專利名稱：運(yùn)用基因整合平臺(tái)系統(tǒng)進(jìn)行藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因及表達(dá)胸腺素α1的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程。
藍(lán)藻(Cyanophyte)又稱藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacterium)，是一種特殊的微生物。藍(lán)藻的基因組簡單，除了裸露的染色體DNA外不含葉綠體和線粒體DNA，便于進(jìn)行基因分析。近年來，已克隆了大量藍(lán)藻基因，建立了一些藍(lán)藻的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)以及外源基因表達(dá)系統(tǒng)。藍(lán)藻作為表達(dá)外源基因的受體菌已取得了不少研究成果。Tandeau de Marsac(Mo1.Gen.Genet1987，209296～298)以pUC303為載體在單胞藻Synechococcus sp.PCC7942(簡稱Synechococcus7942，其余藻名依此類推)中表達(dá)了原核生物芽孢桿菌殺幼蚊毒素基因；Fukuda等(Biotech．Lett1994，161～6)在Synechococcus 7942中表達(dá)了植物的乙烯合成酶基因；Takeshima(Proc.Natl.Acad.Sci USA 1994，919685～9689)在Synechococcus 7942中表達(dá)了合成的人過氧化物歧化酶基因(h-SOD)，產(chǎn)物占總蛋白量的3％，并且有良好的胞內(nèi)生物活性；孫軍等(生物工程進(jìn)展，1994，14(6)39～42)在Anabaena 7120中表達(dá)了小鼠的金屬硫蛋白基因(mt-1)。這些研究工作表明包括真核基因在內(nèi)的外源基因能在藍(lán)藻中表達(dá)。
胸腺(Thymus)是免疫系統(tǒng)中重要的中樞器官，負(fù)責(zé)T細(xì)胞的分化和成熟，在抗感染、抗腫瘤和抗自身免疫性疾病中起著重要作用。從胸腺素混合物中分離出的胸腺素α1(Tα1)，是一個(gè)二十八肽，它可以預(yù)防免疫抑制病人感染條件致病菌，提高機(jī)體的細(xì)胞免疫能力，可用于治療多種疾病如紅斑狼瘡、乙肝、艾滋病等，還可作為治療某些癌癥的輔助藥物?，F(xiàn)在胸腺素制劑已廣泛應(yīng)用于臨床，但均是從豬、牛的胸腺中提取的多組分胸腺肽，提取時(shí)易混入豬、牛的某些蛋白，注射后可能導(dǎo)致人產(chǎn)生過敏反應(yīng)。采用人胚胎提取的人胸腺素雖療效不錯(cuò)，但人胚胎來源困難，難以形成規(guī)模生產(chǎn)。用多肽合成儀可合成胸腺素αx，但價(jià)格太貴。王震熙等(浙江醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，18(3)106～109)把Tα1基因?qū)隤WR590菌株，用SPA-ELISA改良法在轉(zhuǎn)化的菌株中檢測到Tα1的表達(dá)；Wetzel等(Biochemistry1980，196096～6104)根據(jù)Low和Goldstein(1979)確定的氨基酸序列人工合成了Tα1基因，與質(zhì)粒pBR322連接后導(dǎo)入E.coli中表達(dá)，雖得到與天然Tα1活性相同的表達(dá)產(chǎn)物，但表達(dá)量低。
本發(fā)明的目的旨在提供一種利用基因整合平臺(tái)系統(tǒng)，將人胸腺素α1基因與泛素(UB)基因融合后定位整合到絲狀藍(lán)藻Calothrix 7601的染色體中，并用紅光誘導(dǎo)的cpc2啟動(dòng)子啟動(dòng)其表達(dá)，以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)胸腺素α1的方法。
本發(fā)明的具體方案實(shí)現(xiàn)步驟如下
一．cpc2啟動(dòng)區(qū)(P)和同源DNA片段(L和R)的克隆根據(jù)絲狀藍(lán)藻Calothrix 7601的cpc2操縱子的啟動(dòng)區(qū)P以及同源片段L和R這三個(gè)片段兩端的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)三對(duì)PCR引物P1和P2，L1和L2，R1和R2，其序列如下P1(5’端引物)5’-GCGTCGACGAATTGTAAGAA-3’SalⅠ(20Nts)P2(3’端引物)5’-ATGCATGCTCCAGCATCTCCTA-3’SphⅠ (22Nts)L1(5’端引物)5’-CGGAATTCTGCTATTAGTCCGC-3’EcoRⅠ (22Nts)L2(3’端引物)5’-CGGTCGACGCCCTCGGTTAAAGGTGT-3’SalⅠ (26Nts)R1(5’端引物)5’-CGGTCGACTGTAGCTCCTTAATGTC-3’SalⅠ (25Nts)R2(3’端引物)5’-CCTAAGCTTTCTTGATATTCGGCTG-3’HindⅢ (25Nts)其中啟動(dòng)區(qū)左端引物P2設(shè)計(jì)了一個(gè)SphⅠ酶切位點(diǎn)，其序列為GCATG↓C。
以Calothrix 7601的染色體DNA為模板，按常規(guī)的PCR技術(shù)分別擴(kuò)增出片段P(0．6Kb)，片段L(1.2Kb)和片段R(1.2Kb)。
按


圖1所示的設(shè)計(jì)，根據(jù)引物中的酶切位點(diǎn)，用SphⅠ和SalⅠ同時(shí)雙酶切片段P和載體pUC19，用HindⅢ和SalⅠ同時(shí)雙酶切片段R和載體pUC19，然后分別用T4DNA連接酶連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM101，用藍(lán)白篩選得到白色克隆子，獲得了重組質(zhì)粒pUCP和pUCR。另按
圖1設(shè)計(jì)，用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切片段L和上述重組質(zhì)粒pUCP后連接，獲得了重組質(zhì)粒pULP。
二．外源供體片段DNA的克隆1．報(bào)告基因(Kmr)和終止區(qū)(rbcS polyA)的克隆選擇含有報(bào)告基因(卡那霉素抗性基因-Kmr)和終止區(qū)(rbcS polyA)這兩個(gè)片段的質(zhì)粒pKYLX71，按圖2所示的設(shè)計(jì)，用XbaⅠ和SalⅠ雙酶切pKYLX71，膠回收4.8Kb的DNA片段，與經(jīng)同樣雙酶切的pUCR連接，連接物轉(zhuǎn)化E.coli JM101，以含有Ap和Km的雙抗培養(yǎng)基篩選，獲得重組質(zhì)粒pUKR。
2．目的基因(UBTα1)的獲得及克隆首先按Tα1基因的序列設(shè)計(jì)了以下PCR引物T1、T2和T2’T1(5’端片段)5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTGTTSphⅠBamⅠGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’(65Nts)T2(3’端片段)5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCT TCAACSpeⅠ
AACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’ (65Nts)T2’(3’端引物)為T2之5’端的前25個(gè)核苷酸。
按常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得Tα1片段。以質(zhì)粒pUCUB(將合成的UB基因克隆至pUC18質(zhì)粒的SphⅠ/BamHⅠ位點(diǎn)之間所構(gòu)建成的質(zhì)粒)為模板，引物為U1(通用引物M13/pUCReverse Sequencing Primer(-48))和U2(通用引物M13/pUC Sequencing Primer(-47))，按常規(guī)PCR方法擴(kuò)增獲得UB片段。用BamHⅠ酶切Tα1和UB片段后連接，再以上述連接物為模板，以U1和T2’為引物擴(kuò)增獲得UBTα1片段。
按圖3所示的設(shè)計(jì)，用XbaⅠ和HindⅢ不完全酶切pUKR，回收6.0Kb片段；用SphⅠ和SpeⅠ雙酶切目的基因UBTα1；用SphⅠ和HindⅢ雙酶切pULP，將以上三種酶切片段混合后連接，轉(zhuǎn)化，以Ap和Km雙抗篩選，獲得供體質(zhì)粒pUTK。
三、供體質(zhì)粒pUTK電激轉(zhuǎn)化Calothrix7601用EcoRⅠ完全酶切pUTK，獲得線狀質(zhì)粒pUTK，在電壓0.4～2.0kv，電阻100～200Ω，時(shí)間2.5～5.0ms、電容25μF的條件下電激轉(zhuǎn)化藍(lán)藻Calothrix 7601，將經(jīng)電激處理后的轉(zhuǎn)化藻株經(jīng)培養(yǎng)，以Km篩選，獲得轉(zhuǎn)UBTα1基因的藻株。
轉(zhuǎn)化藻株對(duì)Km的抗性皆超過40ug/ml，最高可達(dá)80ug/ml，并在轉(zhuǎn)接若干次之后仍基本保持不變。經(jīng)PCR證明，目的基因UBTα1基因已整合在Calothrix 7601的染色體上，可隨染色體的復(fù)制而復(fù)制；經(jīng)Western雜交證實(shí)，融合蛋白確有表達(dá)。
本發(fā)明按設(shè)計(jì)從藍(lán)藻Calothrix 7601染色體DNA上PCR擴(kuò)增出藻藍(lán)蛋白cpc2啟動(dòng)區(qū)、整合平臺(tái)同源片段L和R，組裝了含cpc2啟動(dòng)子、UBTα1目的基因、rbcS終止子、Kmr報(bào)告基因和基因平臺(tái)同源序列等元件的供體質(zhì)粒pUTK，建立了Calothrix 7601新的基因整合平臺(tái)系統(tǒng)，獲得了轉(zhuǎn)UBTα1基因的藻株，并從轉(zhuǎn)化藻株中檢測到Tα1基因的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明以藍(lán)藻作為新型轉(zhuǎn)基因受體和生物反應(yīng)器，使人的胸腺素α1基因在其中表達(dá)，為大量生產(chǎn)開發(fā)轉(zhuǎn)Tα1基因藍(lán)藻打下了基礎(chǔ)，其工藝簡單，成本低，具有很大的開發(fā)應(yīng)用前景。
圖1為重組質(zhì)粒pUCP，pULP及pUCR的構(gòu)建設(shè)計(jì)圖。
圖2為重組質(zhì)粒pUKR的構(gòu)建設(shè)計(jì)圖。
圖3為供體質(zhì)粒pUTK的構(gòu)建設(shè)計(jì)圖。
圖4為供體質(zhì)粒pUTK整合至Calothrix7601染色體示意圖。
下面由實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。步驟一、cpc2啟動(dòng)區(qū)(P)和同源DNA片段(L和R)的克隆1．各片段的PCR擴(kuò)增1．1 cpc2啟動(dòng)區(qū)P(630bp)的PCR擴(kuò)增首先根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)合成cpcB2A2啟動(dòng)區(qū)(P)引物，在引物上設(shè)計(jì)了SalⅠ和SphⅠ的酶切位點(diǎn)。P1(5’端引物)5’-GCGTCGACGAATTGTAAGAA-3’salⅠ(20Nts)
P2(3’端引物)5’-ATGCATGCTCCAGCATCTCCTA-3’SphⅠ (22Nts)在0.5ml無菌離心管中依次加入ddH2O 37ul，10×Taq酶緩沖液5ul，4×dNTP(2.5 mmol/L)4ul，P1引物1ul，P2引物1ul，模板(藍(lán)藻基因組DNA)1ul，Taq酶(1u/ul)1ul，總體積50ul，最后另加石蠟油50ul覆蓋。
PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置94℃預(yù)變性，5min；然后94℃變性，45S；50℃復(fù)性，45S；72℃延伸，45S；30個(gè)循環(huán)最后72℃延伸，5min。
反應(yīng)結(jié)束后，取5ul進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在電泳圖譜上出現(xiàn)唯一的一條符合預(yù)期大小的0.6Kb片段，表明這個(gè)擴(kuò)增片段就是所要的啟動(dòng)區(qū)片段。
1．2同源片段L(1.2Kb)的PCR擴(kuò)增同樣設(shè)計(jì)了cpc2左側(cè)同源區(qū)(L)引物，分別也設(shè)計(jì)了SalⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)L1(5’端)5’-CGGAATTCTGCTATTAGTCCGC-3’EeoRⅠ (22Nts)L2(3’端)5’-CGGTCGACGCCCTCGGTTAAAGGTGT-3’SalⅠ (26Nts)除引物改為L1，L2，延伸時(shí)間改為75S之外，其余均同1．1，在電泳圖譜上出現(xiàn)唯一的一條符合預(yù)期大小的1.2Kb片段，表明這擴(kuò)增片段就是所要的L片段。
1．3同源片段R(1.2Kb)的PCR擴(kuò)增同樣設(shè)計(jì)了cpc2右側(cè)同源區(qū)(R)引物，分別也設(shè)計(jì)了SalⅠ和HindⅢ位點(diǎn)R1(5’端)5’-CGGTCGACTGTAGCTCCTTAATGTC-3’SalⅠ (25Nts)R2(3’端)5’-CCTAAGCTTTCTTGATATTCGGCTG-3’HindⅢ(25Nts)除引物改為R1，R2外，其余均同1．2。在電泳圖譜上出現(xiàn)唯一的一條符合預(yù)期大小的1.2Kb片段，表明這個(gè)擴(kuò)增片段就是所要的R片段。2．各片段PCR產(chǎn)物的克隆2．1從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下，切下含有所需DNA大小片段的凝膠，用膠回收試劑盒回收DNA片段，-20℃保存?zhèn)溆谩?．2 PCR產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化(1)按照PCR片段兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR片段的雙酶切，與同樣雙酶切的載體(如pUC19質(zhì)粒)混合，加T4DNA連接酶12℃連接過夜。
其中按
圖1設(shè)計(jì)，根據(jù)引物中的酶切位點(diǎn)，用SphⅠ和SalⅠ同時(shí)雙酶切片段P和載體pUCl9，用HindⅢ和SalⅠ同時(shí)雙酶切片段R和載體pUC19，然后分別用T4DNA連接酶連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM101。另按
圖1設(shè)計(jì)，用EcoRⅠ和
SalⅠ雙酶切片段L和上述重組有P片段的質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化。
(2)在200ul感受態(tài)細(xì)胞(采用CaCl2法制備)中加入5ul連接的DNA，混勻，冰浴30min。
(3)42℃水浴2min，再冰浴2min，加入800ul LB液體培養(yǎng)基，37℃輕搖1hr。
(4)取200ul置于另一管中，加入4ul IPTG(200mg/ml)和40ul X-gal(20mg/ml)，混勻后涂布LB平板(含Ap 100ug/ml)，37℃培養(yǎng)10hr左右。
2．3重組子的篩選和鑒定(1)通過藍(lán)白篩選，初步挑出若干白色菌落，接種于4ml LB(含Ap 100 ug/ml)液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
(2)小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果分別獲得了預(yù)期的重組質(zhì)粒pUCP、pUCR和pULP。pUCP能被SalⅠ單酶切成3.3Kb片段，被SphⅠ和SalⅠ雙酶切成2.7Kb和0.6Kb兩個(gè)片段。pUCR可被SalⅠ或PstⅠ(PstⅠ在片段R中只有單一酶切位點(diǎn))單酶切成3.9Kb片段，被HindⅢ和SalⅠ雙酶切成2.7Kb和1.2Kb兩個(gè)片段。pULP可被SalⅠ單酶切成3.9Kb片段，被EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切成2.7Kb和1.2Kb兩個(gè)片段。再分別以重組質(zhì)粒pUCP、pUCR、pULP為模板擴(kuò)增片段P，R和L，結(jié)果也都獲得了預(yù)期長度大小的片段。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含有cpc2基因啟動(dòng)區(qū)(P)和同源DNA片段L和R的克隆子已經(jīng)成功獲得。步驟二、外源供體片段DNA的克隆1．報(bào)告基因(卡那霉素-Kmr)和終止區(qū)(rbcS polyA)的克隆質(zhì)粒pKYLX71含有這兩個(gè)片段。按圖2設(shè)計(jì)，用XbaⅠ和SalⅠ雙酶切pKYLX71，膠回收4.8Kb的DNA片段，與經(jīng)同樣雙酶切的pUCR混合，加T4DNA連接酶12℃連接過夜，連接物轉(zhuǎn)化E.coli JM101，以含有Ap和Km的雙抗培養(yǎng)基篩選，獲得若干克隆子。分別提取其質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果獲得了預(yù)期的8.7kb的重組質(zhì)粒pUKR。它可被SalⅠ單酶切成8.7kb片段，被HindⅢ切成6.3Kb和2.4Kb片段，被XbaⅠ切成5.3Kb和3.4Kb片段。2．目的基因(UBTα1)的獲得及克隆2．1胸腺素α1(Tα1)基因(110bp)的PCR擴(kuò)增首先按Tα1基因的序列設(shè)計(jì)了PCR引物T1、T2和T2’T1(5’端片段)5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTGTTSphⅠ BamHⅠGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’(65Nts)T2(3’端片段)5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCAACSpeⅠAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’(65Nts)T2’(3’端引物)為T2之5’端的前25個(gè)核苷酸。
取T1和T2引物各2ul，加ddH2O至10ul，再加石蠟油30ul；先升至85℃，5min然后以1℃/lmin的速度冷卻至25℃；再依次加入ddH2O 30ul，10×Taq酶緩沖液5ul4×dNTP(2.5mmol/L)4ul，Taq酶(1u/ul)1ulPCR反應(yīng)參數(shù)先94℃預(yù)變性5min；接著94℃變性30S；60℃復(fù)性兼延伸20S
10個(gè)循環(huán)；最后60℃再延伸反應(yīng)20S。
反應(yīng)結(jié)束后，取3ul進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得110bp的Tα1片段。2．2 UB片段(345bp)的PCR擴(kuò)增除模板改為質(zhì)粒pUCUB(由大連寶生物工程公司合成UB基因并將其克隆至pUC18質(zhì)粒的SphⅠ/BamHⅠ位點(diǎn)之間所構(gòu)建成的質(zhì)粒)，引物改為U1(通用引物M13/pUCReverse Sequencing Primer(-48))和U2(通用引物M13/pUC Sequencing Primer(-47))外，其余反應(yīng)組分同2．1；PCR反應(yīng)參數(shù)先94℃預(yù)變性5min；94℃變性30S；50℃復(fù)性30S72℃延伸30S；30個(gè)循環(huán)最后72℃再延伸反應(yīng)3min。
反應(yīng)結(jié)束后，取5ul進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得345bp的UB片段。2．3 UBTα1片段(388bp)的PCR及克隆用BamHⅠ酶切Tα1和UB片段后連接，再以上述連接物為模板，以U1和T2’為引物擴(kuò)增獲得UBTα1片段。
UBTα1片段的PCR反應(yīng)，除模板改為UB與Tα1之連接物，引物改為U1和T2’外，其余反應(yīng)組分及反應(yīng)參數(shù)同2．2。
根據(jù)圖3設(shè)計(jì)，用XbaⅠ和HindⅢ不完全酶切pUKR，回收6.0Kb片段，其中包含終止區(qū)、Km篩選報(bào)告基因和整合同源片段R用SphⅠ和SpeⅠ雙酶切目的基因UB-Tα1；用SphⅠ和HindⅢ雙酶切pULP。將以上三種酶切片段混合后連接，轉(zhuǎn)化，以Ap和Km雙抗篩選，挑取若干轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切分析鑒定，成功獲得了預(yù)期的供體質(zhì)粒pUTK。它可被XbaⅠ酶切成10.8Kb片段，被HindⅢ酶切成8.3Kb和2.5Kb片段，被SalⅠ酶切成5.7Kb和5.1Kb片段。步驟三、供體質(zhì)粒pUTK電激轉(zhuǎn)化Calothrix7601用經(jīng)EcoRⅠ(質(zhì)粒pUTK上此酶位點(diǎn)位于同源片斷L與pUC19片斷連接處)′完全酶切所得的線狀pUTK轉(zhuǎn)化Calothrix 7601，設(shè)兩個(gè)對(duì)照，對(duì)照1是空白，即不含質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，對(duì)照2是用具Kmr基因的質(zhì)粒pKYLX71的轉(zhuǎn)化。
首先培養(yǎng)藍(lán)藻至A550=0.6左右。取100ml藻液離心濃縮成3ml，超聲處理30s(功率3)。離心收集藻細(xì)胞，用預(yù)冷的1.0 mmol/L HEPES(pH7.2)緩沖液離心洗滌兩次。將藻細(xì)胞懸浮在預(yù)冷的1.0mmol/L HEPES(pH7.2)緩沖液中。加入DNA至終濃度為10ug/ml。取40ul含DNA的藻細(xì)胞懸浮液，加入到預(yù)冷的無菌的一次性電激杯(規(guī)格1mm)中。預(yù)置電激儀的各參數(shù)(參見表1)，裝上電激杯，電激。
表1電激參數(shù)(陽性和陰性對(duì)照僅使用C、H兩種條件)
將電激處理后的藻細(xì)胞懸浮液立即轉(zhuǎn)入20ml BG.11液體培養(yǎng)基(含Km 20 ug/ml)中培養(yǎng)，每天補(bǔ)充4ug／ml Km，以補(bǔ)充培養(yǎng)過程中自然分解掉的Km。經(jīng)常搖動(dòng)，培養(yǎng)10天。選取生長良好的三瓶藻液，各吸取100ul藻液，涂布在BG-11平板上(含1.5％瓊脂，Km20ug/ml)，培養(yǎng)10天。挑出生長最好的5個(gè)克隆子，轉(zhuǎn)入20ml BG-11液體培養(yǎng)基中(含Km20ug/ml)，經(jīng)常搖動(dòng)，培養(yǎng)10天。從克隆藻株培養(yǎng)液中各吸取1ml藻液，分別加入到含不同濃度Km(分別為5，10，20，30，40，50，60，70，80 ug/ml)的20ml BG-11液體培養(yǎng)基中，經(jīng)常搖動(dòng)，培養(yǎng)lO天。根據(jù)生長狀況，判定各克隆藻株抗Km的最高濃度。選取抗性最高的克隆子進(jìn)行較大量的培養(yǎng)(200ml)。每隔10天轉(zhuǎn)接一次保種。
在克隆子的篩選并測定中選克隆子的Km抗性實(shí)驗(yàn)中，各克隆子在不同Km濃度下的生長狀況不一，結(jié)果顯示供試的五個(gè)克隆藻株抗Km的最高濃度可達(dá)80ug/ml，最低濃度亦有40ug/ml；而對(duì)照組藻株抗Km的濃度低于5ug/ml，與Calothrix 7601的基礎(chǔ)抗性一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有用pUTK轉(zhuǎn)化的藍(lán)藻出現(xiàn)了抗Km的克隆子，另兩個(gè)對(duì)照均未出現(xiàn)克隆子。pKYLX71雖含有Kmr基因，但不具備藍(lán)藻質(zhì)粒的起始復(fù)制子，所以不能在藍(lán)藻中復(fù)制。pUTK盡管也沒有藍(lán)藻質(zhì)粒的起始復(fù)制子，但出現(xiàn)了抗Km的克隆子，這表明含Kmr基因的供體DNA片段已整合在Calothrix 7601的染色體上，隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，并表達(dá)出Km抗性。
為了驗(yàn)證藍(lán)藻的轉(zhuǎn)基因是否成功，我們對(duì)轉(zhuǎn)化藻株進(jìn)行PCR鑒定，分別提取野生藻株和轉(zhuǎn)化藻株2的染色體DNA，以其為模板，以P1和T2’為引物擴(kuò)增，結(jié)果前者無帶出現(xiàn)，而后者出現(xiàn)單一條帶，其長度約0.9Kb，此結(jié)果符合cpc2啟動(dòng)子(P)和所要表達(dá)的外源基因(UBT α1)的長度之和，初步證明P-UBTα1基因已整合在Calothrix7601的染色體上。
為進(jìn)一步證明所整合的UBTα1，基因能有效表達(dá)，采用Western雜交鑒定，第一抗體采用Tα1抗體。表達(dá)檢測首先要對(duì)藍(lán)藻Calothrix 7601進(jìn)行誘導(dǎo)，當(dāng)Calothrix 7601培養(yǎng)到A550=0.8左右時(shí)，取10ml在紅光中處理30min。接著要制樣以及電泳檢測，離心取藻體，置于一預(yù)先稱重的管中，稱出藻重，加入1倍量(V/W)的制樣緩沖液和1倍量(V/W)的上樣緩沖液，沸水浴5min，離心，取上清液，置-20℃保存?zhèn)溆?。檢測樣品的表達(dá)量可以用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)方法進(jìn)行(1)制膠15％分離膠，5％濃縮膠(2)電泳將樣品沸水浴3min后加至凝膠點(diǎn)樣孔中，先用50V電壓電泳，待溴酚蘭跑出濃縮膠后，將電壓增至100V，當(dāng)溴酚蘭跑至凝膠邊緣時(shí)停止電泳。
電轉(zhuǎn)移(印漬)先取出膠，浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。剪取與凝膠等大的PVDF膜，先在無水甲醇中潤濕，再在電轉(zhuǎn)緩沖液中浸泡；另剪六張與膜等大的濾紙，浸于電轉(zhuǎn)緩沖液中；將電轉(zhuǎn)儀中的海綿也浸于電轉(zhuǎn)緩沖液中。將海綿、濾紙(3張)、凝膠、膜、濾紙(3張)、海綿按順序放好，注意避免氣泡，邊界對(duì)齊，然后用篩孔板固定，插入電轉(zhuǎn)移槽中，凝膠在陰極方向，膜在陽極方向。加入電轉(zhuǎn)緩沖液，4℃，100V，轉(zhuǎn)移1hr。
免疫學(xué)檢測先將膜置于TNT緩沖液中洗3次，每次5min。轉(zhuǎn)入封閉液中，37℃輕搖30min。置TNT緩沖液中漂洗3次，每次5min。加入用TNT緩沖液稀釋的兔抗UB抗體，37℃輕搖1hr。置TNT緩沖液中漂洗3次，每次5min。加入用TNT緩沖液稀釋的羊抗兔IgG-HRP，37℃輕搖1hr。置TNT緩沖液中漂洗4次，每次5min。加入TMB底物液，顯色15min，出現(xiàn)藍(lán)色條帶者為陽性，用水沖洗以終止反應(yīng)，取出晾干，拍照。
按上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)移、雜交和顯色，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化藻株出現(xiàn)了與陽性對(duì)照(Tα1)位置差不多的帶，說明轉(zhuǎn)化藻株確有表達(dá)出Tα1蛋白。
權(quán)利要求
1．運(yùn)用基因整合平臺(tái)系統(tǒng)進(jìn)行藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因及表達(dá)胸腺素α1的方法，其特征在于按設(shè)計(jì)從藍(lán)藻Calothrix 7601染色體DNA上PCR擴(kuò)增出藻藍(lán)蛋白cpc2啟動(dòng)區(qū)、整合平臺(tái)同源片段L和R，組裝了含cpc2啟動(dòng)子、UBTα1目的基因、rbcS終止子、Kmr報(bào)告基因和基因平臺(tái)同源序列等元件的供體質(zhì)粒pUTK，建立了Calothrix 7601新的基因整合平臺(tái)系統(tǒng)，獲得了轉(zhuǎn)UBTα1基因的藻株，其具體方法步驟如下(1)cpc2啟動(dòng)區(qū)(P)和同源DNA片段(L和R)的克隆根據(jù)絲狀藍(lán)藻Calothrix 7601的cpc2操縱子的啟動(dòng)區(qū)P以及同源片段L和R這三個(gè)片段兩端的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)三對(duì)PCR引物P1和P2，L1和L2，R1和R2，其序列如下P1(5’端引物)5’-GCGTCGACGAATTGTAAGAA-3’SalⅠP2(3’端引物)5’-ATGCATGCTCCAGCATCTCCTA-3’SphⅠL1(5’端引物)5’-CGGAATTCTGCTATTAGTCCGC-3’EcoRⅠL2(3’端引物)5’-CGGTCGACGCCCTCGGTTAAAGGTGT-3’SalⅠR1(5’端)5’-CGGTCGACTGTAGCTCCTTAATGTC-3’SalⅠR2(3’端)5’-CCTAAGCTTTCTTGATATTCGGCTG-3’HindⅢ其中啟動(dòng)區(qū)左端引物P2設(shè)計(jì)了一個(gè)SphⅠ酶切位點(diǎn)，其序列為GCATG↓C，以Calothrix7601的染色體DNA為模板，按常規(guī)的PCR技術(shù)分別擴(kuò)增出0.6kb片段P，1.2kb片段L和1.2kb片段R；根據(jù)引物中的酶切位點(diǎn)，用SphⅠ和SalⅠ同時(shí)雙酶切片段P和載體pUC19，然后用T4DNA連接酶連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌E．coli JM101，用藍(lán)白篩選得到白色克隆子，得重組質(zhì)粒pUCP；用HindⅢ和SalⅠ同時(shí)雙酶切片段R和載體pUC19，然后用T4DNA連接酶連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM101，用藍(lán)白篩選得到白色克隆子，得重組質(zhì)粒pUCR；用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切片段L和重組質(zhì)粒pUCP后，用T4DNA連接酶連接，連接物轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM101，用藍(lán)白篩選得到白色克隆子，得重組質(zhì)粒pULP；(2)外源供體片段DNA的克隆a．卡那霉素-Kmr報(bào)告基因和rbcS polyA終止區(qū)的克隆選擇含有報(bào)告基因卡那霉素-Kmr和終止區(qū)rbcS polyA兩個(gè)片段的質(zhì)粒pKYLX71，用XbaⅠ和SalⅠ雙酶切pKYLX71，膠回收4.8Kb的DNA片段，與經(jīng)同樣雙酶切的重組質(zhì)粒pUCR連接，連接物轉(zhuǎn)化E.coli JM101，以含有Ap和Km的雙抗培養(yǎng)基篩選，獲得了8.7kb的重組質(zhì)粒pUKR；b．目的基因UBTα1的獲得及克隆按Tα1基因的序列設(shè)計(jì)了以下PCR引物T1、T2和T2’T1(5’端片段)5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTGTTSphⅠBarnHⅠGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3(65Nts)T2(3’端片段)5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCAACSpeⅠAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’(65Nts)T2’(3’端引物)為T2之5’端的前25個(gè)核苷酸以T1和T2為引物，按常規(guī)PCR擴(kuò)增得Tα1片段，以質(zhì)粒pUCUB為模板，引物為U1和U2，PCR擴(kuò)增出UB片段，用BamHⅠ酶切Tα1和UB片段后連接，再以此連接物為模板，以U1和T2’為引物擴(kuò)增獲得UBTα1片段。用XbaⅠ和HindⅢ不完全酶切pUKR，回收6.0Kb片段，用SphⅠ和SpeⅠ雙酶切目的基因UBTα1；用SphⅠ和HindⅢ雙酶切pULP，將以上三種酶切片段混合后連接，轉(zhuǎn)化，以Ap和Km雙抗篩選，獲得了供體質(zhì)粒pUTK；(3)供體質(zhì)粒pUTK電激轉(zhuǎn)化Calothrix 7601用EcoRⅠ完全酶切pUTK，獲得線狀質(zhì)粒pUTK，在電壓0.4～2.0kv，電阻100～200Ω，時(shí)間2.5～5.0ms、電容25μF的條件下電激轉(zhuǎn)化藍(lán)藻Calothrix 7601，將經(jīng)電激處理后的轉(zhuǎn)化藻株經(jīng)培養(yǎng)，以Km篩選，獲得轉(zhuǎn)UBTα1基因的藻株。
2．如權(quán)力要求1所述的運(yùn)用基因整合平臺(tái)系統(tǒng)進(jìn)行藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因及表達(dá)胸腺素α1的方法，其特征在于所說的質(zhì)粒pUCUB為將UB基因克隆至pUC18質(zhì)粒的SphⅠ/BamHⅠ位點(diǎn)之間所構(gòu)建的質(zhì)粒。
3．如權(quán)力要求1所述的運(yùn)用基因整合平臺(tái)系統(tǒng)進(jìn)行藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因及表達(dá)胸腺素α1的方法，其特征在于所說的引物U1為通用引物M13/pUC Reverse Sequencing Primer(-48)，引物U2為通用引物M13/pUC Sequencing Primer(-47)。
全文摘要
涉及一種基因工程,從藍(lán)藻Calothrix7601染色體DNA上PCR擴(kuò)增出cpc2啟動(dòng)區(qū)、整合平臺(tái)同源片段L和R,組裝了含cpc2啟動(dòng)區(qū)、UBTα
文檔編號(hào)C12N15/31GK1285408SQ00124700
公開日2001年2月28日 申請(qǐng)日期2000年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月29日
發(fā)明者章軍, 樓士林, 徐虹, 羅田 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)