專利名稱：草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到生物醫(yī)藥體外分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到草魚呼腸孤病毒SYBR GreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
草魚出血病(Hemorrhagedisease of grasscarp)是感染草魚的一種嚴(yán)重的傳染 性疾病。流行季節(jié)長，發(fā)病率和死亡率均較高，往往造成大批草魚魚苗死亡；1年足齡青魚 也受害，2齡以上草魚有時(shí)也患此病。草魚出血病的病原出于草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reoviry s, GCRV)，是呼腸孤病毒科、水生呼腸孤病毒屬的病毒中毒力最強(qiáng)的病毒。草魚呼 腸孤病毒基因組由11條分節(jié)段dsRNA組成，總分子量為15. 46X IO6道爾頓，編碼了 12條 多肽，研究表明，各基因組片段與編碼多肽的關(guān)系是大體一一對應(yīng)。目前對GCRV的檢測方法包括免疫學(xué)方法如葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn) (SPA-COA)法、熒光抗體技術(shù)(FA)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法和斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)(Dot-ELISA)法；分子生物學(xué)方法如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。這些方法或者操 作繁瑣，周期長，或者只能進(jìn)行定性檢測而不能定量分析。最近發(fā)展起來的熒光定量PCR技 術(shù)，以其靈敏度高，特異性好、快 速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在病原體的定性和定量檢測等方面得到廣 泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于草魚呼腸孤病毒可疑患病草魚肝、脾、腎組織的 草魚出血病基因診斷的SYBR GreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案為草魚呼腸孤病毒SYBR GreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法至少包括抽提草魚呼 腸孤病毒總RNA、引物設(shè)計(jì)、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因RT-PCR擴(kuò)增、草魚呼腸孤病毒 外衣殼蛋白基因的克隆與鑒定、標(biāo)準(zhǔn)品模板的稀釋和熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。草魚呼腸孤病毒SYBR GreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的具體步驟如下1、采用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA ；2、引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中草魚出血病-873外衣殼蛋白(VP7)基因序列 (AF403396)設(shè)計(jì)兩對特異性引物，擴(kuò)增片段長度為IOObp的片段，所設(shè)計(jì)的引物如下上游引物5，-GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3，下游引物5，-CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3，；3、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴(kuò)增取1 10 μ g病毒總RNA，加入上游引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，加入反 應(yīng)緩沖液，dNTPs、上下游引物、滅菌雙蒸水，Taq DNA聚合酶，將上述反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收產(chǎn)物；4、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑒定
草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后于14 25°C過 夜與載體連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于含氨芐青霉 素的LB液體培養(yǎng)基中，28 37°C震蕩培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒， 對重組質(zhì)粒用上下游引物進(jìn)行PCR鑒定；5、標(biāo)準(zhǔn)品模板的稀釋用紫外分光光度計(jì)分別測定陽性重組質(zhì)粒在260和280納米處的吸光度，并根據(jù) 公式計(jì)算重組質(zhì)粒的DNA濃度與純度，將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，以1 X IO2 1 X IO8 拷貝數(shù)/微升作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，用于熒光定量PCR反 應(yīng)條件的優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，所用 公式如下分子拷貝數(shù)(個(gè)/毫升)=DNA質(zhì)量濃度/DNA分子量DNA 分子量=DNA 堿基數(shù) X 324. 5DNA質(zhì)量濃度=260納米吸光度X 50微克/毫升X稀釋倍數(shù)X 6. 02 X IO23 ；6、熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別以10倍拷貝系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA (1 X IO2 1 X IO8拷貝數(shù)/微升)為標(biāo) 準(zhǔn)品模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)復(fù)孔，測定該方法的檢測靈敏度、分析 實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。在上述步驟3和步驟5中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為(1)、94 °C 預(yù)變性 5 分鐘；(2)、94°C變性15秒，50°C退火15秒，72°C延伸20秒，為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循 環(huán)；(3)、在 72°C 延伸 10 分鐘。本發(fā)明的積極效果為1、該檢測方法對于模板濃度要求較寬，檢測靈敏度高，可進(jìn)行定量分析；2、該檢測方法一次可同時(shí)對72各樣品進(jìn)行檢測；3、PCR反應(yīng)結(jié)束后，可立即觀察結(jié)果，不需要電泳、染色等操作。


圖1、GCRV定量RT-PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一1、采用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA ；2、引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中草魚出血病_873外衣殼蛋白(VP7)基因序列(AF403396)設(shè)計(jì)兩 對特異性引物，擴(kuò)增片段長度為98bp，所設(shè)計(jì)的引物如下上游引物5，-GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3，下游引物5，-CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3，；3、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴(kuò)增
取Iyg病毒總RNA，力卩入20pmol上游弓丨物，按照Improm- II ReverseTranscription System說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取8微升反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，加入 IOXTaq反應(yīng)緩沖液5微升，2. 5毫摩爾/升dNTPs 4微升、50微摩爾1/升，上下游各1微 升、滅菌雙蒸水30. 5微升，5U/微升Taq DNA聚合酶0. 5微升，將上述反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性15秒，50°C退火15秒，72°C延伸20秒為 一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。同時(shí)設(shè)立無模板的陰性對照，反應(yīng)結(jié) 束后，取5微升PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。4、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑒定草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后于16°C過夜與 載體連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于5毫 升含50微克/毫升氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒 DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒用上下游弓I物進(jìn)行PCR鑒定。5、標(biāo)準(zhǔn)品模板的稀釋用紫外分光光度計(jì)分別測定陽性重組質(zhì)粒在260和280納米處的吸光度，并根據(jù) 公式計(jì)算重組質(zhì)粒的DNA濃度與純度。將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，以1 X 102、1 X 103、 1 X 104、1 X 105、1 X 106、1 X IO7,1 X IO8拷貝數(shù)/微升作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，用于熒光定量PCR反 應(yīng)條件的優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，所用公式如下分子拷貝數(shù)(個(gè)/毫升)=DNA質(zhì)量濃度/DNA分子量DNA 分子量=DNA 堿基數(shù) X 324. 5DNA質(zhì)量濃度=260納米吸光度X 50微克/毫升X稀釋倍數(shù)X 6. 02 X IO236、熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別以10倍拷貝系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA (1 X IO2 1 X IO8拷貝數(shù)/微升)為標(biāo) 準(zhǔn)品模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)條件與步驟3相同，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)復(fù)孔， 測定該方法的檢測靈敏度、分析實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。實(shí)施例二 1、采用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA ；2、引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中草魚出血病-873外衣殼蛋白(VP7)基因序列(AF403396)設(shè)計(jì)兩 對特異性引物，擴(kuò)增片段長度為98bp，所設(shè)計(jì)的引物如下上游引物5，-GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3，下游引物5，-CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3，；3、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴(kuò)增取5yg病毒總RNA，力卩入20pmol上游弓丨物，按照Improm- II ReverseTranscription System說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取8微升反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，加入 IOXTaq反應(yīng)緩沖液5微升，2. 5毫摩爾/升dNTPs 4微升、50微摩爾1/升，上下游各1微 升、滅菌雙蒸水30. 5微升，5U/微升Taq DNA聚合酶0. 5微升，將上述反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性15秒，50°C退火15秒，72°C延伸20秒為 一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。同時(shí)設(shè)立無模板的陰性對照，反應(yīng)結(jié) 束后，取5微升PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。
4、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑒定草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后于16°C過夜與載體連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于5毫 升含50微克/毫升氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒 DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒用上下游弓I物進(jìn)行PCR鑒定。5、標(biāo)準(zhǔn)品模板的稀釋用紫外分光光度計(jì)分別測定陽性重組質(zhì)粒在260和280納米處的吸光度，并根據(jù) 公式計(jì)算重組質(zhì)粒的DNA濃度與純度。將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，以1 X 102、1 X 103、 1 X 104、1 X 105、1 X 106、1 X IO7,1 X IO8拷貝數(shù)/微升作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，用于熒光定量PCR反 應(yīng)條件的優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，所用公式如下分子拷貝數(shù)(個(gè)/毫升)=DNA質(zhì)量濃度/DNA分子量DNA 分子量=DNA 堿基數(shù) X 324. 5DNA質(zhì)量濃度=260納米吸光度X 50微克/毫升X稀釋倍數(shù)X 6. 02 X IO236、熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別以10倍拷貝系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA(1 X IO2 1 X IO8拷貝數(shù)/微升)為標(biāo) 準(zhǔn)品模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)條件與步驟3相同，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)復(fù)孔， 測定該方法的檢測靈敏度、分析實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。實(shí)施例三1、采用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA ；2、引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中草魚出血病-873外衣殼蛋白(VP7)基因序列(AF403396)設(shè)計(jì)兩 對特異性引物，擴(kuò)增片段長度為98bp，所設(shè)計(jì)的引物如下上游引物5，-GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3，下游引物5，-CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3，；3、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴(kuò)增取IOyg病毒總RNA，力卩入20pmol上游引物，按照 Improm- II ReverseTranscription System說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取8微升反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA， 加入IOXTaq反應(yīng)緩沖液5微升，2. 5毫摩爾/升dNTPs 4微升、50微摩爾1/升，上下游各 1微升、滅菌雙蒸水30. 5微升，5U/微升Taq DNA聚合酶0. 5微升，將上述反應(yīng)體系混勻后 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性15秒，50°C退火15秒，72°C延伸20 秒為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。同時(shí)設(shè)立無模板的陰性對照，反 應(yīng)結(jié)束后，取5微升PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。4、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑒定草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后于16°C過夜與 載體連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于5毫 升含50微克/毫升氨芐青霉素(Amp+)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒 DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒用上下游弓I物進(jìn)行PCR鑒定。5、標(biāo)準(zhǔn)品模板的稀釋用紫外分光光度計(jì)分別測定陽性重組質(zhì)粒在260和280納米處的吸光度，并根據(jù)公式計(jì)算重組質(zhì)粒的DNA濃度與純度。將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，以1 X 102、1 X 103、 1 X 104、1 X 105、1 X 106、1 X IO7,1 X IO8拷貝數(shù)/微升作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，用于熒光定量PCR反 應(yīng)條件的優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，所用公式如下<formula>formula see original document page 7</formula>6、熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別以10倍拷貝系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA (1 X IO2 1 X IO8拷貝數(shù)/微升)為標(biāo)準(zhǔn)品模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)條件與步驟3相同，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)復(fù)孔， 測定該方法的檢測靈敏度、分析實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。實(shí)例檢測結(jié)果將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行，進(jìn)行定 量RT-PCR。通過作圖可以看出，質(zhì)粒濃度為IXlO8 IXlO2個(gè)拷貝，7個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi) 定量RT-PCR有“S”型擴(kuò)增曲線，即反映了 PCR的指數(shù)增長期，線性增長期和平臺(tái)期三個(gè)階 段。檢測靈敏度為100個(gè)病毒粒子。進(jìn)一步分析擴(kuò)增曲線，發(fā)現(xiàn)指數(shù)增長期的曲線平行，反 映了 PCR的擴(kuò)增效率相近；而不同稀釋度之間的Ct相差均勻，符合定量PCR的Ct值與起始 拷貝數(shù)之間嚴(yán)格的線性關(guān)系。每個(gè)稀釋度的兩個(gè)重復(fù)，其擴(kuò)增曲線基本吻合在一起，反映了 實(shí)驗(yàn)的平行性好。利用統(tǒng)計(jì)軟件STATISTICA 6. 0，對實(shí)驗(yàn)中的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析結(jié)果表明7 個(gè)不同稀釋梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的Ct值變異系數(shù)(CV)在0. 08% 3. 26%之間，相同稀釋度 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒Ct值之間差異均不顯著(P > 0. 05)。根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)與Ct值的相關(guān)性，由SDS (Sequence Detection System) 2. 1軟件 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1)。橫坐標(biāo)代表質(zhì)?？截悢?shù)(χ)，縱坐標(biāo)為Ct值，點(diǎn)上的數(shù)字代表模板 的拷貝數(shù)。拷貝數(shù)(χ)與Ct的關(guān)系為=Ct = -2. 9821gX+31. 038 ；相關(guān)系數(shù)R2 = 0. 99102。 經(jīng)過對熔解曲線的分析，可以發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA熔解溫度(Tm)值非常均一，無非特異性 擴(kuò)增產(chǎn)物和弓I物二聚體的出現(xiàn)。以上所述僅是本發(fā)明的非限定實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不 脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思和不作出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法至少包括抽提草魚呼腸孤病毒總RNA、引物設(shè)計(jì)、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因RT-PCR擴(kuò)增、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因的克隆與鑒定、標(biāo)準(zhǔn)品模板的稀釋和熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的草魚呼腸孤病毒SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法， 其特征在于草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的具體步驟如下(1)、采用裂解液和RNA抽提液處理抽提的草魚呼腸孤病毒總RNA；(2)、引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中草魚出血病-873外衣殼蛋白(VP7)基因序列 (AF403396)設(shè)計(jì)兩對特異性引物，擴(kuò)增片段長度為90 200bp的片段，所設(shè)計(jì)的引物如 下上游引物5’ -GGAATTCACCACGATGCCACTTCAC-3，下游引物5’ -CGGGATCCCGGTGCTTAATCGGATGG-3，；(3)、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因RT-PCR擴(kuò)增取1 10ii g病毒總RNA，加入上游引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，加入反應(yīng)緩 沖液，dNTPs、上下游引物、滅菌雙蒸水，Taq DNA聚合酶，將上述反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收產(chǎn)物；(4)、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的克隆與鑒定草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后于14 25°C過夜與 載體連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于含氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中，28 37°C震蕩培養(yǎng)過夜，使用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，對重組 質(zhì)粒用上下游引物進(jìn)行PCR鑒定；(5)、標(biāo)準(zhǔn)品模板的稀釋用紫外分光光度計(jì)分別測定陽性重組質(zhì)粒在260和280納米處的吸光度，并根據(jù)公式 計(jì)算重組質(zhì)粒的DNA濃度與純度，將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，以1 X 102 1 X 108拷貝 數(shù)/微升作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，用于熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，所用公式 如下分子拷貝數(shù)(個(gè)/毫升)=DNA質(zhì)量濃度/DNA分子量DNA分子量=DNA堿基數(shù)X 324. 5DNA質(zhì)量濃度=260納米吸光度X 50微克/毫升X稀釋倍數(shù)X6. 02X 1023 ；(6)、熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別以10倍拷貝系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA (1 X 102 1 X 108拷貝數(shù)/微升)為標(biāo)準(zhǔn)品 模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)復(fù)孔，測定該方法的檢測靈敏度、分析實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的草魚呼腸孤病毒SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 方法及具體步驟，其特征在于上述步驟(3)和步驟(5)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為(1)、94°C預(yù)變性5分鐘；(2)、94°C變性15秒，50°C退火15秒，72°C延伸20秒，為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；(3)、在721延伸10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種草魚呼腸孤病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。該方法至少包括抽提草魚呼腸孤病毒總RNA、引物設(shè)計(jì)、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因RT-PCR擴(kuò)增、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白基因的克隆與鑒定、標(biāo)準(zhǔn)品模板的稀釋和熒光定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。該檢測方法對于模板濃度要求較寬，檢測靈敏度高，可進(jìn)行定量分析，一次可同時(shí)對72各樣品進(jìn)行檢測，PCR反應(yīng)結(jié)束后，可立即觀察結(jié)果，不需要電泳、染色等操作，因此比常規(guī)PT-PCR方法方便、快捷。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101831507SQ201010173229
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者周勇, 徐進(jìn), 曾令兵, 羅曉松, 范玉頂, 馬杰 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所