專(zhuān)利名稱(chēng)：HLA-B*1502基因的SYBR Green I檢測(cè)方法及其專(zhuān)用引物與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中目的基因的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，特別是涉及 HLA-B^l502基因的STOR Green I檢測(cè)方法及其專(zhuān)用引物與試劑盒。
背景技術(shù)：
藥物不良反應(yīng)(ADR)指正常劑量的藥物用于預(yù)防、診斷、治療疾病或調(diào)節(jié)生理機(jī)能時(shí)出現(xiàn)的有害的和與用藥目的無(wú)關(guān)的反應(yīng)。部分ADR較輕微，但有些ADR可導(dǎo)致延長(zhǎng)住院期、終生殘疾甚至死亡?？拱d癇藥物是引起皮膚型不良反應(yīng)的常見(jiàn)因素。皮膚型不良反應(yīng)包括輕度的斑丘疹及危及生命的嚴(yán)重不良反應(yīng)如史蒂文斯-約翰遜綜合征(Stevens Johnson syndrome, SJS)和中毒性表皮壞死溶解癥(toxic印idermal necrolysis, TEN)等?？R西平是一種臨床上廣泛使用的治療癲癇、躁狂抑郁癥及神經(jīng)病理性疼痛(如牙疼、偏頭痛、 帶狀皰疹等)的藥物，也是臨床上常見(jiàn)的引起嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)的因素。2007年12月12 日，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)發(fā)布了關(guān)于卡馬西平的安全性信息，信息稱(chēng)，服用卡馬西平(carbamaz印ine)可引起嚴(yán)重的皮膚不良反應(yīng)(即SJS和TEN，這兩種病癥是嚴(yán)重的皮膚和粘膜反應(yīng)，可導(dǎo)致永久性殘疾甚至致命)而這種過(guò)敏反應(yīng)在含人白細(xì)胞抗原等位基因HLA-B*1502的患者中更容易發(fā)生。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析顯示，HLA-B^l502 等位基因與卡馬西平敏感引起的嚴(yán)重皮膚不良反應(yīng)具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。服用卡馬西平者， 如具有HLA-B*1502基因，其產(chǎn)生史蒂芬強(qiáng)森癥候群毒性表皮溶解(SJS/TEN)的風(fēng)險(xiǎn)是無(wú) HLA-B*1502基因患者的800倍以上。HLA_B*1502基因幾乎僅見(jiàn)于亞裔血統(tǒng)中(包括南亞的印度人)。在中國(guó)、泰國(guó)、馬來(lái)西亞、印度尼西亞、菲律賓和臺(tái)灣部分地區(qū)人群中，有10-15% 攜帶HLA-B*1502基因，而歐洲人群中，概率僅為_(kāi)2%。因此，在服用卡馬西平等抗癲癇藥物的亞裔人群中，開(kāi)展HLA-B*1502基因的檢測(cè)，對(duì)預(yù)防可能發(fā)生的嚴(yán)重皮膚過(guò)敏反應(yīng)具有十分重要的臨床意義。人白細(xì)胞抗原等位基因HLA_B*1502位于人類(lèi)第六條染色體上，屬于人類(lèi)白細(xì)胞抗原HLA中的一型。目前，檢測(cè)HLA-B*1502基因的方法主要有流式細(xì)胞儀檢測(cè)法和SSP法。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)法主要檢測(cè)的是細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，通過(guò)抗原表達(dá)的百分比，來(lái)確定是否具有該基因的表型。這種方法的缺陷在于結(jié)果的穩(wěn)定性上。因?yàn)樵谶M(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)前，需對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理的方法及預(yù)處理的時(shí)間上的不同，有時(shí)候會(huì)影響細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，從而影響最終的結(jié)果判斷，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果上的差異，容易造成漏檢或其它情況。SSP法檢測(cè)的是基因型，而不是看該基因的表達(dá)，所以從結(jié)果上來(lái)說(shuō)，確定性和唯一性會(huì)比流式細(xì)胞檢測(cè)的方法要好，即只要存在該基因，通過(guò)設(shè)計(jì)好的特異性引物，即可結(jié)合引物的擴(kuò)增情況，判讀最終結(jié)果。SSP方法的缺點(diǎn)主要在于結(jié)果檢測(cè)起來(lái)不夠簡(jiǎn)便，擴(kuò)增后的產(chǎn)物需要進(jìn)行電泳，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且在需要檢驗(yàn)人員在目的條帶的判讀上具有一定的經(jīng)驗(yàn)。SSP方法的另一個(gè)缺點(diǎn)在于通常需要幾管引物才能區(qū)分出HLA-B*1502的基因，引物的設(shè)計(jì)上也要多方面的考量，保證擴(kuò)增片段的特異性。申請(qǐng)?zhí)枮?00810026919. 2的專(zhuān)利公開(kāi)了一種檢測(cè)HLA-B*1502的方法，該方法需要6管引物才能做一人份檢測(cè)，該方法也可算作是通過(guò)SSP的方法檢測(cè)基因型，但在引物設(shè)計(jì)上還有可改良的地方?？傮w而言，流式細(xì)胞儀的方法操作起來(lái)較為簡(jiǎn)便，但由于該方法是檢測(cè)抗原的表達(dá)，所以結(jié)果有可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作或其它因素導(dǎo)致偏差；而SSP法檢測(cè)的是基因型，結(jié)果唯一準(zhǔn)確，但通常需要多管引物， 并且需要電泳來(lái)檢測(cè)結(jié)果，操作而且起來(lái)較煩瑣，不太適用于臨床檢驗(yàn)。此外，由于B*1502 基因只有少數(shù)幾個(gè)堿基位點(diǎn)存在特異性(與其它序列高度相似的罕見(jiàn)型基因如B*1505、 B*1588、B*1531和B*1555的區(qū)別堿基)，在設(shè)計(jì)特異性引物后再無(wú)其它特異位點(diǎn)用以另行設(shè)計(jì)探針，因而也就不能應(yīng)用TaqMan探針的熒光法進(jìn)行B*1502基因的檢測(cè)。因次，市場(chǎng)上迫切需要一種特異性高、靈敏度高、省時(shí)省力的檢測(cè)HLA_B*1502基因的方法及其試劑盒。SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在一個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。STOR Green I熒光PCR檢測(cè)的基本過(guò)程是1、開(kāi)始反應(yīng)，當(dāng) SYBR Green I染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性時(shí)，STOR Green I染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過(guò)程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，STOR Green I染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈增量加大。SYBR Green I熒光染料能與所有的DNA雙鏈相結(jié)合，對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性，所以在PCR結(jié)束后，還需要進(jìn)行融解曲線的檢測(cè)，以確保雙鏈DNA產(chǎn)物的特異性。本發(fā)明提供了一種HLA-B* 1502基因的STOR Green I檢測(cè)方法，以解決目前 HLA-B*1502基因檢測(cè)方法特異性和靈敏度不高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于對(duì)HLA_B*1502基因進(jìn)行STOR Green I檢測(cè)的引物。本發(fā)明所提供的引物，是根據(jù)HLA_B*1502基因的的第2和第3外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)的，用以定性檢測(cè)待測(cè)樣品中的HLA-B*1502基因。具體來(lái)講，所述引物的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種特異性較高、靈敏度較高且省時(shí)省力的 HLA-B^l502基因的STOR Green I檢測(cè)方法。本發(fā)明所提供檢測(cè)方法，是以本發(fā)明的引物進(jìn)行的STOR Green I檢測(cè)方法，具體方法包括以下步驟1)提取受試者骨髓、外周血或組織的基因組DNA ；2)以步驟1)提取的受試者骨髓、外周血或組織的基因組DNA為模板，在所述引物的引導(dǎo)下進(jìn)行STOR Green I PCR擴(kuò)增，同時(shí)用序列表中SEQ ID NO :3所示的上游引物和 SEQ ID NO :4所示的下游引物對(duì)模板中的beta-actin內(nèi)參基因進(jìn)行SYBRGreen I PCR擴(kuò)增；3)擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果判讀1.出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，且當(dāng)內(nèi)參基因CT值小于或等于27，目的基因CT值小于或等于35時(shí)，如果兩者的CT差值小于等于7，那么結(jié)果為 HLA-B*1502陽(yáng)性，若兩者的CT差值大于7，則結(jié)果為陰性；2.當(dāng)內(nèi)參基因CT值小于或等于27時(shí)，目的基因CT值大于35或未出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，那么結(jié)果為陰性；3.若內(nèi)參基因的CT 值大于27，提示DNA模板量不足，或存在PCR的抑制因素，需要重新提取DNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在上述HLA-B*1502基因的SYBR Green I檢測(cè)方法中，所述步驟2)中的25 μ IPCR 反應(yīng)體系為2*PCR Mix 12. 5ul(購(gòu)自歐比特公司)，目的基因檢測(cè)mix(上、下游引物混合液，各1. 25ul，0. 4um/ul)或內(nèi)參基因檢測(cè)mix (上、下游引物混合液，各1. 25ul，0. 4um/ ul) 2. 5ul，樣品 DNA 2ul (50_100ng)，DEPC 水 8ul。所述步驟2)中的PCR反應(yīng)條件為先熱啟動(dòng)95°C lOmin，1個(gè)循環(huán)；然后變性 95°C 15sec，退火 71°C lmin，共；35 個(gè)循環(huán)；最后熔解 95 °C 15s, 60 °C lmin，95°C 30s， 60 °C 15s。為方便檢測(cè)，所述步驟幻中還包括用含有HLA_B*1502基因的陽(yáng)性對(duì)照品和不含 HLA-B*1502基因的陰性對(duì)照品作為模板進(jìn)行STOR Green I PCR擴(kuò)增的步驟。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于對(duì)HLA_B*1502基因進(jìn)行STOR Green I檢測(cè)的試劑盒。具體來(lái)講，本發(fā)明所提供的試劑盒包含2*PCR Mix,目的基因檢測(cè)mix(包含引物)，beta-actin內(nèi)參基因檢測(cè)mix (包含引物)和DEPC水。所述試劑盒中還可添加含有HLA_B*1502基因的陽(yáng)性對(duì)照品。本發(fā)明提供了一種HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測(cè)方法及其專(zhuān)用引物。 該方法是以待檢樣品中HLA-B*1502基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，用本發(fā)明的引物可特異性的擴(kuò)增出 HLA-B*1502基因的特異片段，該方法的特異性、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性均較好。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、首次建立了 HLA_B*1502基因的SYBR Green I檢測(cè)方法，利用此檢測(cè)方法可以快速地在1個(gè)半小時(shí)內(nèi)完成對(duì)待測(cè)樣本中的HLA-B*1502基因的檢測(cè)，利用STORGreen I熒光染料與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的其它優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需另外設(shè)計(jì)熒光探針，降低了實(shí)驗(yàn)成本，且適用性廣，對(duì)儀器的要求低，易于該方法的普遍推廣。2、本檢測(cè)方法通過(guò)特異性的引物設(shè)計(jì)，提高了擴(kuò)增片段的特異性，可以把B*1502 基因與其它序列高度相似的罕見(jiàn)型分開(kāi)，如B*1505、B*1588、B*1531和B*1555等。3、本檢測(cè)方法與HLA_B*1502基因的其它常規(guī)檢測(cè)方法，如流式細(xì)胞儀檢測(cè)法、 SSP法和TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法相比，具有操作程序簡(jiǎn)單易用的特點(diǎn)，并可進(jìn)一步制成檢測(cè)試劑盒，操作程序化，適合大面積推廣和應(yīng)用。4、本檢測(cè)方法不僅能夠評(píng)價(jià)人是否具有HLA_B*1502基因，同時(shí)也為SJS/TEN的流行病學(xué)、致病機(jī)理等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了依據(jù)。綜上所述，本發(fā)明能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出HLA_B*1502基因，對(duì)保障人類(lèi)健康和卡馬西平類(lèi)藥物的用藥安全意義重大。本發(fā)明的檢測(cè)方法及試劑盒可用于多種臨床樣本(骨髓、外周血或組織)中HLA-B*1502基因的核酸檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確唯一，無(wú)繁瑣的檢測(cè)步驟，判讀結(jié)果簡(jiǎn)單明了，并且試劑成本相對(duì)低廉，適應(yīng)市場(chǎng)推廣的需要，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為STOR-I和STOR-2引物擴(kuò)增效果及特異性檢測(cè)結(jié)果的融解曲線
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圖2A為0. 3um和0. 5um引物濃度下HLA-B^l502基因的SYBR Green I擴(kuò)增曲線圖2B為0. 3um引物濃度下HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測(cè)的熔解曲線圖2C為0. 5um引物濃度下HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測(cè)的熔解曲線圖2D為Ium引物濃度下HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測(cè)的熔解曲線圖 3 為 100ng、50ng、25ng、5ng 模板濃度下的 HLA-B^l502 基因的 SYBR GreenI 檢測(cè)的擴(kuò)增曲線圖4A和圖4B為用本發(fā)明HLA_B*1502基因的STOR Green I法檢測(cè)10份臨床樣本的結(jié)果圖5為本發(fā)明HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法的特異性檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook J.等人所編《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商建議的條件。所用引物由上海英杰有限公司合成，所有序列測(cè)定工作均由上海英杰有限公司完成。實(shí)施例1、用于對(duì)HLA_B*1502基因進(jìn)行STOR Green I檢測(cè)的引物的設(shè)計(jì)及篩選參照GenBank收錄的HLA_B*1502基因全序列，選擇HLA_B*1502基因的第2和第 3外顯子設(shè)計(jì)合成引物。引物設(shè)計(jì)中允許同一變異位點(diǎn)允許2個(gè)及2個(gè)以下簡(jiǎn)并堿基。在引物的篩選過(guò)程中均需選擇在目的保守區(qū)中PCR擴(kuò)增效率和STOR Green I染料結(jié)合效率較高的引物(所用PCR引物由上海英杰公司合成，引物要求PAGE純化。到貨時(shí)為引物干粉，用無(wú)菌水復(fù)溶后，對(duì)干粉進(jìn)行含量測(cè)定，引物至0. 4um/ul貯存液后備用)。針對(duì)HLA-B*1502基因，共設(shè)計(jì)了 2組上、下游引物(STOR-1和STOR-2)，同時(shí)還設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)beta-actin內(nèi)參基因的上、下游引物，序列如下SYBR-I上游弓丨物(SYBR-F' ) :5，_tggcaccgggagacacagatctccaa_3，；下游弓丨物(SYBR-R' ) :5，-gcagccgtacatgctctggag-3，。SYBR-2上游引物(STOR-F) 5，-accggaacacagatc tccaagaccaa-3，(序列表中 SEQ ID NO 1)；下游引物(SYBR-R):5，-tgccgtcgtaggcggactggtca-3，(序列表中 SEQ ID NO: 2)。beta-actin上游引物(beta-F):5，-ctgggacgacatggagaaaa-3‘(序列表中 SEQ ID NO:3)；下游引物(beta-R):5，-aaggaaggctggaagagtgc-3，(序列表中 SEQ ID NO :4)。SYBR-F'由洸個(gè)堿基組成，為HLA-B*1502基因自5，端第250-275位堿基，STOR-R， 由21個(gè)堿基組成，為HLA-B*1502基因自5，端第356-376位堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為368bp ； SYBR-F由沈個(gè)堿基組成，為HLA-B*1502基因自5，端第256-281位堿基，SYBR-R由23個(gè)堿基組成，為HLA-B*1502基因自5，端第411-433位堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為420bp ；beta-F由20個(gè)堿基組成，為beta-actin基因自5，端第305-3M位堿基，beta-R由20個(gè)堿基組成，為beta-actin基因自5，端第868-849位堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為564bp。使用購(gòu)自hvitrogen公司的基因組DNA提取試劑盒分別對(duì)不攜帶HLA_B*1502基因的3人(編號(hào)1、2、3)以及攜帶HLA-B*1502基因的3人(編號(hào)4、5、6)的外周血(骨髓或組織亦可)進(jìn)行基因組DNA提取，同時(shí)將核酸模板分裝后于-70°C保存。然后，以提取的受試者骨髓的基因組DNA為模板，分別在引物STOR-I和STOR-2的引導(dǎo)下進(jìn)行STOR Green I PCR擴(kuò)增，同時(shí)以beta-actin為內(nèi)參。25 μ 1 PCR篩選體系為2*PCR Mix(購(gòu)自歐比特公司)12. 5ul，目的基因檢測(cè)mix(上、下游引物混合液，各1. 25ul，0. 4um/ul)或內(nèi)參基因檢測(cè) mix (上、下游引物混合液，各 1. 25ul，0. 4um/ul) 2. 5ul，樣品 DNA 2ul (25-100ng)，用 DEPC水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25 μ 1。PCR程序?yàn)橄葻釂?dòng)95°C lOmin，1個(gè)循環(huán)；然后變性95°C 15sec, 退火 71°C lmin，共；35 個(gè)循環(huán)；最后熔解 95°C 15s，60°C lmin，95°C 30s，60°C 15s。擴(kuò)增結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增后的熒光信號(hào)強(qiáng)度及融解曲線來(lái)判斷引物的擴(kuò)增效果及特異性。結(jié)果如圖1所示(A為STOR-I引物組合的融解曲線，B為STOR-2引物組合的融解曲線；橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光值)，顯示第一組引物(STOR-I)的融解曲線存在著雜峰，表明引物的特異性不高，第二組引物(STOR-幻的融解曲線沒(méi)有雜峰，表明引物的特異性高。兩組引物的熒光信號(hào)差別不大。六分樣本獲得了與預(yù)期一致的結(jié)果。因此，將STOR-2 作為對(duì)HLA-B*1502基因進(jìn)行STOR Green I檢測(cè)的引物。實(shí)施例2、對(duì)HLA-B*1502基因進(jìn)行STOR Green I檢測(cè)的反應(yīng)體系的優(yōu)化一、引物用量的優(yōu)化引物濃度是影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素。若引物濃度低，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不完全。若引物太多，則發(fā)生錯(cuò)配及產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物的可能性就增大。上、下游的引物量選擇一致。引物濃度的范圍在0. I-Ium0實(shí)驗(yàn)中分別以0. 3um、0. 5um、Ium三個(gè)不同的引物濃度，針對(duì)同一模板(攜帶HLA-B*1502基因的患者的外周血基因組DNA)進(jìn)行STOR Green I檢測(cè)，除引物外反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實(shí)施例1相同。結(jié)果如圖2A-圖2D所示(圖2A為0. 3um和0. 5um引物濃度下的STOR Green I 擴(kuò)增曲線(曲線1為0. 5um,曲線2為0. 3um，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值)；圖2B為 0. 3um引物濃度下的熔解曲線圖，圖2C為0. 5um引物濃度下的熔解曲線，圖2D為Ium引物濃度下的熔解曲線圖，橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光值)，當(dāng)引物達(dá)到Ium時(shí)，熔解曲線會(huì)出現(xiàn)小的雜峰，而0. 3um與0. 5um的熔解曲線都很好，但0. 5um的CT值更低些，說(shuō)明模板的擴(kuò)增效率更高。所以采用0. 5um作為對(duì)HLA-B*1502基因進(jìn)行STOR Green I檢測(cè)的引物的終濃度。二、HLA_B*1502基因的STOR Green I檢測(cè)中PCR反應(yīng)體積和模板用量的選擇考慮到不同熒光PCR儀器之間的通用性能，本發(fā)明選擇25μ 1反應(yīng)體系，已在 Roche, ABI, Bio-Rad系列等儀器上經(jīng)過(guò)測(cè)試。DNA模板上樣量的選擇選擇一系列的稀釋梯度模板來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以選擇出最為合適的模板濃度。一般來(lái)說(shuō)，反應(yīng)的CT值在15-30個(gè)循環(huán)內(nèi)是比較合適的。選擇了模板 (攜帶HLA-B*1502基因的患者的外周血基因組DNA)的四個(gè)梯度濃度(100ng、50ng、25ng、 5ng)進(jìn)行STOR Green I檢測(cè)，除模板外反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與實(shí)施例1相同。
結(jié)果如圖3所示(曲線1為IOOng模板用量的擴(kuò)增曲線，曲線2為50ng模板用量的擴(kuò)增曲線，曲線4為25ng模板用量的擴(kuò)增曲線，曲線4為5ng模板用量的擴(kuò)增曲線，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值)，在模板濃度為IOOng的時(shí)候，CT值接近18 ；在模板濃度低至25ng的時(shí)候，CT值已經(jīng)接近30個(gè)循環(huán)，而5ng的時(shí)候已經(jīng)超出了，表明模板濃度在 25ng-100ng進(jìn)行檢測(cè)是較為適宜的。所以本發(fā)明HLA-B*1502基因的STOR Green I檢測(cè)中 PCR反應(yīng)體系中的DNA總量定為25-100ng/反應(yīng)。實(shí)施例3、HLA-B^l502 基因的 STOR Green I 檢測(cè)一、構(gòu)建攜帶HLA_B*1502基因的重組質(zhì)粒p-HLA_B*1502由上海英杰公司合成HLA_B*1502基因序列，并克隆至pGEM-T fesy載體(購(gòu)自Promega公司)載體多克隆位點(diǎn)的NoT I和Eco RI酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體 p-HLA-B*1502。二、用HLA_B*1502基因的STOR Green I法檢測(cè)10份臨床樣本將5份確診的攜帶HLA_B*1502基因患者的外周血基因組DNA及5份不攜帶 HLA-B^l502基因患者的外周血基因組DNA作為模板(以p-HLA_B*1502作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照)，用實(shí)施例1中的STOR-2引物和beta-actin內(nèi)參基因引物進(jìn)行 HLA-B*1502基因的STOR Green I法檢測(cè)。每份樣本重復(fù)平行檢測(cè)3次。臨床樣本檢測(cè)體系為25μ1，依次加入下列成分2*PCR Mix(購(gòu)自歐比特公司)12. 5ul，目的基因檢測(cè)mix(上、下游引物混合液，各1.25ul，0.4um/ul)或內(nèi)參基因檢測(cè) mix (上、下游引物混合液，各 1. 25ul，0. 4um/ul) 2. 5ul，樣品 DNA2ul (25-100ng)，DEPC 水 8μ I。臨床樣本檢測(cè)反應(yīng)條件為先熱啟動(dòng)95°C IOmin, 1個(gè)循環(huán)；然后變性95°C 15sec, 退火 71°C lmin，共；35 個(gè)循環(huán)；最后熔解 95°C 15s，60°C lmin，95°C 30s，60°C 15s。結(jié)果如圖4A(5份陰性樣本，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值)和圖4B(5份陽(yáng)性樣本，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值)所示，結(jié)果顯示以5份確診的攜帶HLA-B*1502 基因患者的外周血基因組DNA和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒為模板時(shí)出現(xiàn)了目的熒光擴(kuò)增曲線，以其余樣本的DNA為模板時(shí)，均無(wú)該目的熒光擴(kuò)增曲線，再根據(jù)CT值對(duì)結(jié)果做進(jìn)一步的判讀，方法為1.出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，且當(dāng)內(nèi)參基因CT值小于或等于27，目的基因CT值小于或等于 35時(shí)，如果兩者的CT差值小于等于7，那么結(jié)果為HLA-B*1502陽(yáng)性，若兩者的CT差值大于 7，則結(jié)果為陰性；2.當(dāng)內(nèi)參基因CT值小于或等于27時(shí)，目的基因CT值大于35或未出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，那么結(jié)果為陰性；3.若內(nèi)參基因的CT值大于27，提示DNA模板量不足，或存在PCR的抑制因素，需要重新提取DNA進(jìn)行檢測(cè)。首先看是否出現(xiàn)目的熒光擴(kuò)增曲線，這是一個(gè)直觀的判讀，其次還需看CT值，因?yàn)楫?dāng)CT值大于35后，檢測(cè)結(jié)果就不準(zhǔn)確了，即使出現(xiàn)擴(kuò)增曲線也無(wú)法判讀為陽(yáng)性。CT值是與所檢測(cè)樣本的模板量是成反比的，CT值越高，則代表著模板量越低。CT值檢測(cè)結(jié)果如表1所示，與熒光擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果一致，表明用本發(fā)明的方法可用于HLA-B*1502基因檢測(cè)。表1用本發(fā)明HLA-B*1502基因的STOR Green I法檢測(cè)10份臨床樣本的CT值
權(quán)利要求
1.用于對(duì)HLA-B*1502基因進(jìn)行STORGreen I檢測(cè)的引物，是根據(jù)HLA_B*1502基因的第2和第3外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)的，用以定性檢測(cè)待測(cè)樣品中的HLA-B*1502基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.一種用權(quán)利要求1或2所述引物對(duì)HLA-B*1502基因進(jìn)行的STOR Green I檢測(cè)方法，具體方法包括以下步驟1)提取受試者骨髓、外周血或組織的基因組DNA;2)以步驟1)提取的受試者骨髓、外周血或組織的基因組DNA為模板，在所述引物的引導(dǎo)下進(jìn)行STOR Green I PCR擴(kuò)增，同時(shí)用序列表中SEQ ID NO :3所示的上游引物和SEQ ID NO 4所示的下游引物對(duì)模板中的beta-actin內(nèi)參基因進(jìn)行STORGreen I PCR擴(kuò)增；3)擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果判讀1.出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，且當(dāng)內(nèi)參基因CT值小于或等于27，目的基因CT值小于或等于35時(shí)，如果兩者的CT差值小于等于7，那么結(jié)果為 HLA-B*1502陽(yáng)性，若兩者的CT差值大于7，則結(jié)果為陰性；2.當(dāng)內(nèi)參基因CT值小于或等于 27時(shí)，目的基因CT值大于35或未出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線，那么結(jié)果為陰性；3.若內(nèi)參基因的CT 值大于27，提示DNA模板量不足，或存在PCR的抑制因素，需要重新提取DNA進(jìn)行檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟2)中的25μ 1 PCR反應(yīng)體系為2*PCR Mix 12. 5ul，目的基因檢測(cè)mix或內(nèi)參基因檢測(cè)mix 2.5ul，樣品DNA 2ul (25-100ng)，DEPC 7jC 8 μ 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟2)中的PCR反應(yīng)條件為 先熱啟動(dòng)95°C 10min，l個(gè)循環(huán)；然后變性95°C 15sec，退火71°C lmin，共35個(gè)循環(huán)；最后熔解 95°C 15s,60°C lmin,95°C 30s, 60°C 15s。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟2~)中還包括用含有HLA-B*1502基因的陽(yáng)性對(duì)照品和不含HLA_B*1502基因的陰性對(duì)照品作為模板進(jìn)行STOR Green I PCR擴(kuò)增的步驟。
7.一種包括權(quán)利要求1或2所述引物的HLA-B*1502基因的STOR Green I檢測(cè)試劑品.ο
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包含2*PCRMix、目的基因檢測(cè)mix、內(nèi)參基因檢測(cè)mix和DEPC水。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括含有 HLA-B* 1502基因的陽(yáng)性對(duì)照品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)HLA-B*1502基因的SYBR Green I檢測(cè)方法及其專(zhuān)用引物與試劑盒。該引物是根據(jù)HLA-B*1502基因的第2和第3外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)的，用以定性檢測(cè)待測(cè)樣品中的HLA-B*1502基因。所述引物的上游引物具有序列表中SEQID NO1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列。本發(fā)明能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出HLA-B*1502基因，對(duì)保障人類(lèi)健康和卡馬西平類(lèi)藥物的用藥安全意義重大。本發(fā)明的檢測(cè)方法及試劑盒可用于多種臨床樣本(骨髓、外周血或組織)中HLA-B*1502基因的核酸檢測(cè)，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102296109SQ201110183320
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者吳賡, 徐玉現(xiàn), 毛吉揚(yáng) 申請(qǐng)人:北京思爾成生物技術(shù)有限公司