專利名稱：使用生物標(biāo)志物檢測化合物遺傳毒性的方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用生物標(biāo)志物檢測化合物遺傳毒性的方法以及該方法在新藥開發(fā)早期遺傳毒性篩選中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)以來，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步、工業(yè)化水平的提高、人類活動(dòng)區(qū)域的拓展，人類生活環(huán)境中的新化學(xué)物質(zhì)不斷增加，其中，一些具有遺傳毒性的物質(zhì)能直接損傷生物體的遺傳物質(zhì)而使基因和染色體發(fā)生改變，結(jié)果會(huì)誘發(fā)癌變，甚至將突變通過生殖細(xì)胞傳遞給后代。對這些化學(xué)物質(zhì)的遺傳毒性進(jìn)行預(yù)測和評價(jià)已成為環(huán)境科學(xué)一個(gè)重要的研究內(nèi)容，開發(fā)和完善遺傳毒性檢測和評價(jià)技術(shù)對于保護(hù)人類的生命健康具有重要而深遠(yuǎn)的意 義。此外，對于藥物開發(fā)，如果能在早期研發(fā)階段及早并快速地獲得藥物的毒性反應(yīng)數(shù)據(jù)，就可以降低藥物的研發(fā)成本和縮短研發(fā)周期。藥物遺傳毒性因其與致癌性密切相關(guān)，并且試驗(yàn)周期短，在早期毒性篩選中發(fā)揮重要作用。因此，開發(fā)準(zhǔn)確、快速和簡便的遺傳毒性檢測試驗(yàn)也是藥物安全性評價(jià)研究的重要內(nèi)容。近十幾年來，相關(guān)領(lǐng)域特別是分子生物學(xué)的發(fā)展和各種新技術(shù)的出現(xiàn)，為遺傳毒性的檢測與機(jī)制研究提供了新的思路和手段。其中，利用生物標(biāo)志物作為環(huán)境樣品毒性 檢測與評價(jià)的研究方法受到國際上日益廣泛的重視(Bartsch H. Studies on biomarkersin cancer etiology and prevention asummary and challenge of 20 years ofinterdisciplinary research. Mutation Res (2000)462 :255-279 ;和 Yudong D.He.Genomic approach to biomarkeridentification and its recent applications. CancerBiomark. (2006) 2 103-33.)。在分子水平上研究在毒性物質(zhì)作用下生物體內(nèi)各種指標(biāo)特別是生物大分子(核酸、蛋白質(zhì))的變化，可以確定引起毒性產(chǎn)生的效應(yīng)分子生物標(biāo)志物，包括DNA損傷、癌基因活化、抑癌基因失活、代謝活化酶的誘導(dǎo)、代謝解毒酶的抑制、特殊蛋白質(zhì)形成、抗氧化能力降低等。這些生物反應(yīng)比機(jī)體結(jié)構(gòu)的損傷優(yōu)先出現(xiàn)，有助于確定生物體所處的污染狀態(tài)及潛在危害，為嚴(yán)重毒性傷害提供早期警報(bào)。因此，與其它監(jiān)測指標(biāo)相比較，效應(yīng)分子生物標(biāo)志物在準(zhǔn)確、敏感地評價(jià)早期、低水平損害方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。隨著生命科學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，用于評價(jià)遺傳毒性的分子生物標(biāo)志物不斷被建立，例如特定基因的P21、p53、堿基修飾物的8-羥脫氧鳥苷等。目前，人類基因組計(jì)劃已進(jìn)入功能基因組學(xué)研究階段，基因功能研究的高速發(fā)展為新的分子生物標(biāo)志物的探索與研究帶來了機(jī)遇，我國在該領(lǐng)域中也已取得了一些成績，但在數(shù)量上、創(chuàng)新性及研究深度上與國外均有較大差距。從基礎(chǔ)研究出發(fā)，探索具有更好特異性和敏感性的新的分子生物標(biāo)志物，對于環(huán)境中的遺傳毒性物質(zhì)的危險(xiǎn)度評估以及開發(fā)毒性更低的藥物并縮短藥物研發(fā)周期都具有重要的意義
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，發(fā)明人致力于研究可以評價(jià)遺傳毒性的有效生物標(biāo)志物。由此，本發(fā)明通過基因表達(dá)圖譜及基因組序列分析，結(jié)合其它分子生物學(xué)檢測手段，篩選并確定了本發(fā)明的用于檢測化合物遺傳毒性的有效標(biāo)志物，并提供了驗(yàn)證生物標(biāo)志物的有效性的實(shí)驗(yàn)證據(jù)以及應(yīng)用生物標(biāo)志物進(jìn)行遺傳毒性檢測的方法。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用生物標(biāo)志物檢測化合物遺傳毒性的方法。本發(fā)明中，所述生物標(biāo)志物為BC005512基因(以下簡稱為BC基因，Gene ID =192885,Official Symbol :BC005512，Genebank 登錄號BC005512. I)。BC 基因位于小鼠 14 號染色體上，該基因具有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本，編碼一個(gè)共同的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)功能尚不清楚。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供小鼠BC基因在檢測化合物遺傳毒性中的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)目的，本發(fā)明提供了一種使用生物標(biāo)志物檢測化合物遺傳毒性的方法，包括以下步驟(I)使用化合物處理小鼠或細(xì)胞得到小鼠組織或細(xì)胞樣本； (2)檢測所述組織或細(xì)胞樣本中生物標(biāo)志物的表達(dá)，其中，所述生物標(biāo)志物為小鼠BC基因，其表達(dá)可用于檢測化合物的遺傳毒性。在本發(fā)明中，所述細(xì)胞為小鼠來源的細(xì)胞，可為小鼠胚胎成纖維NIH/3T3細(xì)胞。在本發(fā)明中，所述生物標(biāo)志物的表達(dá)是通過檢測BC基因的mRNA的表達(dá)來進(jìn)行的。在本發(fā)明中，可以使用下列引物進(jìn)行所述BC基因的mRNA表達(dá)的檢測正向引物5-ATCACCCTGCATCCAGITTAG-3 ；反向引物5-TAITGCCGCTAGGTCTTCAIT-3。本發(fā)明中，采用簡便、快捷、準(zhǔn)確的Real Time-PCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)方法即可應(yīng)用所述生物標(biāo)志物進(jìn)行遺傳毒性的檢測。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)目的，提供了本發(fā)明的檢測化合物遺傳毒性的方法在新藥開發(fā)早期遺傳毒性篩選中的應(yīng)用。本發(fā)明的使用生物標(biāo)志物檢測化合物遺傳毒性的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(I)本發(fā)明通過基因表達(dá)圖譜及基因組序列分析，結(jié)合其它分子生物學(xué)檢測手段，提供了一段可以用于評價(jià)遺傳毒性的基因序列，該基因由遺傳毒性物質(zhì)特異性誘導(dǎo)表達(dá)，而非遺傳毒性的化合物對其表達(dá)幾乎不產(chǎn)生影響，并且敏感性強(qiáng)，基因表達(dá)穩(wěn)定。(2)本發(fā)明采用Real Time-PCR即可應(yīng)用所述生物標(biāo)志物進(jìn)行遺傳毒性的檢測。(3)本發(fā)明提供的化合物毒性檢測方法具有準(zhǔn)確、敏感性高且操作簡便的特點(diǎn)，因此可以作為藥物安全性評價(jià)候選方法，用于新藥開發(fā)早期遺傳毒性篩選。


圖I是本發(fā)明的使用生物標(biāo)志物進(jìn)行化合物遺傳毒性檢測的方法流程圖。圖2是顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中采用基因芯片技術(shù)找到的與遺傳毒性密切相關(guān)的基因。圖3是顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中基因芯片檢測遺傳毒性物質(zhì)與非遺傳毒性物質(zhì)誘導(dǎo)小鼠肝臟中BC基因的表達(dá)的圖。圖4是顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中Real Time-PCR檢測遺傳毒性物質(zhì)與非遺傳毒性物質(zhì)誘導(dǎo)小鼠肝臟中BC基因的表達(dá)的圖。
圖5是顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中遺傳毒性物質(zhì)與非遺傳毒性物質(zhì)誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3細(xì)胞中BC基因的表達(dá)的圖。圖6是顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中BC基因表達(dá)與微核生成率、Y -H2AX水平以及DNA損傷程度之間的相關(guān)性的圖。圖7是顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中RNA抽提的操作流程的圖。
圖8是顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中Real Time-PCR在基因表達(dá)檢測中的應(yīng)用，其中圖8a為Real Time-PCR的融解曲線的圖，圖8b為Real Time-PCR的擴(kuò)增曲線的圖，圖8c為Real Time-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I采用基因芯片技術(shù)尋找評價(jià)遺傳毒性的有效標(biāo)志物在探索分子生物標(biāo)志物的研究中，芯片技術(shù)發(fā)揮了不可低估的作用。通過基因表達(dá)圖譜及基因組序列分析，結(jié)合其它檢測手段如Real Time-PCR確認(rèn)mRNA表達(dá)和WesternBlot檢測蛋白表達(dá)水平，最終可以確定引起毒性產(chǎn)生的效應(yīng)分子生物標(biāo)志物。我們選擇了7個(gè)已知具有遺傳毒性并且作用機(jī)制不同的化合物ENU、DPN、DEN、DMN、o-AAT、DBP和DMBA，使用在預(yù)實(shí)驗(yàn)中可產(chǎn)生遺傳毒性的劑量對8周齡的正常雄性B6C3F1小鼠(由日本CLEA公司提供)腹腔單次給藥，選擇了 3個(gè)具有毒性但是并非遺傳毒性的化合物DEHP、PB和EtOH，以1/2半數(shù)致死量(LD50)劑量對小鼠單次給藥，表I示出了上述化合物和相應(yīng)劑量。分別于給藥后4小時(shí)、20小時(shí)、14天和28天提取肝臟總RNA,按照AfTymetrix公司操作手冊(Affymetrix Inc. , Santa Clara, CA)推薦的方法，進(jìn)行 cDNA 反轉(zhuǎn)，cRNA 標(biāo)記和 cRNA 片段化，與基因表達(dá)譜芯片(M0E430A)進(jìn)行雜交,用激光掃描儀(AfTymetrixGeneChip Scanner3000)掃描，得到的信號用軟件(Microarray Suite Software, Affymetrix Inc.)分析得到強(qiáng)度，再用軟件(GeneSpring software (SiliconGenetics, Redwood City, CA)分析得到基因表達(dá)圖譜。表I
權(quán)利要求
1.一種使用生物標(biāo)志物檢測化合物遺傳毒性的方法，其中，所述生物標(biāo)志物為小鼠BC基因。
2.一種使用生物標(biāo)志物檢測化合物遺傳毒性的方法，包括以下步驟 1)使用化合物處理小鼠或細(xì)胞得到小鼠組織或細(xì)胞樣本； 2)檢測所述組織或細(xì)胞樣本中生物標(biāo)志物的表達(dá)，其中，所述生物標(biāo)志物為小鼠BC基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為小鼠來源的細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維NIH/3T3細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物標(biāo)志物的表達(dá)是通過檢測BC基因的mRNA的表達(dá)來進(jìn)行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行所述BC基因的mRNA表達(dá)的檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，使用下列引物進(jìn)行所述BC基因的mRNA表達(dá)的檢測 正向引物 5-ATCACCCTGCATCCAGTTTAG-3 ； 反向引物 5-TAITGCCGCTAGGTCTTCAIT-3。
8.小鼠BC基因在檢測化合物遺傳毒性中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使用生物標(biāo)志物檢測化合物遺傳毒性的方法，其中，所述生物標(biāo)志物為小鼠BC基因。具體地，其包括以下步驟1)使用化合物處理小鼠或細(xì)胞得到小鼠組織或細(xì)胞樣本；2)檢測所述組織或細(xì)胞樣本中生物標(biāo)志物的表達(dá)，其中所述生物標(biāo)志物為小鼠BC基因，其表達(dá)可用于檢測化合物的遺傳毒性。本發(fā)明提供的化合物毒性檢測方法具有準(zhǔn)確、敏感性高且易操作的特點(diǎn)，因此可以作為藥物安全性評價(jià)候選方法，用于新藥開發(fā)早期遺傳毒性篩選。
文檔編號C12Q1/68GK102732603SQ20111009439
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者任進(jìn), 戚新明, 欒洋, 武元峰, 王以政 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所