專利名稱：馬鈴薯致病疫霉Δ12去飽和酶基因PinD12的功能鑒定與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在馬鈴薯致病疫霉(Phytophthora infestans) Δ 12去飽和酶基因 PinD12的功能鑒定與應(yīng)用，屬于分子生物學和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
必需脂肪酸是指人體生命活動必不可少，但人體自身不能合成，必需由食物供給的多不飽和脂肪酸。必需脂肪酸主要包括兩種，α-亞麻酸和亞油酸。這兩種脂肪酸可以在人體內(nèi)通過其它一系列的酶催化，進一步轉(zhuǎn)化成對人體具有重要生理功能的EPA和DHA等超長鏈多不飽和脂肪酸。在植物體內(nèi)，亞油酸是由Δ 12去飽和酶催化油酸去飽和生成的。克隆、鑒定Δ 12 去飽和酶基因，對利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在油料作物中過量表達高催化活性的△ 12去飽和酶， 從而將其豐富的油酸轉(zhuǎn)化成亞油酸，提高植物油的營養(yǎng)價值，或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物特別是油料作物生產(chǎn)EPA和DHA，具有重要的意義。本發(fā)明在馬鈴薯致病疫霉中克隆到編碼Δ 12去飽和酶的cDNA序列，在釀酒酵母中誘導表達發(fā)現(xiàn)其編碼產(chǎn)物能夠?qū)④浻退?16 1 Δ9)和油酸(18 1 Δ9)分別轉(zhuǎn)化成十六碳二烯酸(16 2Δ9’12)和亞油酸(18 2Δ9’12)，證明了其具有Δ12去飽和酶活性，轉(zhuǎn)化效率最高可分別達52. 和78.0%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先提取馬鈴薯致病疫霉總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用引物 5，-GCAACCAAGTTCATCGCGTT3，和 5，-TCCACCTGACGACCTTAGAG-3，做 PCR，將擴增的片段膠回收后，連接到克隆載體PMD18-T中。生物信息學分析，得到的cDNA片段開放閱讀框部分為 1197bp，編碼398個氨基酸的多肽，具備去飽和酶和電子傳遞有關(guān)的三個組氨酸框結(jié)構(gòu)域 (HxxxH、HxxHH和HxxHH)。該基因cDNA序列如下序列表(I)SEQ ID NO. 1 的信息(a)序列特征*長度1197堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源馬鈴薯致病疫霉(Phytophthora infestans)
(f)序列描述=SEQ IN NO. 1
1ATGGCGATCCTTAACCCGGAGGCAGAGTCAGCCGCCAAGGTGGCTACGCTGTCCGAAGCC
61AAGCAACGTGAGCTTGCCGAGGCCGGCTACAAGCACGTGGAAGGAGCTCCGGCGCCGCTG
121CCGCTGGATCTGCCGCATTTCTCTCTGCGGGATCTTCGCGCTGCCATTCCCAAGCACTGC
181TTCGAGCGCTCCTTCATTACGTCCACGTACTACATGATAAAGAACCTTCTCACGTGTGCT
241GCTCTCTTCTACGCGGCCACCTACATCGACCAGACTGGGAGCTTCGCCTACCTGCTCTGG
301CCTGTGTACTGGTTCTTCCAGGGGAGCTACCTTACTGGCATCTGGGTTGTGGCGCATGAG
361TGCGGCCACCAGGCCTACTGCTCCAGCGAGGTGGTGAACAACATGATCGGTCTCGTGCTG
421CACTCGACGTTGCTTGTGCCGTACCACAGTTGGCGTATTTCACACCGCAAGCACCACTCC
481AATACAGGCAGCTGCGAGAACGACGAGGTGTTCGTACCTGTCACTCGCTCTGTGATCGCC
541AGCTCGTGGGACGAGACGCTCGAGGACTCACCACTCTACCAGCTCTACCGCATCGTGTAC
601ATGCTGGTAGTGGGCTGGATGCCTGGCTACCTCTTCTTCAACGCGACGGGTCCGAGCAAG
661TACTTGGGCAAGTCGCGCAGCCACTTCAACCCGTACTCGTCCATCTACTCAGACCGCGAG
721CGTTGGATGATCGTGCTGAGCGACATCTTCCTCGTGCTTATGATCGGCGCTCTGGTCACA
781CTGGTGTACACCTTCTCGTTCTACACAATGCTCAAGTTCTACGTCGTGCCCTACTTCATC
841GTGAACGCCTACCTTGTGCTCATCACGTACCTGCAGCACACGGACACCTACATCCCGCAC
901TTCCGAGACAGCGAGTGGAACTGGCTGCGCGGTGCGCTCTGCACGGTGGACCGCTCGTTC
961GGCCCGTACCTCGATTCGGTAGTGCACCGCATCGTGGACACGCACATATGCCACCACATC
1021TTCTCCMGATGCCGTTCTACCACTGCGAGGAAGCCACGAACGCTATCAAGCCGCTGCTG
1081GGCAAGTTCTACCTCAAGGACGACACGCCCGTGCCGATCGCTCTGTGGCGATCTTACATT
1141CACTGCAAGTTCGTCGAGGACGACGGCAAGATCGTGTTCTACAAGAACAAGCTCTAA
(2) SEQ IN NO. 2 的信息
(a)序列特征
*長度398氨基菌I
*類型氨基酸
*鏈型單鏈
*拓撲結(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型蛋白質(zhì)
序列描述
MET .Ala lie LeuAsn Pro Glu Ala Glu Ser Ala AlaLys Val Ala
151015
ThrLeu Ser GluAla Lys Gln Arg Glu Leu Ala GluAla Gly Tyr
202530
Lys His Val GluGly Ala Pro Ala Pro Leu Pro LeuAsp Leu Pro
354045
His Phe Ser LeuArg Asp Leu Arg Ala Ala lie ProLys His Cys
505560
Phe丨Glu Arg SerPhe lie Thr Ser Thr Tyr Tyr METlie Lys Asn
657075Leu Gln Phe Cys Ile Trp Glu Ser Tyr Leu Arg Arg Gly Leu Val Phe Val Ile Phe Gly
Leu Thr Gln Gly Gly Arg Asn Ser Arg Phe Ser Trp Ala Lys Leu Arg Asp Val Tyr Lys
Thr Gly Gly His Leu Ile Asp Trp Ile Phe His MET Leu Phe lie Asp Arg Asp His Phe
Cys Ser Ser Gln Val Ser Glu Asp Val Asn Phe lie Val Tyr Thr Ser Ser Thr Cys Tyr
Ala 80 Phe 95 Tyr 110 Ala 125 Leu 140 His 155 Val 170 Glu 185 Tyr 200 Ala 215 Asn 230 Val 245 Thr 260 Val 275 Tyr 290 Glu 305 Phe 320 His 335 Glu 350 Leu
Ala Ala Leu Tyr His Arg Phe Thr MET Thr Pro Leu Leu Val Leu Trp Gly lie Glu Lys
Leu Tyr Thr Cys Ser Lys Val Leu Leu Gly Tyr Ser Val Pro Gln Asn Pro Cys Ala Asp
Phe Leu Gly Ser Thr His Pro Glu Val Pro Ser Asp Tyr Tyr His Trp Tyr His Thr Asp
Tyr Leu lie Ser Leu His Val Asp Val Ser Ser lie Thr Phe Thr Leu Leu His Asn Thr
Ala 85 Trp 100 Trp 115 Glu 130 Leu 145 Ser 160 Thr 175 Ser 190 Gly 205 Lys 220 lie 235 Phe 250 Phe 265 lie 280 Asp 295 Arg 310 Asp 325 lie 340 Ala 355 Pro
Ala Pro Val Val Val Asn Arg Pro Trp Tyr Tyr Leu Ser Val Thr Gly Ser Phe lie Val
Thr Val Val Val Pro Thr Ser Leu MET Leu Ser Val Phe Asn Tyr Ala Val Ser Lys Pro
Tyr Tyr Ala Asn Tyr Gly Val Tyr Pro Gly Asp Leu Tyr Ala lie Leu Val Lys Pro lie
lie Trp His Asn His Ser lie Gln Gly Lys Arg MET Thr Tyr Pro Cys His MET Leu Ala
Asp 90 Phe 105 Glu 120 MET 135 Ser 150 Cys 165 Ala 180 Leu 195 Tyr 210 Ser 225 Glu 240 lie 255 MET 270 Leu 285 His 300 Thr 315 Arg 330 Pro 345 Leu 360 Leu
365370375Trp Arg Ser Tyr lie His Cys Lys Phe Val Glu Asp Asp Gly Lys380385390lie Val Phe Tyr Lys Asn Lys Leu395用Hindi和XbaI從pMD18_T載體切下該片段，插入到酵母表達載體pYES2中的 GALl啟動子的下游。將構(gòu)建好的酵母表達載體pYES2-PinD12轉(zhuǎn)入釀酒酵母YPH500。在半乳糖的誘導下，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白能夠分別將酵母自身的軟油酸(16 1Δ9)和油酸 (18 1 Δ9)分別轉(zhuǎn)化成十六碳二烯酸(16 2Δ9’12)和亞油酸(18 2 Δ9’12)，并且轉(zhuǎn)化率最高可分別達到52. 和78. 0%，具有△ 12去飽和酶活性，故將此cDNA命名為PinD12。根據(jù)上述技術(shù)，從馬鈴薯致病疫霉中分離到了一個高活性的的Δ 12去飽和酶基因，其編碼的蛋白具有△ 12去飽和酶活性，能夠?qū)④浻退岷陀退岱謩e轉(zhuǎn)化成十六碳二烯酸和亞油酸，這對通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，增加植物油份中必需脂肪酸的含量，提高植物油的營養(yǎng)價值，或通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物特別是油料作物生產(chǎn)EPA和DHA，具有重要的意義。


圖1是PCR擴增馬鈴薯致病疫霉Δ 12去飽和酶基因PinD12的cDNA瓊脂糖凝膠電泳圖片M代表分子量標記，1代表PinD12 cDNA條帶圖2是酵母表達載體pYES_PinD12構(gòu)建示意圖及酶切驗證圖A代表pYES2-PinD12載體構(gòu)建示意圖，B代表HindIII和XbaI酶切驗證圖；M代表分子量標記，2代表線性化pYES2載體條帶，3代表PinD12 cDNA條帶圖3是釀酒酵母YPH500 (含pYES2_PinD12)在不誘導/誘導條件下氣相色譜檢測圖橫坐標表示保留時間，縱坐標表示信號強度；-GAL表示不添加半乳糖誘導，+GAL 表示添加半乳糖誘導；色譜峰上的數(shù)字表示檢測到的脂肪酸成分，16 0，軟脂酸；16 1， 軟油酸；16 2，十六碳二烯酸；18 0，硬脂酸；18 1，油酸；18 2，亞油酸；紅色箭頭指示的檢測到的新產(chǎn)物。(五)具體發(fā)明實施方式實施例1 馬鈴薯致病疫霉Δ 12去飽和酶基因PinD12的獲得1.馬鈴薯致病疫霉的培養(yǎng)接種馬鈴薯致病疫霉到新鮮的燕麥培養(yǎng)基，20度，黑暗培養(yǎng)。2.總RNA的提取收集生長15天左右的菌絲體，利用TRIZOL法(Invitrogen)提取總RNA。3.取 2 微克總 RNA，用 MMLV Reverse Transcriptase(Promega)反轉(zhuǎn)錄成單鏈 cDNA。4.以所獲得的馬鈴薯致病疫霉的cDNA為模板，用引物 5，-GCAACCAAGTTCATCGCGTT3-，和 5，-TCCACCTGACGACCTTAGAG-3，做 PCR，PCR 體系ddH20 35. 5 μ 1 ； IOXpcr buffer (含 Mg2+) 5 μ 1 ； dNTP(2. 5mM)4y 1 ；引物(5 μ Μ)各 2μ 1 ；模板 1μ 1 ； Taq酶0. 5 μ 1。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸1分鐘，35個循環(huán)；72°C延伸10分鐘。將擴增的片段膠回收后，連接到克隆載體PMD18-T中。5.序列測定本工作在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行。獲得一條 1197bp 的 cDNA 片段。6.同源檢索利用BLAST軟件將上述獲得的cDNA片段編碼的氨基酸序列與基因銀行中的序列進行比較，發(fā)現(xiàn)它具有去飽和酶所具有的三個富含組氨酸的保守區(qū)域HxxxH、 HxxHH、HxxHH，確定它屬于脂肪酸去飽和酶基因。實施例2 馬鈴薯致病疫霉Δ 12去飽和酶基因PinD12，如下序列(I)SEQ ID NO. 1 的信息(a)序列特征*長度1197堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源馬鈴薯致病疫霉(Phytophthora infestans)(f)序列描述:SEQ IN NO. 1
0127]1ATGGCGATCCTTAACCCGGAGGCAGAGTCAGCCGCCAAGGTGGCTACGCTGTCCGAAGCC0128]61AAGCAACGTGAGCTTGCCGAGGCCGGCTACAAGCACGTGGAAGGAGCTCCGGCGCCGCTG0129]121CCGCTGGATCTGCCGCATTTCTCTCTGCGGGATCTTCGCGCTGCCATTCCCAAGCACTGC0130]181TTCGAGCGCTCCTTCATTACGTCCACGTACTACATGATAAAGAACCTTCTCACGTGTGCT0131]241GCTCTCTTCTACGCGGCCACCTACATCGACCAGACTGGGAGCTTCGCCTACCTGCTCTGG0132]301CCTGTGTACTGGTTCTTCCAGGGGAGCTACCTTACTGGCATCTGGGTTGTGGCGCATGAG0133]361TGCGGCCACCAGGCCTACTGCTCCAGCGAGGTGGTGAACAACATGATCGGTCTCGTGCTG0134]421CACTCGACGTTGCTTGTGCCGTACCACAGTTGGCGTATTTCACACCGCAAGCACCACTCC0135]481AATACAGGCAGCTGCGAGAACGACGAGGTGTTCGTACCTGTCACTCGCTCTGTGATCGCC0136]541AGCTCGTGGGACGAGACGCTCGAGGACTCACCACTCTACCAGCTCTACCGCATCGTGTAC0137]601ATGCTGGTAGTGGGCTGGATGCCTGGCTACCTCTTCTTCAACGCGACGGGTCCGAGCAAG0138]661TACTTGGGCAAGTCGCGCAGCCACTTCAACCCGTACTCGTCCATCTACTCAGACCGCGAG0139]721CGTTGGATGATCGTGCTGAGCGACATCTTCCTCGTGCTTATGATCGGCGCTCTGGTCACA0140]781CTGGTGTACACCTTCTCGTTCTACACAATGCTCAAGTTCTACGTCGTGCCCTACTTCATC0141]841GTGAACGCCTACCTTGTGCTCATCACGTACCTGCAGCACACGGACACCTACATCCCGCAC0142]901TTCCGAGACAGCGAGTGGAACTGGCTGCGCGGTGCGCTCTGCACGGTGGACCGCTCGTTC0143]961GGCCCGTACCTCGATTCGGTAGTGCACCGCATCGTGGACACGCACATATGCCACCACATC0144]1021TTCTCCMGATGCCGTTCTACCACTGCGAGGAAGCCACGAACGCTATCAAGCCGCTGCTG0145]1081GGCAAGTTCTACCTCAAGGACGACACGCCCGTGCCGATCGCTCTGTGGCGATCTTACATT0146]1141CACTGCAAGTTCGTCGAGGACGACGGCAAGATCGTGTTCTACAAGAACAAGCTCTAA0147](3) SEQ IN NO. 2 的信息(a)序列特征
*長度398氨基酸 *類型氨基酸 *鏈型單鏈 *拓撲結(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型蛋白質(zhì)
(c)序列描述 MET Ala lie Leu 1
Ser
Thr Leu Lys His Val Phe Glu
His
Gln Phe Cys lie Trp Glu
Tyr
Leu
Glu Glu Ser Leu
Phe
Leu Leu
Thr Gln Gly Gly Arg Asn
Ser Ser
Arg Phe
Arg Thr Gly Gly His Leu lie Asp Trp lie Phe
Arg Ser His
Ser Cys Ser Ser Gln Val Ser Glu Asp Val Asn Phe
Asn 5
Ala 20 Gly 35 Arg 50 Phe 65 Ala 80 Phe 95 Tyr 110 Ala 125 Leu 140 His 155 Val 170 Glu 185 Tyr 200 Ala 215 Asn 230
Pro Lys Ala Asp lie Ala Ala Leu Tyr His Arg Phe Thr MET Thr Pro
Glu Gln Pro Leu Thr Leu Tyr Thr Cys Ser Lys Val Leu Leu Gly Tyr
Ala Arg Ala Arg Ser
Pro Glu Val
Glu Glu Pro Ala Thr
Phe Tyr
Leu Leu
Gly lie
Ser Ser
Thr Leu
His His
Val Asp Val
Pro Ser
Ser Ser
Ser 10 Leu 25 Leu 40 Ala 55 Tyr 70 Ala 85 Trp 100 Trp 115 Glu 130 Leu 145 Ser 160 Thr 175 Ser 190 Gly 205 Lys 220 lie 235
Ala Ala
Ala Glu
Pro Leu
lie Tyr Ala Pro Val Val Val Asn Arg
Pro MET Thr Val Val Val Pro Thr Ser
Pro Leu
Trp Tyr Tyr
MET
Leu
Ser
Lys Val Ala 15
Ala Gly Tyr 30
Asp Leu Pro 45
Lys His Cys 60
lie Lys Asn 75
Tyr lie Asp 90
Tyr Trp Phe 105
Ala His Glu 120
Asn Asn MET 135
Tyr His Ser 150
Gly Ser Cys 165
Val lie Ala 180
Tyr Gln Leu 195
Pro Gly Tyr 210
Gly Lys Ser 225
Asp Arg Glu 240
權(quán)利要求
1. 一個馬鈴薯致病疫霉Δ 12去飽和酶基因PinD12的應(yīng)用，其特征在于該基因所編碼的蛋白能夠?qū)㈤L鏈多不飽和脂肪酸軟油酸和油酸分別轉(zhuǎn)化成十六碳二烯酸和亞油酸，可以用于植物特別是油料作物中油份改良。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種馬鈴薯致病疫霉Δ12去飽和酶基因PinD12的功能鑒定與應(yīng)用，通過RT-PCR的方法，在馬鈴薯致病疫霉中分離到的與魚油合成相關(guān)的Δ12去飽和酶基因PinD12，屬于分子生物學和生物技術(shù)領(lǐng)域。經(jīng)過酵母表達鑒定，確定它是一個新的Δ12去飽和酶基因，其編碼的Δ12去飽和酶能夠?qū)㈤L鏈多不飽和脂肪酸軟油酸和油酸分別轉(zhuǎn)化成十六碳二烯酸和亞油酸，可以用于植物特別是油料作物中油份改良。
文檔編號C12R1/645GK102220352SQ201110094579
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月4日
發(fā)明者亓寶秀, 孫全喜, 李新征 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學