與甜瓜雄性不育ms5基因緊密連鎖的分子標記BSA3?2及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與甜瓜雄性不育ms5基因緊密連鎖的分子標記BSA3?2及其應(yīng)用，所述分子標記BSA3?2的引物序列為：BSA3?2F：TGCTTATGTGAGTGAGTCTGCTGAC，BSA3?2R：CAATGGTGTGGTGGAAGTTCTGGAA。上述分子標記BSA3?2可用于鑒定甜瓜雄性不育ms5 基因和甜瓜分子標記輔助育種。本發(fā)明根據(jù)高通量測序技術(shù)，得到甜瓜基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計開發(fā)與甜瓜雄性不育相關(guān)的caps 分子標記，通過分子標記輔助選擇育種的方法，在甜瓜幼苗期就可以進行甜瓜雄性不育植株的篩選，節(jié)省了育種的年限并提高了育種的效率，克服了現(xiàn)有技術(shù)中只能在開花期才能區(qū)分甜瓜雄性不育植株而帶來的育種效率低下的問題。
【專利說明】
與甜瓜雄性不育ms5基因緊密連鎖的分子標記BSA3-2及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于植物分子遺傳育種研究領(lǐng)域，涉及一種與甜瓜雄性不育ms5基因連鎖的分子標記及應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】[00〇2]甜瓜(CucuffiisL.)與其他作物相比較具有明顯的雜種優(yōu)勢，多年來國內(nèi)外的研究學(xué)者和育種工作者先后培育了大批量優(yōu)良的甜瓜雜種一代種子，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟效益。但是目前雜交制種仍然延續(xù)人工摘除母本雄花、人工授粉、套袋等措施，工序復(fù)雜、工作量大、成本高，容易造成花器官的損傷，從而造成產(chǎn)量的下降。McCreight和Elmstrom (1984)指出Fjf人工制種的成本為自然授粉成本的12-30倍。雄性不育對于降低人工制種的成本是一個重要并且穩(wěn)定有效的方法，能夠確保授粉的成功率及產(chǎn)量。植物雄性不育系在農(nóng)業(yè)上有巨大的應(yīng)用價值，因而雄性不育性的研究一直深受重視。雄性不育在植物界廣泛存在，尤其是開花植物中，它是一種有性繁殖過程中不能產(chǎn)生正常的花藥、花粉或雄配子的遺傳現(xiàn)象。利用雄性不育培育不育系進行雜交制種，不僅能夠降低制種成本，而且可以提高雜交種的純度。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以不育系和相應(yīng)的保持系為材料進行分子標記分析，可以獲得優(yōu)良親本所具有的特異分子標記，從而在苗期實現(xiàn)篩選，減少田間的勞動量，降低生產(chǎn)成本。
[0003]甜瓜雄性不育的資源非常有限，共有5個雄性不育基因被發(fā)現(xiàn)(Bohn，1949,1964; Lozanov，1983;McCreight，1984,2005，Pitrat，1991，2002)。1991 年，Pitrat 指出甜瓜5個雄性不育基因分別位于甜瓜連鎖圖譜上不同的連鎖群，基因之間未檢測到互作，與甜瓜紅莖基因連鎖，與控制葉片黃化基因連鎖，但是連鎖程度并不緊密。其它4個雄性不育表現(xiàn)型(Bohn，1949，1964; Lozanov，1983 ;McCreight，1984，2005，Pitrat，1991，2002)隨后被相繼命名為和每一個雄性不育基因控制一種表現(xiàn)型，和基因在田間檢測中很難通過表型鑒定;突變體是Cantaloup型甜瓜Za JoDa 4似仰的培育過程中發(fā)現(xiàn)的，該突變體材料具有抗白粉病等優(yōu)良性狀，該突變體植株的雄蕊比正?；ㄖ晷廴镄。一ǚ勰也婚_裂；顯微觀察結(jié)果顯示突變體含有少量或者不含有花粉，人工授粉成功率低于其它植株12倍左右(Bohn and Principle，1964)。遺傳規(guī)律的研究表明攜帶突變體姊妹交的內(nèi)群體，雄性可育與雄性不育分離比率為3:1，并且與配置的雜交組合F2群體雄性可育與雄性不育的分離比率為9:7,結(jié)果顯示與符合兩對基因獨立遺傳規(guī)律(Bohn and Principle，1964)可通過表型鑒定，Park(2004)等利用突變體植株與“TAM Dulce”配置了 F2群體，研究基因的遺傳規(guī)律，認為其受到一對隱性基因的控制，并找到與其連鎖的SCAR標記，連鎖距離為2.1cM。Park等利用F2群體鑒定ms-3遺傳規(guī)律，認為單隱性核基因控制甜瓜雄性不育該結(jié)果與McCreight (1983,1984)的研究結(jié)果吻合，研究結(jié)果同樣證實ms-Z和 male sterility -Zees/wrg■即為基因。由于和花器官發(fā)育初期雄花的退化，因此很容易通過田間性狀進行鑒定(Leouv1ur et al.，1990;Pitrat，1991) offls-5突變體最早由美國Clause種子公司發(fā)現(xiàn)，并應(yīng)用于雜交一代制種中，但是相關(guān)研究未見報到(Leouv1ur et al.，1990)。肥_5突變體最早于1966年在培育抗白粉病材料“PMR45”育種過程中發(fā)現(xiàn)，突變體植株的雄花在花蕾發(fā)育初期就明顯少于可育植株，在雄花或者完全花植株中，花藥數(shù)目減少空癟，花粉在減數(shù)分裂時期就開始退化(Leouv1ur et al.，1990)。十多年來，關(guān)于甜瓜雄性不育的研究一直滯后于其他作物，而甜瓜因的研究更是未見相關(guān)報道。前人的研究結(jié)果顯示，此均為獨立遺傳的雄性不育基因(Lecouv1ur et al.，1990 ;McCreight and Elmstrom，1984)，分別位于傳統(tǒng)甜瓜遺傳圖譜第10、11、12條染色體上(Pitrat，1991; 2002)。甜瓜控制雄蕊發(fā)育基因(a)基因調(diào)控雌花中雄蕊的發(fā)育(Boualem et al.，2008)，Park的研究結(jié)果證實a基因與基因未檢測到連鎖關(guān)系，同樣證明a基因與其它雄性不育基因也不存在連鎖關(guān)系(Pirtrat 1991；
2002) ο

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種與甜瓜雄性不育基因ms5緊密連鎖的分子標記BSA3-2及其應(yīng)用。本發(fā)明選擇ms5雄性不育突變體和雄性可育植株HM-1，配制ms5 XHM-1雜交群體，構(gòu)建F2群體，提取252個F2單株的基因組DNA，多年多點，調(diào)查兩個群體F2代群體的花粉育性分離比率，研究甜瓜雄性不育的遺傳規(guī)律，對兩個親本進行高通量基因組重測序，設(shè)計CAPs標記，分析與甜瓜雄性不育基因連鎖的區(qū)域，在該連鎖區(qū)域內(nèi)查找親本間存在SNP突變的堿基區(qū)段，并分析SNP位點的酶切信息，獲得存在CAPS突變的序列；針對突變序列設(shè)計引物，利用CAPs標記在甜瓜F2群體中進行雄性不育鑒定，分子標記的鑒定結(jié)果與表型鑒定結(jié)果一致。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
一種與甜瓜雄性不育基因ms5緊密連鎖的分子標記BSA3-2，其引物序列為:
BSA3-2F:TGCTTATGTGAGTGAGTCTGCTGAC，
BSA3-2R:CAATGGTGTGGTGGAAGTTCTGGAA。
[0006]上述分子標記BSA3-2可用于鑒定甜瓜雄性不育ms5基因。
[0007]上述分子標記BSA3-2可用于甜瓜分子標記輔助育種，在苗期能夠提早鑒定甜瓜雄性不育材料，不用等到植株開花后才能通過表型鑒定，為甜瓜育種、配置雜交組合、親本的早期篩選節(jié)省了大量的時間及人力物力。。
[0008]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
UCaps標記是以酶切位點產(chǎn)生單個堿基多態(tài)性的分子標記，由于該標記的特點是分布范圍廣，變異的穩(wěn)定性強因此成為近年來進行基因定位的新一代標記。本發(fā)明根據(jù)高通量測序技術(shù)，得到甜瓜基因組數(shù)據(jù)，設(shè)計開發(fā)與甜瓜雄性不育相關(guān)的caps分子標記，通過分子標記輔助選擇育種的方法，在甜瓜幼苗期就可以進行甜瓜雄性不育植株的篩選，節(jié)省了育種的年限并提高了育種的效率，克服了現(xiàn)有技術(shù)中只能在開花期才能區(qū)分甜瓜雄性不育植株而帶來的育種效率低下的問題。
[0009]2、通過利用本發(fā)明提供的特異性引物對采用PCR方法檢測待測甜瓜的基因組DNA，擴增CAPS分子標記BSA3-2，限制性內(nèi)切酶XhoI酶切后，甜瓜雄性不育植株只有一條帶，而雄性可育植株擴增條帶經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xho頂每切后，有兩條條帶，通過此分子標記可以準確對甜瓜進行雄性不育鑒定，用于篩選植株，大大提升了菠甜瓜的育種效率。
[0010]3、目前國內(nèi)外對甜瓜雄性不育ms5基因連鎖的分子標記未見相關(guān)報道，本發(fā)明的分子標記BSA3-2與甜瓜雄性不育基因緊密連鎖，遺傳距離為0.1CM。
[0011]4、本發(fā)明分子標記在甜瓜生產(chǎn)實踐、育種中具有非常重要的價值。
[0012]5、操作方法簡單，穩(wěn)定性強，為甜瓜分子育種提供了輔助選擇的新方法?！靖綀D說明】
[0013]圖1為BSA3-2標記檢測甜瓜雄性不育的電泳圖，圖中:M為marker，由8條DNA片段組成，從下到上依次是100、250、500、7500、1000、2000、3000和500(^口;？1代表父本，雄性可育;P2代表母本，雄性不育，F(xiàn)i為雜交一代，F(xiàn)2共有24個單株，1-8為雄性可育純合植株，9-16 為雄性可育雜合植株；17-24為雄性不育植株;雄性不育植株在877bp為特異條帶，酶切產(chǎn)物482bp產(chǎn)生特異條帶為雄性可育植株條帶，在兩個位點都有條帶的為雜合體，雄性可育?！揪唧w實施方式】
[0014]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍中。
[0015]【具體實施方式】一:本實施方式提供了一種與甜瓜雄性不育ms5基因緊密連鎖的分子標記BSA3-2，其引物序列為:BSA3-2F:TGCTTATGTGAGTGAGTCTGCTGAC，BSA3-2R:CAATGGTGTGGTGGAAGTTCTGGAA。[〇〇16] 上述分子標記BSA3-2的獲得方法如下:1、甜瓜遺傳群體的構(gòu)建利用甜瓜雄性不育突變厚皮甜瓜ms5作母本，與黑龍江省薄皮甜瓜純合品系HM-1配置雜交組合，得到F1、F2群體、B&Pi和B&P2群體。種植650株ms-5 X HM-1F2，獲得不育植株，獲得可育植株502個，不育植株148個，F(xiàn)2可育植株與不育植株分尚比率符合3:1。種植BCiPi群體 161株，BQPi群體中可育:不育為85:86,經(jīng)卡方檢測回交群體符合1:1分離比率。甜瓜雄性不育ms5受到一對隱性基因控制，基因型為mS5ms5,可育對不育顯性。[〇〇17]2、基因組DNA的提取和基因池構(gòu)建采用CTAB法提取252個F2單株的基因組DNA。
[0018]分別取F2-3家系中表現(xiàn)純合的雄性不育及雄性可育各30個單株，構(gòu)建用于分離群體分組分析(Bulk Segregating Analysis，BSA)的基因池，DNA濃度在lOOng/yL，構(gòu)建可育基因池和不育基因池。[〇〇19]3、caps連鎖標記篩選通過對雄性不育突變體ms5及HM1-1進行高通量測序，得到兩個親本的基因組序列信息，分析比較兩個親本間差異性位點，利用BSA方法獲得與甜瓜雄性不育性狀ms5緊密連鎖的分子標記，共設(shè)計開發(fā)分子標記420對，在可育基因池和不育基因池之間進行PCR擴增和多態(tài)性篩選，共篩選到240對引物。篩選與甜瓜雄性不育性狀連鎖的分子標記，其中發(fā)現(xiàn)BSA3-2與甜瓜雄性不育性狀緊密連鎖。
[0020]【具體實施方式】二:本實施方式提供了一種利用分子標記法檢測甜瓜雄性不育ms5基因的方法，具體步驟如下:
(I)提取待測樣品的DNA，采用分子標記BSA3-2進行PCR擴增。1yL PCR反應(yīng)體系為:30ng/yL DNA 2yL，BSA3_2引物上下游各0.2yL，10XPCR bufferlyL,2.5mM dNTp0.3yL,Taq酶0.1yL，ddH20 6.AyL13PCR擴增條件為:94°C預(yù)變性2min、94°C 變性20See、68°C 退火Imin、72°C延伸30Sec，共6個循環(huán)，每個循環(huán)溫度降低2°C;94°C變性20See、58°C退火I min、72°(:延伸3056(:，共6個循環(huán)，每個循環(huán)溫度降低1°(:;94°(:變性20366、50°(:退火3036(3、721€延伸30Sec，共20個循環(huán)，最后72°C延伸5min。
[0021](2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用于XhoI酶切反應(yīng)，酶切方法為:PCR反應(yīng)產(chǎn)物10yL、XhoI限制性內(nèi)切酶0.5yL，濃度為lU/yL、10XFast Digest buffer 2yL，去離子水7.5yL，酶切反應(yīng)在37°C水浴鍋中溫浴20min，加入4yL 6 X loading buffer后于2%瓊脂糖凝膠120U電壓電泳30min，在Tanon2500凝膠成像儀進行拍照。
[0022](3)待測DNA樣品經(jīng)過PCR擴增和XhoI酶切后，電泳方式能檢測出482bp片段的為雄性可育甜瓜材料，而片段大小為877bp的則是雄性不育的甜瓜材料(圖1)。因此，通過緊密連鎖標記的擴增能準確區(qū)分恢復(fù)基因位點的不同基因型，達到輔助育種的目的。
【主權(quán)項】
1.一種與甜瓜雄性不育基因ms5緊密連鎖的分子標記BSA3-2，其特征在于所述分子標記BSA3-2的引物序列為: BSA3-2F:TGCTTATGTGAGTGAGTCTGCTGAC， BSA3-2R:CAATGGTGTGGTGGAAGTTCTGGAA。2.權(quán)利要求1所述分子標記BSA3-2在鑒定甜瓜雄性不育ms5基因中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子標記BSA3-2在鑒定甜瓜雄性不育ms5基因中的應(yīng)用，其特征在于分子標記BSA3-2鑒定甜瓜雄性不育ms5基因的方法如下: (1)提取待測樣品的DNA，采用分子標記BSA3-2進行PCR擴增； (2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物用于XhoI酶切反應(yīng)，酶切方法為:PCR反應(yīng)產(chǎn)物1yL、XhoI限制性內(nèi)切酶0.5yL，濃度為lU/yL、10 XFast Digest buffer 241^，去離子水7.541^，酶切反應(yīng)在37°(:水浴鍋中溫浴20min，加入4yL 6 X loading buffer后于2%瓊脂糖凝膠120U電壓電泳30min，在Tanon2500凝膠成像儀進行拍照； (3)待測DNA樣品經(jīng)過PCR擴增和XhoI酶切后，電泳方式能檢測出482bp片段的為雄性可育甜瓜材料，而片段大小為877bp的則是雄性不育的甜瓜材料。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標記BSA3-2在鑒定甜瓜雄性不育ms5基因中的應(yīng)用，其特征在于所述PCR反應(yīng)體系為:30ng/yL DNA 2yL，BSA3_2引物上下游各0.2yL，10 X PCRbufferlyL,2.5mM dNTp0.3yL，Taq酶0.lyL，ddH20 6.4yL05.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標記BSA3-2在鑒定甜瓜雄性不育ms5基因中的應(yīng)用，其特征在于所述PCR擴增條件為:94°C預(yù)變性2min、94°C變性20See、68°C退火I min、72°C延伸30Sec，共6個循環(huán)，每個循環(huán)溫度降低2°C;94°C變性20See、58°C退火I min、72°C延伸30Sec，共6個循環(huán)，每個循環(huán)溫度降低1°C;94°C變性20See、50°C退火30Sec、72°C延伸30Sec，共20個循環(huán)，最后72°C延伸5min。6.權(quán)利要求1所述分子標記BSA3-2在甜瓜分子標記輔助育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK106048025SQ201610445265
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月21日
【發(fā)明人】盛云燕, 于高波, 紀鵬, 郭曉紅, 魏金鵬, 李德澤, 史闖
【申請人】黑龍江八農(nóng)墾大學(xué), 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)