下游表達引物PaVR :5，AGT TCTCGA GTT TGG GTT GTT TTC C。2.表達載體pET-NblA的構(gòu)建根據(jù)上述引物進行PCR擴增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)的(質(zhì)量體積比)瓊脂糖膠電 泳，用DNA凝膠回收試劑盒(MBI Fermentas公司產(chǎn)品)回收，連接到PMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化 DH5a感受態(tài)細胞，篩選獲得含NblA全長的質(zhì)粒pT-NblA。表達載體pET32a (Invitrogen 公司產(chǎn)品)和NblA基因片段分別經(jīng)KpnI和XhoI雙酶切后按1 5的比例連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞(Invitrogen公司產(chǎn)品)感受態(tài)細胞，選出陽性克隆并測序驗 證。3.表達載體pET-NblA的誘導表達將測序鑒定讀框正確的陽性克隆接種于5ml含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，經(jīng)IPTG(苯甲基磺酰氟)誘導后，進行SDS-PAGE電泳檢測，獲得如 圖2所示的NblA基因表達產(chǎn)物(加上分子標簽表達后，分子量約為23. 9kDa)。該產(chǎn)物為烈 性噬藻體PaV-LD基因組第13384至13548個核苷酸序列編碼含54個氨基酸的多肽。NblA 基因在病毒浸染藍藻細胞過程中與宿主光合系統(tǒng)的捕光性能以及病毒自身的增殖密切相 關(guān)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果1.首次從浮絲藻中分離到烈性噬藻體PaV-LD，并提供了噬藻體PaV-LD基因組全 序列。制備噬藻體PaV-LD基因組核酸可程序化操作，批量生產(chǎn)。
2.建立噬藻體標記基因特異、敏感的診斷方法，及對不同水體中烈性噬藻體 PaV-LD與其宿主水華藍藻浮絲藻的含量分析檢測技術(shù)，可規(guī)范操作。3.烈性噬藻體PaV-LD溶藻功能基因產(chǎn)物的大量表達，將提供一種新型、環(huán)保控藻 方法和途徑。4.實驗效果及數(shù)據(jù)(1)烈性噬藻體PaV-LD對藍藻裂解效果測定，見表1。表1烈性噬藻體PaV-LD對藍藻裂解效果測定
組別感染前感染后(5天)日裂解量 (個/毫升)藻細胞量 (個/毫升)藻液顏色藻細胞量 (個/毫升)藻液顏色PaV-LD感染組IO6藍綠IO3黃且清亮透明IO5未加PaV-LD對照IO6藍綠IO8藍綠0以上感染試驗結(jié)果表明，烈性噬藻體PaV-LD接種宿主藍藻后能明顯引起藻細胞 的裂解死亡，且藻細胞量平均每天下降高達IO5個/毫升，藻液顏色明顯由正常的藍綠色變 為黃且清亮透明，見圖3，因此一種烈性噬藻體PaV-LD對有害目標藍藻水華的具有抑制作用。(2)烈性噬藻體PaV-LD對捕光復合體藻膽蛋白體生物降解活性測定，見下表2。表2烈性噬藻體PaV-LD對捕光復合體藻膽蛋白體生物降解活性測定
組別降解效率(％)0小時12小時24小時36小時48小時感染組08425685正常組00000 以上試驗結(jié)果表明，接種了噬藻體PaV-LD的藻液比正常對照藻液的捕光復合體 藻膽蛋白體含量隨感染時間推移明顯呈下降趨勢。


圖1A、圖1B、圖1C、圖1D、圖IE —種烈性噬藻體PaV-LD全基因組的組織結(jié)構(gòu)圖。 箭頭示預(yù)測基因在PaV-LD基因組序列中的位置、大小及方向。斜紋箭頭示與噬藻體(噬菌 體)具有同源性的基因；黑色箭頭示與藍藻具有同源性的基因。白色箭頭示未知功能基因。 比例尺每格長度為1000個堿基對。圖2pET_NblA質(zhì)粒表達純化的SDS-PAGE分析圖。M 蛋白分子量標準；1 =IPTG誘 導的細菌總蛋白；2:未經(jīng)IPTG誘導的細菌總蛋白；箭頭示NblA基因的表達產(chǎn)物。圖3 —種烈性噬藻體PaV-LD對藍藻致死效應(yīng)圖。A =PaV-LD感染藍藻細胞培養(yǎng)液； B:正常藍藻細胞培養(yǎng)液。
具體實施例方式為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中采用以下具體實施方式
獲取烈性噬藻體PaV-LD基 因組序列實施例1 噬藻體PaV-LD的培養(yǎng)及其核酸制備方法，基本步驟如下1.噬藻體的培養(yǎng)一種烈性噬藻體PaV-LD感染的宿主藍藻為浮絲藻。純化的噬藻體液(滴度IO6IU/ ml)以1 10的體積比接種到指數(shù)生長期的浮絲藻中，4天后，收集噬藻體PaV-LD裂解的 藻液。一種烈性噬藻體PaV-LD的分離具體方法和步驟見Aquatic Microbial Ecology (Gao et al.，200954 163-170)。2.噬藻體純化(1)噬藻體 PaV-LD 裂解的藻液 300ml，經(jīng) 9000 轉(zhuǎn) / 分離心(Sigma 1-15K，12024-H 型角轉(zhuǎn)頭)15min去細胞碎片；(2)取上清液，加核酸酶(DNase和RNase)至其終濃度為1 μ g/ml，室溫(置 20-25°C以下相同)放置1小時;(3)每IOOml懸液加入9. 3g聚乙二醇8000與5. 8g氯化鈉，搖勻至溶解，置4°C， 過夜；(4)用超速離心機，以26000轉(zhuǎn)/分(Beckman L-90K，Sff41型水平轉(zhuǎn)頭)離心 1. 5h ；(5)留沉淀，加入3-5ml高壓滅菌(121°C，30min)的蒸餾水懸浮噬藻體；(6)噬藻體懸液置于蔗糖密度梯度(20% -60% )上，在4°C，以19000轉(zhuǎn)/分 (Beckman L-90K, Sff41 型水平轉(zhuǎn)頭)離心 40min ；(7)取出噬藻體條帶，用滅菌蒸餾水洗滌，以26000轉(zhuǎn)/分離心(BeCkmanL-90K， Sff41型水平轉(zhuǎn)頭)1. 5h，棄上清，留噬藻體沉淀；(9)用 2mlTE 緩沖液(10mmol/L Tris-Cl，lmmol/L EDTA, ρΗ7· 4)將沉淀懸浮，制 備成噬藻體PaV-LD懸液，分裝成每管0. 5ml，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?.基因組DNA提取(1)取上述0.5ml噬藻體PaV-LD懸液，加入蛋白酶K (終濃度為Img/μ L)，37 °C 溫育1小時；(2)加等體積的Tris飽和酚，混勻，10000轉(zhuǎn)/分(Sigmal_15K，12024-H型角轉(zhuǎn) 頭)，5min離心，上層清液轉(zhuǎn)入另一新離心管；(3)加等體積Tris飽和酚-氯仿(1:1)，混勻，10000轉(zhuǎn)/分離心5min,上層清
液轉(zhuǎn)入另一新離心管；(4)加等體積氯仿-異戊醇(24 1)，混勻，10000轉(zhuǎn)/分離心5min，上層清夜轉(zhuǎn)
入另一新離心管；(5)加0. 4體積乙酸銨和2體積的異丙醇，充分混勻，室溫放置lOmin，10000轉(zhuǎn)/ 分離心5min ；(6)棄上清，用預(yù)冷的75% (體積/體積)乙醇洗滌沉淀兩次，室溫下晾干；(7)將晾干好的噬藻體PaV-LD基因組DNA溶于30 μ LTE緩沖液(IOmmol/
7LTris-Cl, lmmol/L EDTA, pH7. 4)中，_20°C保存?zhèn)溆?，從而得到一種烈性噬藻體PaV-LD基 因組核酸DNA。實施例2 噬藻體PaV-LD全基因組序列的測定、序列拼接及其驗證在由深圳華大基因科技有限公司完成噬藻體PaV-LD基因組大片段測序，提供含5 個重疊序列群和4個序列缺口的噬藻體PaV-LD基因組序列支架的基礎(chǔ)上，本實驗室繼續(xù)進 行了拼接、序列分析及驗證。具體步驟如下1.重疊序列群的鏈接根據(jù)深圳華大基因科技有限公司初步測序結(jié)果，在每個重疊序列群兩端設(shè)計向外 延伸引物，采用PaV-LD基因組為模板DNA以及上下游引物進行PCR擴增序列缺口。(1) PCR擴增序列缺口第一個序列缺口 上游引物為5’ TAACTGCTAAATCTTTTTCCCTGCG 3’，下游引物為 5，CGATATTAACTGCTGAAACTGTGCG3，；擴增程序為 94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30sec，58°C退 火30sec, 72°C延伸1. Omin, 32個循環(huán)；72°C再延伸IOmin0片段大小為195個堿基。第二個序列缺口 上游引物為5 ’ CTGTAAAGAGGGAAGTTGGCATAGA3 ’，下游引物為 5，GATACCATCCCTTTCTAGGCTTTGA3，；擴增程序為 94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30sec，58°C退 火45sec，72°C延伸1. 5min, 32個循環(huán)；72°C再延伸IOmin0片段大小為958個堿基。第三個序列缺口 上游引物為5 ’ TCACGGGTTTTAACAACAAAGTAGG3 ’，下游引物為 5，CACTATCTCATTACCCGTTGTTTCG3，；擴增程序為 94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30sec，58°C退 火45sec，72°C延伸1. 5min, 32個循環(huán)；72°C再延伸lOmin。片段大小為1384個堿基。第四個序列缺口 上游引物為5 ’ TCACTCCACTCAATCTTCGGGATT3 ’，下游引物為 5，TGAACGCAGCAGAAGTCAGAAAG3，；擴增程序為 94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸1. Omin, 32個循環(huán)；72°C再延伸IOmin0片段大小為285個堿基。在無菌PCR管中加入反應(yīng)體系IOX擴增緩沖液2. 5 μ L10mmol/L dNTP 混合液(各 2. 5mmol/L) 0. 5 μ L10ymol/L 上游引物0.5yLΙΟμπιοΙ/L 下游引物0.5yL模板 DNA1 μ LTaq 聚合酶0. 5 μ L力口 ddH2019. 5 μ L總體積25 μ L_(2)電泳檢測及回收目的片段PCR產(chǎn)物用(質(zhì)量/體積)的瓊脂糖膠電泳檢測后，將凝膠置于紫外分析儀內(nèi)， 切下含PCR產(chǎn)物的膠塊，并用DNA凝膠回收試劑盒(MBI Fermentas)回收，PCR產(chǎn)物最后溶 于IOyL的滅菌蒸餾水。(3)連接反應(yīng)目的片段按如下體系與PMD18-T載體(TaKaRa公司產(chǎn)品)進行連接
8
含T4連接酶緩沖液目的片段序列PMD18-T 載體
5 μ L 4. 5μ L 0. 5μ L上述體系在16°C連接，過夜。(4)轉(zhuǎn)化取100 μ L的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)；加入連接反應(yīng)產(chǎn) 物(10 μ L)，在冰上放置30min ；42°C恒溫條件下熱激90sec，再在冰上放置2-3min ；加入 890 μ L無氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)Ih ；涂布于含氨芐青霉素的LB平板，37°C 恒溫培養(yǎng)過夜。(5)測序從培養(yǎng)平板挑取單菌落進行PCR檢測，將含有序列缺口的目的片段陽性克隆菌交 給華大基因科技有限公司測序。待所有序列缺口的核酸片段測序完畢后，進行拼接，由此獲得噬藻體PaV-LD全基 因組95，299bp序列，一種分離的烈性噬藻體PaV-LD全基因，其序列為SEQIDN0 :1所示的核 苷酸序列。2.全基因組序列的驗證為避免出現(xiàn)測序誤差，利用premier 5. 0軟件(PREMIER BiosoftInternational)，按l_2kb長度隨機設(shè)計引物，進行PCR反應(yīng)，并對PCR擴增產(chǎn)物進 行PMD18-T載體(TaKaRa公司產(chǎn)品)連接，轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細胞(TaKaRa公司產(chǎn)品) 后，挑取大腸桿菌陽性克隆進行測序驗證。共計進行了 25次驗證，所有序列均與SEQ ID NO 1中相關(guān)序列一致，證明SEQ ID NO ；1中的序列正確。實施例3:噬藻體PaV-LD全基因組序列生物信息預(yù)測及其組織結(jié)構(gòu)圖繪制，基本步驟如下1.采用 GeneMarks (http // exon.biology. Ratech. edu/heuristic hmm2. cri)、 Glimmer3以及EditSeq(DNAStar)等計算機輔助軟件分析噬藻體PaV-LD基因組序列，獲得 基因組中開放閱讀框(ORF)的位置、數(shù)量、大小及方向。2.利用 Nucleotide blast 在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)中 進行基因同源性比對。3.根據(jù)噬藻體PaV-LD基因組中每個開放閱讀框的位置、大小、方向以及基因同源 性比對結(jié)果，采用Microsoft office計算機軟件繪制PaV-LD基因組的組織結(jié)構(gòu)圖，見圖實施例4:一種烈性噬藻體PaV-LD全基因在藍藻水華控制中的應(yīng)用，其步驟是1. PaV-LD接種病毒液的制備PaV-LD為分離于武漢東湖自然水生態(tài)環(huán)境中的噬藻體，感染藍藻后獲取藍藻細胞 裂解液，經(jīng)12000轉(zhuǎn)/分離心(Sigmal-15K，12024-H型角轉(zhuǎn)頭)IOmin去細胞碎片，取上層 清液做為接種病毒液。2. PaV-LD對藍藻生長控制在含量為IO6個/毫升藻細胞培養(yǎng)液中，接種IO6IU/毫升噬藻體PaV-LD，光照度為30001uX，25°C，光暗比為14 10的條件下連續(xù)培養(yǎng)，每天定時計數(shù)藻細胞量。經(jīng)浮游計數(shù) 框可檢測到，藻細胞量平均每天下降IO5個/毫升。與未接種噬藻體PaV-LD的正常藻細胞 對照樣比較，3天后藻液顏色有明顯差別，正常藻液呈藍綠色，而接種了噬藻體PaV-LD的藻 液因細胞裂解而呈淺黃色。如圖3所示，一種烈性噬藻體PaV-LD對藍藻細胞的致死效果。實施例5:一種表達降解藍藻藻膽蛋白體光捕復合物NblA基因的方法，其步驟是1.表達載體pET-NblA的構(gòu)建針對表達載體pET32a(InVitr0gen公司產(chǎn)品)的酶切位點設(shè)計兩條引物，其一為 5，端帶KpnI酶切位點的上游表達引物PaVF =T GTT GGTACCCTT ATA ACAGCG GAA3，;其二為 3，端帶XhoI酶切位點的下游表達引物PaVR :5，AGT TCTCGA GTT TGG GTT GTT TTC C。在無 菌PCR管內(nèi)加入2. 5μ LlOX擴增緩沖液(BestBio公司產(chǎn)品)，0. 5yL 10mmol/L dNTP混 合液(各 2. 5mmol/L)，0. 5 μ LlO μ mol/LPaVF, 0. 5 μ L 10 μ mol/L PaVR, 1 μ L 模板(PaV-LD 基因組DNA)，0. 5 μ L Taq聚合酶(BestBio公司產(chǎn)品)，加水至25 μ L總體積；擴增程序為 94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30sec，58°C退火 30sec，72°C延伸 1. 0min，32 個循環(huán)；72°C再延 伸 IOmin0PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的(質(zhì)量體積比)瓊脂糖膠電泳，用DNA凝膠回收試劑盒 (MBIFermentas公司產(chǎn)品)回收，連接到PMD18-T載體(TaKaRa公司產(chǎn)品)，并轉(zhuǎn)化DH5 α 感受態(tài)細胞(TaKaRa公司產(chǎn)品)，篩選獲得含NblA全長的質(zhì)粒pT_NblA。表達載體pET32a (Invitrogen公司產(chǎn)品)和質(zhì)粒pT_NblA分別經(jīng)KpnI和XhoI雙 酶切后，進行(質(zhì)量/體積)瓊脂糖膠電泳，切膠回收NblA基因片段和載體片段。表 達載體pET32a(Invitrogen公司產(chǎn)品)和NblA基因片段按1 5的比例連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞(Invitrogen公司產(chǎn)品)，在含100mg/L氨芐青霉素的LB平 板上培養(yǎng)16小時，挑選出陽性克隆并測序驗證。2.表達載體pET-NblA的誘導表達將測序鑒定讀框正確的陽性克隆接種于5ml含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)到0D_約為0. 6時加入IPTG(苯甲基磺酰氟)至終濃度0. Immol/ L，37°C誘導4小時。離心(12000轉(zhuǎn)/分，4°C，IOmin)，取誘導后的菌體細胞，加入50 μ L高 壓滅菌(121°C，30min)的蒸餾水，再加入等體積的上樣緩沖液(1. OM Tris (pH6. 8)，50%甘 油，10% SDS，β-巰基乙醇，溴酚藍)，100°C加熱變性5分鐘。離心(12000轉(zhuǎn)/分，4°C， IOmin)，取上清進行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了降解藍藻藻膽蛋白體光捕復合物基因(NblA)的原核高效 穩(wěn)定表達系統(tǒng)pET-NblA，并表達獲得相應(yīng)的表達產(chǎn)物(分子量大小約23. 9KDa)，見圖2。
權(quán)利要求
一種分離的烈性噬藻體PaV LD全基因，其序列為SEQID NO1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的一種分離的烈性噬藻體PaV-LD全基因在藍藻水華控制中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種烈性噬藻體PaV-LD基因組及制備方法和應(yīng)用，其步驟A、噬藻體的培養(yǎng)烈性噬藻體PaV-LD接種感染指數(shù)生長期的浮絲藻，感染裂解后，獲取噬藻體PaV-LD裂解的藻液；B、噬藻體純化噬藻體PaV-LD裂解的藻液離心去細胞碎片，加核酸酶至其終濃度，室溫放置，備用；C、基因組DNA提取取上述噬藻體PaV-LD懸液，加入蛋白酶K，混勻，離心，室溫下晾干；將晾干好的噬藻體PaV-LD基因組DNA溶于TE緩沖液中，保存?zhèn)溆茫籇、PaV-LD全基因組序列的測定拼接后獲得SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。一種分離的烈性噬藻體PaV-LD全基因組在藍藻水華控制中的應(yīng)用。制備噬藻體PaV-LD基因組核酸可程序化操作，烈性噬藻體PaV-LD溶藻功能基因產(chǎn)物的大量表達，批量生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/10GK101899450SQ201010162329
公開日2010年12月1日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日
發(fā)明者張奇亞, 高惡斌 申請人:中國科學院水生生物研究所