基于紅麻atp8基因鑒定雄性不育細(xì)胞質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基于紅麻atp8基因鑒定雄性不育細(xì)胞質(zhì)的方法，其步驟為：利用ALP（Amplified?Length?Polymorphism）分子標(biāo)記技術(shù)的特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增待測紅麻樣本的線粒體DNA，能擴(kuò)增出與細(xì)胞質(zhì)雄性不育系具有相同特異性條帶的即為含紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的材料。所述特異性引物為核苷酸序列如SEQ?ID?No.1和2所示的引物。本發(fā)明還提供用于紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)分子鑒定方法的分子標(biāo)記HM138。本發(fā)明采用ALP分子標(biāo)記技術(shù)對紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)材料進(jìn)行了分子水平多態(tài)性檢測。該方法鑒定速度快、準(zhǔn)確率高、操作簡單，非常適用于紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的鑒定和分子標(biāo)記輔助育種。
【專利說明】基于紅麻atp8基因鑒定雄性不育細(xì)胞質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基于紅麻atp8基因鑒定雄性不育細(xì)胞質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】 [0002]紅麻又稱“洋麻”，是錦葵科木槿屬一年生韌皮纖維作物。因其在長江流域及其以北地區(qū)不能自然留種，北方麻區(qū)每年要從華南地區(qū)引入大量種子。紅麻表現(xiàn)出強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢，其雜種優(yōu)勢率高達(dá)35%-40%。長期以來，紅麻雜種優(yōu)勢利用是國內(nèi)外紅麻育種的主攻目標(biāo)。
[0003]2008年9月，廣西大學(xué)周瑞陽發(fā)明的“紅麻野敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法”獲得國家發(fā)明專利(ZL 200510019454.4)。按此方法已選育出了 K03A (見:桂科鑒字第[2004] 152 號)、福 3A、P3A、917A、722A、763A 和 L23A (見:桂科鑒字第[2007] 177 號)等 7 個細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，紅麻雜種優(yōu)勢利用取得突破性進(jìn)展。
[0004]但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由單一細(xì)胞質(zhì)雄性不育系組配的雜交種的大面積推廣和長期利用存在某一病害大流行的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)樵摷?xì)胞質(zhì)雄性不育系組配的雜交種可能成為某一病原微生物生理小種的哺育品種。解決這一問題的基本途徑是選育出多種細(xì)胞質(zhì)來源的雄性不育系，并在生產(chǎn)中推廣不同細(xì)胞質(zhì)來源的三系雜交種。
[0005]為了選育新的雄性不育細(xì)胞質(zhì)，一般利用現(xiàn)有雄性不育保持系與現(xiàn)有種質(zhì)資源測交的方法篩選，不但工作量很大，而且?guī)в泻艽蟮拿つ啃浴?br> [0006]若能找到一種雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子標(biāo)簽，則可利用這種標(biāo)簽對現(xiàn)有種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定，以發(fā)掘出新的雄性不育細(xì)胞質(zhì)資源，繼而選育出新的雄性不育系。由此將極大地提高工作效率，并有利于現(xiàn)有雄性不育系及其雜交種的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)。
[0007]關(guān)于紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)分子鑒定方法，國內(nèi)外均未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是解決目前缺乏紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)分子鑒定方法的問題，提供基于紅麻atp8基因鑒定雄性不育細(xì)胞質(zhì)的方法。
[0009]ALP (Amplified Length Polymorphism:擴(kuò)增長度多態(tài)性)技術(shù)是針對特定的位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，PCR產(chǎn)物的多態(tài)性稱為ALP。本發(fā)明的目的是利用ALP技術(shù)解決紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的鑒定問題，提供一種紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的分子鑒定方法。
[0010]本發(fā)明提供的基于紅麻atp8基因鑒定雄性不育細(xì)胞質(zhì)的方法，具體步驟如下:
[0011]用ALP分子標(biāo)記技術(shù)的特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增待測紅麻樣本的線粒體DNA，能擴(kuò)增出與細(xì)胞質(zhì)雄性不育系具有相同特異性條帶的即為含紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的材料；
[0012]所述特異性引物為atp8BQ引物對:
[0013]正向引物5’ -CCAACGACGATCCTATCCTAAA-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)[0014]反向引物5’ -CTCCACTTACTCGATACAGGCITT-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0015]其中，所述PCR的反應(yīng)體系如下:
[0016]
【權(quán)利要求】
1.基于紅麻atp8基因鑒定雄性不育細(xì)胞質(zhì)的方法，其特征在于，具體步驟如下: 用ALP分子標(biāo)記技術(shù)的特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增待測紅麻樣本的線粒體DNA，能擴(kuò)增出與細(xì)胞質(zhì)雄性不育系具有相同特異性條帶的即為含紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)的材料； 所述特異性引物為atp8BQ引物對: 正向引物 5’ -CCAACGACGATCCTATCCTAAA-3’(如 SEQ ID N0.1 所示) 反向引物 5’ -CTCCACTTACTCGATACAGGCTTT-3，(如 SEQ ID N0.2 所示)。
2.如權(quán)利要求1所述的基于紅麻atp8基因鑒定雄性不育細(xì)胞質(zhì)的方法，其特征在于，其PCR反應(yīng)體系如下:
3.如權(quán)利要求1所述的基于紅麻atp8基因鑒定雄性不育細(xì)胞質(zhì)的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，然后94°C 30s, 55°C 20s, 72°C 20s，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后72°C終延伸3min。
4.用于權(quán)利要求1所述紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)分子鑒定方法的atpSBQ引物對，其特征在于，其為: 正向引物 5’ -CCAACGACGATCCTATCCTAAA-3’(如 SEQ ID N0.1 所示) 反向引物 5’ -CTCCACTTACTCGATACAGGCTTT-3，(如 SEQ ID N0.2 所示)。
5.用于權(quán)利要求1所述紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)分子鑒定方法的分子標(biāo)記HM138，其為用如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物擴(kuò)增出長度為138bp的特異性條帶。
6.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的紅麻雄性不育細(xì)胞質(zhì)分子鑒定方法在紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求4所述的引物在鑒定紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求5所述的分子標(biāo)記在鑒定紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK103740817SQ201310710995
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】廖小芳, 趙艷紅, 周瑞陽, 陳鵬, 周瓊, 周步進(jìn) 申請人:廣西大學(xué)