用于鑒定具有基因毒性的化合物的蛋白表達分析的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于篩選具有(前-)基因毒性活性的化合物的方法，所述方法通過提供能夠表達一組確定的蛋白的系統(tǒng)，用待篩選的化合物溫育至少部分系統(tǒng)，并將系統(tǒng)中的蛋白表達與對照系統(tǒng)中的蛋白表達相比較，從而檢測(前-)基因毒性活性來進行。本發(fā)明的另一個目的涉及用于通過測定取自哺乳動物的生物樣品中確定的蛋白的表達水平來監(jiān)控發(fā)生生理和/或病理狀況的可能性的方法，所述狀況通過響應給需要這樣的治療的哺乳動物施用的化合物而導致的增殖、分化和/或損傷修復的失調(diào)引起、介導和/或傳播。本發(fā)明還涉及用于篩選具有(前-)基因毒性活性的化合物的試劑盒，其包含特異性結合標志蛋白的抗體。
【專利說明】用于鑒定具有基因毒性的化合物的蛋白表達分析
[0001] 本發(fā)明涉及用于篩選具有（前_)基因毒性活性的化合物的方法，所述方法通過提 供能夠表達一組確定的蛋白的系統(tǒng)，用待篩選的化合物溫育至少部分系統(tǒng)，將系統(tǒng)中的蛋 白表達與對照系統(tǒng)中的蛋白表達相比較，從而檢測（前-)基因毒性活性來進行。本發(fā)明的 另一個方面涉及用于通過測定從哺乳動物取出的生物樣品中確定的蛋白的表達水平來鑒 定發(fā)生生理和/或病理狀況的方法，所述狀況通過響應給需要這樣的治療的哺乳動物施用 的化合物而導致的增殖、分化和/或損傷修復的失調(diào)引起、介導和/或傳播。本發(fā)明還涉及 用于篩選具有（前-)基因毒性活性的化合物的試劑盒，其包含特異性結合標志蛋白的抗 體。
[0002] 化合物的潛在基因毒性的全面評價在化學藥品危險性評估和藥物開發(fā)過程中是 非常重要的部分。目前的標準測試組合包括被設計來檢測通過多種不同作用機制誘導DNA 損傷的化合物的體外和體內(nèi)測試。需要細菌回復突變測定以及在體外和/或體內(nèi)利用哺 乳動物細胞進行的基因毒性測試。由于在這些測試中被測試為陽性的化合物是潛在人的 致癌物，因此基因毒性測試系統(tǒng)的重要性增加。然而，標準測試組合具有低通量，從而需 要相當大量的化合物。為此，這些測試在早期藥物發(fā)現(xiàn)階段是不太適合的（Westerink等 人，2011，Mutat. Res. 724, 7-21)。
[0003] 通常地，原本不是體內(nèi)基因毒素或不通過致誘變或DNA反應性機制誘導腫瘤的化 學藥品在哺乳動物細胞測試中產(chǎn)生假陽性結果，這使人的危險外推復雜化。
[0004] 此外，根據(jù)EU REACH法規(guī)中的化學藥品表征和現(xiàn)代風險評價，機理分析日益變得 重要。
[0005] 困難現(xiàn)正在強迫新的體外工具的發(fā)展。需要具有增加的特異度（即更少的假陽 性結果）而不丟失靈敏度（即檢測DNA反應性致癌物和體內(nèi)基因毒素）的新型基因毒 性測試系統(tǒng)（Kirkland 等人，2005, Mutat. Res. 584, 1-256 ;Kirkland 等人，2006, Mutat. Res. 608, 29-42 ;Kirkland 等人，2008, Mutat. Res. 653, 99-108)。
[0006] 因此，形成本發(fā)明的基礎的技術問題是提供用于篩選化合物的方法，所述方法有 效地使得能夠鑒定和表征它們的基因毒性和/或前基因毒性性質(zhì)。本發(fā)明的另一個問題是 提供用于檢測基因毒性和/或前-基因毒性活性的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明通過提供用于篩選具有基因毒性和/或前-基因毒性活性的化合物的 方法來解決問題，所述方法包括測定至少兩種蛋白（選自p_p53(Serl5)、p21、p-H2A. X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl(Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/Tyrl5)、 Gadd45a和p-Chk2 (Thr68))的活性形式在利用一種或多種化合物溫育的系統(tǒng)中的表達水 平相對于所述蛋白在大體上未用所述化合物或相同濃度的所述化合物溫育的系統(tǒng)中的表 達水平的步驟。
[0008] 本發(fā)明人已令人驚訝地顯示至少兩種所述蛋白的組合與基因毒性相關。因此，前 述多種標志蛋白代表新型基因毒性標志物，所述標志物十分適合用于區(qū)分基因毒性的階 段。下面的蛋白（the underlying proteins)被選擇為差異表達分析的結果。通過針對 未處理細胞的獨特差異來表征所有蛋白的表達，其中經(jīng)處理的細胞顯示體現(xiàn)于上調(diào)的差 異。在本領域中已描述了所測定的蛋白的序列和其它特征，但在本發(fā)明的定義的組合中缺 乏與基因毒性的聯(lián)系。配對標志蛋白組合（任選地補充以另外的標志蛋白）的任一個可用 于最大限度的測試可靠性。蛋白可能以另一種方式命名，但唯一地通過被許多數(shù)據(jù)庫例如 UniProt、SwissProt 等（參考資料表 I ;Zhou 和 Bartek, 2004, Nat Rev Cancer4, 216-25) 普遍接受并已于其中注冊的登錄號來定義。
[0009] 雖然所鑒定的9種蛋白參與DNA-損傷-反應信號-傳導網(wǎng)絡，但它們并不一定如 目前已知的，以它們的實體在功能或位置上發(fā)生關聯(lián)，但不排除這樣的聯(lián)系出現(xiàn)在組的單 個成員或更多成員之間。
[0010] DNA-損傷-反應信號-傳導網(wǎng)絡由至少兩個不同的途徑組成：共濟失調(diào)性毛細血 管擴張癥突變激酶（ATM)和共濟失調(diào)性毛細血管擴張突變及Rad3相關（ATR)途徑。響應 損傷的DNA，ATM途徑通過ATM在Serl981上的自磷酸化來起始。ATM通過數(shù)種蛋白的磷酸 化來調(diào)節(jié)細胞周期檢查點和DNA修復。ATR途徑響應DNA雙鏈斷裂（DSB)(盡管比ATM慢） 和干擾DNA復制叉的化學藥品。存在可導致ATR活化的兩個可磷酸位點（p-ATR(Ser428)和 p-ATR(Thrl989))。最初識別異常DNA結構并活化DNA損傷反應網(wǎng)絡的傳感器還不清楚。
[0011] DNA損傷反應的極早期事件是通過ATM在Serl39上對組蛋白H2A. X進行的磷酸 化。磷酸化H2A. X在DNA損傷位點上積累，并招募多種DNA損傷反應和DNA修復信號。
[0012] DNA雙鏈斷裂誘導ATM對Chk2在Thr68和該區(qū)域中的其它位點上的磷酸化，這導 致P53-依賴性或不依賴于p53的細胞周期停滯和/或細胞凋亡。
[0013] p53在位置Serl5上的磷酸化（特別地通過ATM)阻止了 mdm2結合的能力并阻止 其降解。磷酸化，從而被激活的P53用作數(shù)個基因（包括蛋白p21以及生長停滯和DNA損 傷誘導蛋白a(Gadd45a)的基因）的轉(zhuǎn)錄因子。P21抑制導致細胞周期在Gl期停滯的不同 細胞周期蛋白依賴性激酶。此外，P21抑制PCNA并中斷DNA復制。誘導的細胞核Gadd45a 與細胞周期蛋白依賴性激酶2(cdc2)相互作用，并導致其從cd C2/Cyclin BI復合物解離。 游離細胞周期蛋白Bl被輸出至細胞質(zhì)內(nèi)，并通過泛素化降解。Gadd45a從而抑制cdc2激酶 活性，細胞保持在進入有絲分裂的過渡期。
[0014] 除了 cdc2激酶的Gadd45a介導的抑制外，還發(fā)生通過Chkl的調(diào)節(jié)。Chkl可被激 酶ATM和ATR激活，但Chkl在Ser345和Ser317的磷酸化通過ATR來進行。Chkl能夠在 Ser216上磷酸化磷酸酶Cdc25C，這使cdc2在ThrH和Tyrl5上不能丟失抑制磷酸化，并且 細胞保持在G2/M過渡期。
[0015] 如上論述的蛋白和相關分子的分析顯示例如響應H印G2細胞對（前-)基因毒性 劑的暴露的細胞死亡和存活的復雜調(diào)控。主要受影響的過程包括細胞周期調(diào)控、細胞增殖 和細胞凋亡。經(jīng)發(fā)現(xiàn)被差異調(diào)控的蛋白可多半被賦予促細胞凋亡和抗增殖功能。數(shù)據(jù)顯示 響應化合物誘導的DNA損傷的細胞周期停滯和程序化細胞死亡的誘導。
[0016] 基因毒性與獨特蛋白的聯(lián)系被用于誘變劑和前誘變劑的體外檢測，所述誘變劑和 前誘變劑能夠干擾增殖、分化或損傷修復的信號傳導?；诒景l(fā)明的眾多蛋白建立化合物 特異性蛋白表達特征譜在建立基因毒性效應機制中具有預料之外的益處，從而支持對經(jīng)典 篩選法是替代性或補充性的新型化合物的潛在危害或益處的評價。本發(fā)明方法背后的發(fā)明 原理包括檢測確定的蛋白。針對其絕對和相對量以及對特定細胞類型的特異性來選擇基因 產(chǎn)物。
[0017] "蛋白"是指包含一種或多種多肽的生物化學化合物。多肽是通過相鄰氨基酸殘基 的羧基與氨基之間的肽鍵鍵合在一起的氨基酸的單個線性聚合物。其通常折疊成球形或纖 維形式以有利于生物功能。蛋白的"活性形式"是指蛋白中的殘基通常被翻譯后修飾化學修 飾的事實，所述修飾改變蛋白的物理和化學性質(zhì)、折疊、穩(wěn)定性、活性，最終改變其功能。例 如，轉(zhuǎn)錄因子P53的活性依靠蛋白磷酸化來決定性調(diào)控，所述磷酸化可通過多個信號，包括 一般細胞應激、DNA損傷或干擾素來誘導。
[0018] 如本文中所用，"多種蛋白〃是指其在不同組織、細胞中或在不同條件或生物學狀 態(tài)下表達水平變化的一組經(jīng)鑒定的或經(jīng)分離的蛋白。不同條件可通過暴露于特定試劑（無 論是外源性的還是內(nèi)源性的，其包括激素、受體配體、化合物等）產(chǎn)生。多種蛋白的表達顯 示特定模式。即，多種蛋白中的每一種蛋白在不同條件下或在暴露或不暴露于特定內(nèi)源性 或外源性試劑的情況下差異表達。每一種蛋白的表達程度或水平在多種蛋白中可變化，并 且可按照本發(fā)明來定性和/或定量地測定。如本文中所用，蛋白表達特征譜是指在不同水 平上差異表達的多種蛋白，其構成"模式"或"特征譜"。如本文中所用，術語〃表達特征譜 〃、〃特征譜〃、〃表達模式〃、〃模式〃、〃蛋白表達特征譜〃和〃蛋白表達模式〃可互換使 用。
[0019] 如本文中所用，"具有基因毒素活性的化合物"也稱為"誘變劑"，其為改變生物體 的基因物質(zhì)（通常地DNA)，從而使突變頻率增加至高于天然背景水平的物理或化學試劑。 本領域普通技術人員已知，例如誘變劑的生物作用之一是促進癌癥的發(fā)展。誘變劑的其它 生物作用已被詳盡記錄和討論。突變產(chǎn)生的核酸序列的變化包括核苷酸堿基對的置換以及 一個或多個核苷酸在DNA序列中的插入和缺失。
[0020] 首先，提供了系統(tǒng)，并將其整體或部分溫育。系統(tǒng)在下文中也稱為測試系統(tǒng)。雖然 細胞系統(tǒng)在本發(fā)明的范圍內(nèi)是優(yōu)選的，但可選擇地可使用基于無活細胞蛋白合成的體外翻 譯系統(tǒng)。細胞系統(tǒng)被定義為任何受試者，只要所述受試者包含細胞。因此，細胞系統(tǒng)可選自 單細胞、細胞培養(yǎng)物、組織、器官、植物和動物。細胞系統(tǒng)的范圍還包括這樣的生物實體的部 分，即組織、器官、植物和動物的樣品。除植物外，還應理解按上述序列每一種細胞系統(tǒng)可代 表下列各自系統(tǒng)的樣品。細胞樣品、非人動物、哺乳動物或非人哺乳動物是根據(jù)本發(fā)明的細 胞系統(tǒng)的優(yōu)選實施方案。細胞樣品是指以分離狀態(tài)、培養(yǎng)物形式存在的或作為細胞系存在 的任何類型的原代細胞或基因工程細胞。具體地，從待測試的哺乳動物體內(nèi)或原位獲得細 胞樣品。細胞樣品的取出遵照醫(yī)療管理規(guī)范。生物樣品可取自任何類型的生物物種，但樣 品特別地取自人、大鼠或小鼠。
[0021] 在本發(fā)明中，細胞系統(tǒng)還可包括生物液體，其中體液的樣品優(yōu)選由血液、血清、血 漿、唾液或尿組成。還優(yōu)選地通過生物活組織檢查收集組織樣品，特別地從靠近疾病的位置 獲取樣品。生物樣品可獲自任何組織，包括肝、腎、腸、骨髓等。在優(yōu)選實施方案中，生物樣 品來自腎、肝和腸。可純化樣品以除去干擾物質(zhì)，例如氫鍵形成的抑制劑。
[0022] 系統(tǒng)能夠表達或表達數(shù)種蛋白 p53、p21、H2A. X、ATM、Chkl、ATR、cdc2、Gadd45a 或Chk2。在本發(fā)明的實施方案中，系統(tǒng)額外地能夠表達或表達MDM2。系統(tǒng)還能夠激活或 激活數(shù)種蛋白 P_p53(Serl5)、p21、P-H2A. X (Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl (Ser345)、 p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 p-Chk2(Thr68)。系統(tǒng)優(yōu)選能夠表達 或表達選自 p-p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl(Ser345)、 p_ATR(Ser428)、p_cdc2 (Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 p_Chk2 (Thr68)的至少兩種蛋白的 活性形式。更優(yōu)選地，系統(tǒng)能夠表達或表達選自P_p53(Serl5)、p21、p-H2A. X(Serl39) 和p-Chkl (Ser345)的至少兩種蛋白的活性形式。最優(yōu)選，系統(tǒng)能夠表達或表達選自 p-p53 (Serl5)、p21、P-H2A. X (Serl39)、p-ATM (Serl981)和 p-Chkl (Ser345)的至少兩種蛋 白的活性形式。
[0023] 應理解，具有相同功能的變體、突變體、部分或同源蛋白序列包括在定義以及保護 的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，同源性總計至少85%?？赡艿母淖儼ㄖ辽僖粋€氨基酸的缺失、插入、 置換、修飾和添加，或與另一個肽或蛋白的融合。工程細胞能夠在用具有潛在核酸序列或其 部分的適當載體轉(zhuǎn)染后表達這些蛋白。優(yōu)選地，重組細胞具有真核生物來源。
[0024] 在本發(fā)明的更優(yōu)選實施方案中，提供了用于篩選法的H印G2細胞。使用的S9的劑 量對實驗結果具有影響，盡管在細胞毒性評價中是陰性的。應當指出所述劑量可與調(diào)控標 準基因毒性測試中使用的劑量相比較。顯著地受S9調(diào)控的基因與通過（前_)基因毒性劑 誘導的基因不同，S9-作用可通過與適當?shù)膶φ毡容^來調(diào)整。在任何情況下，具有足夠的固 有代謝活性的細胞系統(tǒng)一定是適當?shù)?，但目前不存在用于基因毒性評價的這樣的具有代謝 能力的細胞系統(tǒng)。原代肝細胞是目前用于藥物代謝和CYP誘導/抑制的體外研究的金標準。 盡管成熟分化的肝細胞缺乏增殖能力（從而使它們成為不適當?shù)幕蚨拘匝芯康哪Ｐ停?它們還在人肝細胞的培養(yǎng)、有限利用中顯示形態(tài)學以及蛋白和基因表達的顯著變化，和通 常顯著的供體/批次可變性而使這樣的系統(tǒng)的標準化復雜化，但H印G2細胞的主要有利方 面是它們的人分子特征。例如，特異性靶例如拓撲異構酶和真核生物修復酶被表達，并且防 止基因毒性的高估，從而促成假陽性減少。
[0025] 將細胞樣品貯存（例如冷凍）、培養(yǎng)一定時期或立即經(jīng)歷下一步驟。在用待篩選 的化合物溫育其之前，可將細胞樣品分成多個部分。如果這樣做，提供至少兩個部分；一個 部分用于篩選而另一部分用作對照。優(yōu)選地，用于篩選的部分的數(shù)目超過對照部分的數(shù)目。 通常地，將許多部分經(jīng)歷高通量篩選。
[0026] 化合物由能夠與靶分子相互作用的生物和/或化學結構組成。在本文中，基因組 學或蛋白組學信號轉(zhuǎn)導的任何組分可被當作"靶分子"，所述靶分子不限于基因或調(diào)節(jié)子蛋 白或其基因產(chǎn)物，或信號轉(zhuǎn)導途徑的組分，包括其基因或基因產(chǎn)物。因此，化合物的特定相 互作用可牽涉僅僅靶向或細胞功能改變的誘導，或其可甚至同時包括兩種作用。
[0027] 總之，在本發(fā)明方法中待篩選的化合物不受限制。具體地，化合物選自核酸、肽、碳 水化合物、具有50至I. OOODa的分子量的小分子和蛋白。這些化合物通常可在文庫中獲得。 優(yōu)選在細胞樣品的不同部分內(nèi)溫育單種化合物。然而，還可能通過在一個部分內(nèi)溫育至少 兩種化合物來研究化合物的作用。當用一種或多種待分析的（前_)基因毒性化合物溫育 細胞系統(tǒng)的一部分時，在化合物不存在的情況下溫育細胞的另外部分，系統(tǒng)的該另外的非 處理部分用作陰性對照。通過在暴露于基因毒性應激之前測定狀態(tài)，并將其與基因毒性應 激后的狀態(tài)相比較，系統(tǒng)還可能同時用作測試和對照系統(tǒng)。其它對照系統(tǒng)概述于下文中。
[0028] 術語"溫育"表示化合物與細胞進行不同時期的接觸，這取決于化合物和/或靶的 類型。溫育過程還取決于各種其它參數(shù)，例如細胞類型和檢測的靈敏度，該最優(yōu)化遵從本領 域普通技術人員已知的常規(guī)過程?？稍谡T變劑的化學轉(zhuǎn)化不存在的情況下實現(xiàn)溫育過程， 或可包括前誘變劑的代謝轉(zhuǎn)化。添加化學藥品溶液和/或施加物理過程例如熱的影響，可 改善樣品中靶結構的可及性。作為溫育的結果，形成特定溫育產(chǎn)物。
[0029] 在本發(fā)明的意義上有效化合物的鑒定通過測定系統(tǒng)能夠表達的至少兩種確定的 蛋白的表達模式來間接進行。在指定的時刻進行測定，使其與實驗開始時的信號強度和對 照信號強度發(fā)生關系。例如，不用化合物溫育對照系統(tǒng)（陰性對照），或用不具有基因毒性 活性（陰性對照）的標準化合物溫育對照系統(tǒng)。對照系統(tǒng)還可用具有（前_)基因毒性活 性（陽性對照）的標準化合物來溫育。通過表達的變化來顯示活性。優(yōu)選地，將在暴露于 誘變劑的細胞中表達的蛋白與在未暴露于誘變劑的細胞中表達的蛋白相比較。在每一個處 理之間進行配對比較。配對比較包括將在給定的處理條件下的給定蛋白的表達數(shù)據(jù)與在第 二處理條件下的該蛋白的表達數(shù)據(jù)相比較。使用適當?shù)慕y(tǒng)計技術，借助于已知的商購可得 的程序進行比較。
[0030] 本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面是，如果相較于陰性、陽性或陰性對照系統(tǒng)，蛋白的表達 在系統(tǒng)中被上調(diào)，或如果蛋白的表達在系統(tǒng)和陽性對照系統(tǒng)中大體上相同，則檢測到固有 的（前_)基因毒性活性。詳細地，（i)測試系統(tǒng)相較于未用任何化合物溫育的陰性對照系 統(tǒng)的更高的蛋白表達表明所述活性，或（ii)在測試系統(tǒng)中相較于用具有基因毒性和/或 前-基因毒性活性的標準化合物溫育的陽性對照系統(tǒng)的大體上相同或更高的蛋白表達表 明所述活性，或（iii)用具有不同于測試系統(tǒng)中的濃度的濃度的化合物溫育的相對對照系 統(tǒng)的更高蛋白表達（前提是更低的濃度被賦予相對對照系統(tǒng)）表明所述活性。應理解，無 需通過上述兩個或全部比較測定表達，但因在或（iii)下的表達水平的任何比較 產(chǎn)生的（前_)基因毒性活性的指示必然意指任何其它比較測定（無論進行與否）中的所 述活性。
[0031] 更優(yōu)選地，用化合物溫育的系統(tǒng)相較于未用化合物溫育的系統(tǒng)的所述蛋白的至少 一種的表達水平的升高表明所述活性。本發(fā)明的最優(yōu)選實施方案是，所述蛋白的至少3、4、 5、6、7、8或9種的表達水平升高。高度優(yōu)選地，現(xiàn)有活性通過與陰性對照系統(tǒng)相比較的差異 蛋白表達分析來檢測。
[0032] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，表達水平升高至少1.5倍，更優(yōu)選至少1.6倍，最優(yōu) 選至少1. 8倍，高度優(yōu)選至少1. 9倍和特別高度優(yōu)選至少2. 1倍。
[0033] 本發(fā)明的另一個最特別方面是施用降低的濃度的化合物以提供具有相較于對照 系統(tǒng)的表達水平1至I. 1倍的表達水平。降低的化合物濃度是指至少10%，優(yōu)選至少20%， 更優(yōu)選至少30 %，最優(yōu)選至少40 %，高度優(yōu)選至少50 %，特別高度優(yōu)選至少60 %的降低。 [0034] 在本發(fā)明的另一個更優(yōu)選實施方案中，利用化合物溫育的系統(tǒng)相較于利用具有基 因毒性和/或前-基因毒性活性的標準化合物溫育的系統(tǒng)的所述蛋白的至少一種的大體上 相同的表達水平表明所述活性。
[0035] 用于鑒定蛋白表達的適當測試、氨基酸序列的測定和變異分析對于本領域普通技 術人員來說是已知的，或可按照常規(guī)容易設計的。根據(jù)本發(fā)明的測定可以是適合于檢測和 /或定量蛋白表達的任何測定。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是通過免疫熒光染色來測定表達水 平。
[0036] 所選擇的標志物可特別地用于建立具有更高通量的篩選工具，優(yōu)選高含量成像 (High Content Imaging) (HCI)或 Luminex xMAP 技術。稱為微球體的 Luminex 顏色-編 碼小珠粒編碼500個不同的組。每一個珠粒組可用對于特定生物測定是特異性的試劑涂 覆，從而允許捕獲和檢測來自樣品的特定分析物。Luminex技術特別地將固定在微粒珠粒 上的夾心ELISA與流式細胞術組合。其允許在一個單一樣品中同時定量測量數(shù)種蛋白。在 Luminex分析儀內(nèi)部，光源激發(fā)鑒定每一個微球顆粒的內(nèi)部染料，以及在測定過程中被捕獲 的任何報道分子染料。將雙波長激光器用于檢測珠粒的身份（基于特異于每一種分析物 的珠粒的光譜性質(zhì)）和相關藻紅蛋白（PE)突光的量（Hoffmann等人，2010, Toxicology 277, 49-58)。組合熒光顯微鏡與成像分析算法和信息學工具的自動化成像平臺使得能夠通 過細胞組分、細胞大分子結構的定位和細胞功能的時間動態(tài)的高分辨檢查來分析數(shù)百萬個 細胞的熒光圖像。HCI技術用于毒理學評價的應用顯示體外預測可通過鑒定人肝臟毒物來 加強常規(guī)臨床前測試的性能（Xu等人，2008, Toxicol Sci 105,97-105)。此外，HCI技術可 通過檢測微核（MN)用于基因毒性評價。體外MN測試通過計數(shù)細胞的細胞質(zhì)中的稱為微核 的染色體片段來檢測化合物誘導的致畸變（染色體損傷）和非整倍體誘發(fā)（染色體丟失） 效應?；贖CI的測定能夠檢測具有高性能評分的潛在基因毒性，同時還允許區(qū)分非整倍 體誘發(fā)化合物與致畸變化合物（Westerink等人，2011，Mutat. Res. 724, 7-21)。
[0037] 此外，所述技術允許組合數(shù)個選擇的終點，從而保留生物學復雜性和分子相互作 用至某一程度。HCI提供了將經(jīng)典基因毒性終點（例如MN誘導）和細胞標志物的分析與細 胞活力/細胞毒性的同時獲取組合的可能性。細胞活力是考慮基因毒性測試的重要參數(shù)， 因為標準測定中的假陽性可除其它以外通過細胞毒性產(chǎn)生。這同樣適用于測量分子標志物 例如P53。雖然p53對DNA損傷反應極其敏感，但營養(yǎng)不足和缺氧也可誘導活化。將細胞毒 性（為了進行劑量選擇）與多個終點測量一起考慮可防止或減少假陽性。
[0038] 因此，本發(fā)明涉及用于預測具有基因毒性活性的化合物的細胞作用的方法，該方 法通過從待評價的細胞制備蛋白樣品，將所述蛋白樣品與抗體接觸，檢測蛋白對抗體的結 合，和將檢測結果與使用從對照細胞制備的蛋白樣品檢測的結果相比較來進行所述預測。
[0039] 可通過將完整細胞用于選擇的檢測法來進行檢測。然而，優(yōu)選地首先提供細胞提 取物?？稍谶m當?shù)墓牧呀饩彌_液中進行細胞裂解，所述緩沖液可引起滲透沖擊并使細 胞膜穿孔。還可通過機械力例如球磨機、弗壓碎器、超聲波處理器等，分別通過細胞壁和細 胞膜的酶促降解，和/或通過表面活性劑的作用來破壞細胞結構的穩(wěn)定性?？蛇M一步純化 生物標志物以除去干擾物質(zhì)或可在樣品中濃縮生物標志物。優(yōu)選通過沉淀、透析、凝膠過 濾、凝膠洗脫或?qū)游隼鏗PLC或離子交換層析的方法進行下游處理和/或濃縮。建議組合 幾種方法以獲得更好的產(chǎn)率。
[0040] 用于檢測基因毒性的適當測試對于本領域技術人員來說是已知的，或可按照常 規(guī)容易地設計。許多不同類型的測定是已知的，其實例示于下文中。雖然根據(jù)本發(fā)明的 測定可以是適合于檢測和/或定量基因表達的任何測定，但基因毒性優(yōu)選通過與蛋白 p-p53(Serl5)、p21、p-H2A. X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl(Ser345)、p-ATR(Ser428)、 p-cdc2 (Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a和p_Chk2 (Thr68)特異性相互作用的物質(zhì)來測定。
[0041] 如本文中所用，術語"特定物質(zhì)"包括能夠以這樣的方式與本發(fā)明的蛋白相互作用 以便使識別、結合和相互作用成為可能的生物學和/或化學結構。具體地，所述物質(zhì)選自 核酸、肽、碳水化合物、聚合物、具有50至I. OOODa的分子量的小分子和蛋白，優(yōu)選核酸和蛋 白。特定物質(zhì)表達足夠的靈敏度和特異度以確?？煽拷Y合和檢測。存在于樣品中的其它 生物分子未顯著結合特異于本發(fā)明的蛋白標志物的物質(zhì)。優(yōu)選地，結合至除標志蛋白外的 生物分子的水平導致僅為標志蛋白的親和力的10%，更優(yōu)選僅5%或更少的結合親和力。 特定物質(zhì)對于對應的標志蛋白具有至少KT7M的親和力。特定物質(zhì)優(yōu)選對于標志蛋白具有 KT8M或更優(yōu)選KT 9M的親和力。最優(yōu)選特定物質(zhì)滿足上述親和力以及特異性的最低標準。 [0042] 物質(zhì)優(yōu)選特異于蛋白的部分。這樣的部分代表對對于特定功能的表達是足夠的那 些區(qū)域的限制，即用于識別的結構決定簇的提供。所有截斷不可避免地受限于保留功能例 如獨特識別的需要。然而，蛋白片段可以非常小。優(yōu)選地，物質(zhì)是單特異性的以保證與選擇 的單一靶的專有定向相互作用。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的蛋白的識別可通過在氨基酸序列的一級、二級和/或三級結構水平 上與物質(zhì)特異性相互作用來實現(xiàn)。在本發(fā)明的說明書中，術語"識別"（不限于其）涉及特 定物質(zhì)與靶之間的任何類型的相互作用，特別地共價或非共價結合或締合，例如共價鍵、疏 水/親水相互作用、范德瓦爾斯力、離子對、氫鍵、配體-受體相互作用、表位與抗體結合部 位之間的相互作用、核苷酸堿基配對等。這樣的締合還可包括其它分子例如肽、蛋白或其它 核苷酸序列的存在。
[0044] 特定物質(zhì)優(yōu)選選自抗體、細胞因子、脂質(zhì)運載蛋白、受體、外源凝集素、抗生物素蛋 白、脂蛋白、糖蛋白、寡肽、肽配體和肽激素。更優(yōu)選，抗體用作特定物質(zhì)。"抗體"是指基本 上由免疫球蛋白基因編碼的多肽或其片段。根據(jù)本發(fā)明，抗體作以完整免疫球蛋白或許多 良好表征的片段的形式存在。片段優(yōu)選選自F ab片段、F。片段、單鏈抗體（scFv)、可變區(qū)、恒 定區(qū)、H鏈（Vh)和L鏈（VJ，更優(yōu)選F ab片段和scFv。片段，例如Fab片段和F。片段可通過 使用不同的肽酶切割來產(chǎn)生。此外，可將片段工程化和重組表達，優(yōu)選地scFv。
[0045] 已發(fā)現(xiàn)DNA適體和RNA適體表達針對許多靶分子的高親力。靶結構可包括蛋白、 肽和小分子，例如有機染料、核苷酸、氨基酸、維生素、生物堿等。更優(yōu)選的是RNA適體，因 為可在RNA中獲得的2'-羥基促進幾個分子內(nèi)和分子間接觸，后者存在于具有相同序列、 不同序列的分子之間，或RNA與不由RNA組成的任何其它分子之間。這些核酸配體可通過 高效體外選擇法-所謂的SELEX法（通過指數(shù)式富集法對配體進行的系統(tǒng)性評價）來鑒 定。由于RNA對生物溶液中的溶核降解敏感的，因此應當使用例如硫代磷酸酯、鎖核酸或 Spiegelmer來化學修飾RNA適體。稱為Spiegelmer的適體的L-RNA形式特別長壽，因為它 們基本上不受天然降解過程影響。由于它們對于廣譜結構靶的高親和力，因此適體作用與 抗體非常相似?？墒褂脴藴蕘喠柞０坊瘜W來合成適體。此外，可有利地通過體外轉(zhuǎn)錄大量 合成具有超過約30個核苷酸的RNA適體。適體的選擇、合成和純化對于本領域普通技術人 員來說是公知的。
[0046] 可標記特定物質(zhì)，在該情況下標記依賴于它們固有特性和使用的檢測法，即需要 的靈敏度、綴合的容易性、穩(wěn)定性要求和可獲得的裝置和處理規(guī)定。為了檢測特定溫育產(chǎn) 物，使用的方法取決于待監(jiān)控的特定溫育產(chǎn)物，并且對于本領域普通技術人員來說是公知 的。根據(jù)本發(fā)明的適當檢測法的優(yōu)選實例是發(fā)光，特別地熒光，此外VIS著色和/或放射性 發(fā)射。
[0047] 發(fā)光涉及作為化學發(fā)光、生物發(fā)光或光致發(fā)光的結果的光的發(fā)射?；瘜W發(fā)光牽涉 作為化學反應的結果的可見光的發(fā)射，然而生物發(fā)光需要螢光素酶的活性。也稱為熒光刺 激的目前優(yōu)選的光致發(fā)光通過光子（優(yōu)選通過輻射提供的）的吸收引起，所述光子作為具 有30至50nm的波長偏移的光子在約KT 8秒的時間內(nèi)再次被釋放。用于熒光檢測的裝置包 括但不限于典型臺式熒光計、熒光多孔板讀數(shù)器、光導纖維熒光計、熒光顯微鏡和偶聯(lián)熒光 檢測的微芯片/微流體系統(tǒng)。
[0048] VIS著色是指任何消色差物質(zhì)（achromatic substance)的可視化，以使能被裸眼 看見。優(yōu)選地，著色的強度利用光度計進行測量。
[0049] 同位素的放射性輻射通過閃爍來測量。液體閃爍法包括通過捕獲稱為閃爍混合液 的有機溶液與溶質(zhì)的系統(tǒng)中的β發(fā)射來檢測樣品內(nèi)的β衰變。由樣品中的放射性同位素 例如％、 14(：、呷、，和355發(fā)射的0衰變電子激發(fā)溶劑分子，所述溶劑分子依次將能量轉(zhuǎn)移 至溶質(zhì)。溶質(zhì)的能量發(fā)射（可見光子）通過閃爍計數(shù)器內(nèi)的光電倍增管被轉(zhuǎn)化成電信號。 混合液必須還可用作增溶劑，從而保持樣品的均勻懸浮。Y射線光子通常作為其它衰變過 程（鏈式衰變）的結果產(chǎn)生來清除新形成的過量能力的核。它們沒有質(zhì)量，如果沿著其路 徑發(fā)生任何直接碰撞電離則產(chǎn)生極小質(zhì)量。通過如下3個機制的一個或多個機制吸收Y 光子以進行檢測和定量：康普頓效應、光電效應和偶生成（pair production)。本發(fā)明的有 利的Y衰變同位素為1251。
[0050] 標記法不受特別限制，只要標記物可被容易地檢測?！擞浀奶囟ㄎ镔|(zhì)〃是這樣的 物質(zhì)，其通過接頭或化學鍵共價地，或通過離子鍵、范德瓦爾斯、靜電、疏水相互作用或氫鍵 非共價地結合于標記物，以便標志蛋白的存在可通過檢測結合于它們的標記物的存在來檢 測。
[0051] 抗體對酶的共價連接可通過不同方法例如利用戊二醛的偶聯(lián)來進行。酶和抗體都 通過游離氨基與戊二醛交聯(lián)，除去網(wǎng)絡化酶和抗體的副產(chǎn)品。在另一種方法中，如果酶是糖 蛋白例如過氧化物酶，則將酶通過糖殘基偶聯(lián)于抗體。通過高碘酸鈉氧化酶，將其與抗體的 氨基直接交聯(lián)。還可將其它包含糖類的酶以這樣的方式偶聯(lián)于抗體，然而有時因氧化作用 而觀察到活性的喪失，例如降低的堿性磷酸酶的活性。酶偶聯(lián)還可通過使用異雙功能交聯(lián) 劑例如琥珀酰亞胺6-(N-馬來酰亞胺）己酸鹽將抗體的氨基與酶例如β-半乳糖苷酶的游 離巰基交聯(lián)來進行。
[0052] 可直接或間接檢測抗體對蛋白的特異性免疫組合。直接標記物包括連接于抗體的 熒光或發(fā)光標記物、金屬、染料、放射性核素等。可使用利用碘-125 (125I)標記的抗體。使用 特異于蛋白標志物的化學發(fā)光抗體的化學發(fā)光測定適合用于蛋白水平的靈敏非放射性檢 測。利用熒光染料標記的抗體也是適當?shù)?。熒光染料的實例包括但不限于DAPI、熒光素、異 硫氰酸熒光素（FITC)、0regon綠、Hoechst 33258, R-藻青蛋白，綠色熒光蛋白（GFP)，B-藻 紅蛋白，R-藻紅蛋白，羅丹明，Texas紅、四甲若丹明異硫氰酸鹽（TRITC)，Cy3，Cy5和麗 絲胺。間接標記物包括本領域已知的各種酶，例如辣根過氧化物酶（HRP)，堿性磷酸酶 (ΑΡ)，β-半乳糖苷酶、尿素酶等?？墒褂美备^氧化物酶檢測系統(tǒng)，例如利用顯色底物四 甲基聯(lián)苯胺（TMB)，其在過氧化氫存在的情況下產(chǎn)生在450nm可檢測的可溶性產(chǎn)物?？梢?例如將堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)與顯色底物對-硝基苯基磷酸一起使用，這產(chǎn)生在405nm可容 易地被檢測的可溶性產(chǎn)物。類似地，可將β-半乳糖苷酶檢測系統(tǒng)與顯色底物鄰-硝基苯 基-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG) -起使用，這產(chǎn)生在410nm可檢測的可溶性產(chǎn)物?？蓪⒛?素酶檢測系統(tǒng)與底物例如尿素-溴甲酚紫一起使用。自動淬滅熒光化合物（Auto-quenched fluorescent compound)可通過腫瘤相關蛋白酶、酶例如突光素酶、納米顆粒、生物素、地高 辛配基等來激活。
[0053] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，用地高辛配基、生物素、化學發(fā)光物質(zhì)、熒光 染料、磁珠、金屬珠粒、膠體顆粒、電子致密試劑、酶（其全部在本領域中是公知的）或放射 性同位素標記適體。用于標記本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸的優(yōu)選同位素為 3h、14c、32p、33p、35s* 125ι，更優(yōu)選 32p、33p 或 125ι。
[0054] 可使用多種免疫測定技術，包括競爭性和非競爭性免疫測定。術語"免疫測定"包 括技術，包括但不限于酶免疫測定（EIA)，例如酶倍增免疫測定技術（enzyme multiplied immunoassay technique) (EMIT)、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA)、IgM 抗體捕獲 ELISA (MAC ELISA)和微粒酶免疫測定（MEIA)、此外毛細管電泳免疫測定（CEIA)、放射免疫測定（RIA); 放射免疫分析（IRMA)、熒光偏振免疫測定（FPIA)和化學發(fā)光測定（CL)。必要時，可使這樣 的免疫測定自動化。還可將免疫測定與激光誘導熒光例如Luminex技術結合使用。脂質(zhì)體 免疫測定，例如流動注射脂質(zhì)體免疫測定和脂質(zhì)體免疫傳感器也適合用于本發(fā)明。此外，其 中蛋白/抗體復合物的形成導致增加的光散射的比濁法適合用于本發(fā)明的方法，所述光散 射被轉(zhuǎn)化成作為標志物濃度的函數(shù)的峰值比信號（peak rate signal)。
[0055] 在本發(fā)明的實施方案中，抗體用作特定物質(zhì)，并且通過抗體的標記，優(yōu)選通過 ELISA，RIA，熒光免疫測定（FIA)，可溶性顆粒免疫測定（SPIA)或western印跡檢測溫育產(chǎn) 物。
[0056] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將ELISA用于溫育產(chǎn)物的檢測。ELISA的組分為結合 于免疫反應的一個配偶體的酶。優(yōu)選在競爭性ELISA中，使用單個捕獲抗體（在下文中稱 為一抗）標記標志蛋白的標記抗原（分析物衍生物），然而優(yōu)選在非競爭性ELISA中標記抗 體，優(yōu)選地包括利用第二抗體（在下文中稱為二抗）而非一抗沉淀抗原一抗體復合物，所述 第二抗體針對所述標志蛋白的另一個表位。由抗原和兩個抗體組成的復合物也稱為夾心復 合物。檢測包括隨后底物至產(chǎn)物，優(yōu)選地有色產(chǎn)物的酶促轉(zhuǎn)化，所述產(chǎn)物通過可視著色、生 物發(fā)光、熒光或電信號的測量（酶電極）來識別。用于本發(fā)明的標記的有利的酶對于本領 域普通技術人員來說是已知的，例如過氧化物酶（例如HRP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)、綠 色熒光蛋白（GFP)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST)、熒光素酶、β-半乳糖苷酶和AP。
[0057] 另外優(yōu)選的是利用放射性同位素的放射免疫測定，所述同位素在合成過程中被摻 入免疫試劑，或隨后偶聯(lián)于測定的免疫試劑，優(yōu)選偶聯(lián)于抗體。本發(fā)明方法中的優(yōu)選放射性 同位素為 3H、14C、32P、33P、35S和 1251，更優(yōu)選為14C、35S和125L喜愛的方法遵從競爭性結合原 理。恒定量的放射性蛋白標志物可變量的待分析的樣品的所述標志物競爭確定量的過量存 在的抗體。標記物的置換與可通過校準曲線估計的標志物濃度成正比。
[0058] 將有利地用熒光基團標記的抗原或抗體分別用于FIA。
[0059] SPIA利用作為凝集的結果的銀顆粒的顏色變化。既不需要第二抗體也不需要指示 劑反應來使其特別適用于本發(fā)明的范圍。類似地有利地是使用結合于有色膠乳顆粒的抗體 的膠乳凝集測試。
[0060] 用于本發(fā)明的特定溫育產(chǎn)物的另一個喜愛的檢測法是western印跡。首先，將凝 膠混合和澆鑄，將先前制備的樣品加載至凝膠上，通過電泳分級分離。將存在于聚丙烯酰胺 凝膠中的蛋白點印至硝酸纖維素膜，可將抗體施用于硝酸纖維素膜以檢測特定目標蛋白。 簡單地進行Western印跡，有利地此時濃度的精確測定不是必需的。
[0061] 不同數(shù)目的抗本發(fā)明的蛋白標志物的特異性抗體是可獲得的。當免疫反應通過對 于生物體是陌生的并且具有超過3. OOOg/mol的分子量的抗原引起時，抗體通常在哺乳動 物生物體中產(chǎn)生。用于抗體產(chǎn)生的有利的宿主物種包括山羊、兔和小鼠。其它多克隆和單 克隆抗體可源自不同物種及其片段。流行的技術例如雜交瘤技術對于本領域普通技術人員 來說是公知的?？贵w在本發(fā)明方法中被用作特定物質(zhì)。
[0062] 可將抗體固定在多種固體載體（例如磁珠或?qū)游龌|(zhì)顆粒、測定板（例如微量滴 定孔）的表面、成片固體基質(zhì)材料或膜（例如塑料、尼龍、紙）等）上。測試條可通過將抗 體或多種抗體涂覆在固體載體上的陣列中來制備。隨后可將該測試條浸入測試樣品，通過 洗滌和檢測步驟快速處理以產(chǎn)生可測量的信號例如有色斑點。
[0063] 可在多種物理形式中進行分析。例如，微量滴定板或自動化的使用可用于促進大 量測試樣品的處理。或者，單個樣品形式可被開發(fā)以適時的方式促進診斷或預后。有用的 物理形式包括用于檢測多種生物標志物的具有多個分離可尋址的位置的表面。這樣的形式 包括蛋白微陣列或蛋白芯片。在這些實施方案中，每一個分離的表面位置可包含結合一種 或多種蛋白標志物的抗體以用于每一個位置上的檢測。表面可以可選擇地包含一種或多種 固定在表面的分離位置上的分離的顆粒（例如微?；蚣{米顆粒），其中微粒包含抗體來固 定用于檢測的一種或多種蛋白標志物。在一個實施方案中，提供了基質(zhì)，其中每一個位置代 表蛋白的分開的結合位點，并且其中存在所有蛋白P_p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、 p-ATM (Ser 1981)、p-Chkl (Ser345)、p-ATR (Ser428)、p-cdc2 (Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 p-Chk2 (Thr68)的結合位點。
[0064] 可以例如使用分光光度計檢測來自顯色義物的顏色，使用檢測放射的放射線計數(shù) 器，例如用于125I的檢測的Y計算器，或在具有特定波長的光存在的情況下使用熒光計檢 測熒光來分析來自直接或間接標記物的信號。為了檢測酶聯(lián)抗體，可按照制造商的說明書， 使用分光光度計例如EMX微量滴定板讀數(shù)器（Molecular Devices ;Menlo Park, CA)進行 定量分析。必要時，可使本發(fā)明的測定自動化或通過機器人來進行，可同檢測來自多個樣品 的信號。詳細地，可通過例如利用熒光激光顯微鏡和CCD照相機記錄的熒光來檢測蛋白，利 用計算機分析熒光強度。在本文中的任何實施方案中，任選地例如通過數(shù)字化圖像以及在 計算機上存儲和分析圖像來進一步處理通過照相機或其它記錄設備（例如光電二極管和 數(shù)據(jù)存儲裝置）觀察和任選地記錄的光學圖像。多種商購可得的外周設備和軟件可獲得用 于數(shù)字化、存儲和分析數(shù)字化影像或數(shù)字化光學圖像。一個常規(guī)系統(tǒng)將來自樣本視野的光 傳遞至通常用于本領域的冷卻的電荷耦合器件（CCD)照相機。CCD照相機包括一系列圖片 元素（像素）。來自樣本的光在CCD上成像。將對應于樣本的區(qū)域的特定像素取樣以獲得 每一個位置的光強讀數(shù)。平行地處理多個像素以增加速度。本發(fā)明的裝置和方法容易地用 于通過熒光或暗視野顯微鏡技術觀察任何樣品。
[0065] 在篩選法的另一個實施方案中，可另外地改進誘變和/或前-誘變活性的檢 測。為此目的，通過檢測選自 P_p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、 p-Chkl (Ser345)、p-ATR (Ser428)、p-cdc2 (Thrl4/Tyr 15)、Gadd45a 和 p-Chk2 (Thr68)的數(shù) 種蛋白，將一定量的信號或信號的變化與系統(tǒng)中蛋白表達發(fā)生關系來測定蛋白表達。換句 話說，蛋白的活性形式的表達水平與發(fā)射的物理信號的量或發(fā)射的物理信號的變化相關。 用不同濃度的鑒定的具有（前_)基因毒性的化合物溫育本發(fā)明的細胞系統(tǒng)。在誘變化合 物存在的情況下觀察到的發(fā)射的信號的量或信號的變化表示通過化合物經(jīng)歷的蛋白表達 的變化。變化從而可與樣品中誘變劑的濃度相關，即，校準曲線使得能夠進行匹配濃度的計 器讀數(shù)。優(yōu)選地，如果使用UV/VIS著色或發(fā)光，校準曲線基于Lambert-Beer公式。化合物 的基因毒性通過將樣品中蛋白的濃度與利用誘變劑和/或未用誘變劑處理的細胞的已知 蛋白濃度水平相比較來診斷。應理解已知的濃度在統(tǒng)計上已被證明，從而分別代表一定水 平或范圍。還已通過本發(fā)明的標志蛋白的差異表達分析計算了蛋白表達的方法和強度，以 便識別對于某一因子的顯著上調(diào)。與非受激細胞的蛋白濃度水平相異的任何測量的濃度表 示測試的細胞樣品的異常性，然而在可與非受激細胞的濃度水平相比較的蛋白濃度上不能 將化合物分類為誘變劑。優(yōu)選地測量高于非受激細胞的蛋白濃度水平的濃度以檢測基因毒 性。通過使用該方法，本發(fā)明人證明了對亞微摩爾或甚至納米摩爾濃度的敏感性。校準曲 線顯示可在橫跨數(shù)個數(shù)量組的動態(tài)范圍內(nèi)使用所述方法。
[0066] 因此，本發(fā)明的方法包括通過將測試系統(tǒng)中的蛋白表達水平與對照系統(tǒng)中的蛋白 表達水平相比較來篩選基因毒性和/或前-基因毒性活性的水平。
[0067] 雖然本發(fā)明的生物標志物組顯示允許在篩選法的范圍內(nèi)僅使用兩個標志蛋白的 靈敏性，但優(yōu)選將超過這些標志蛋白的標志蛋白用于檢測基因毒性。本發(fā)明人已舉例說明 分析多個誘變劑響應蛋白通過覆蓋比低-多個-蛋白報道分子測定更廣譜的基因毒性反應 來增加篩選穩(wěn)定性和減少錯誤率。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，測定所述蛋白的至少3、4、 5、6、7、8或9種，更優(yōu)選至少5種蛋白，最優(yōu)選9種蛋白的表達水平。
[0068] 最優(yōu)選地，測定至少蛋白p_p53(Serl5)和p21的表達水平。高度優(yōu)選地，測定 至少蛋白 P_p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、p-ATM(Serl981)和 p-Chkl(Ser345)的 表達水平。除了所述5種蛋白的表達以外，還可測定選自p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/ Tyr 15)和 p-Chk2 (Thr68)，特別地選自 p-ATR (Ser428)、p-cdc2 (Thr 14/Tyr 15)、Gadd45a 和 p-Chk2(Thr68)的一種或多種蛋白的表達水平。
[0069] 在本發(fā)明的另一個最優(yōu)選實施方案中，測定至少蛋白p_p53(Serl5)、p21、p-H2A. X (Ser 139)、p-Chkl (Ser345)、p-ATR (Ser428)、p-Chk2 (Thr68)和任選地 MDM2 的表達水 平。本發(fā)明的另一個最優(yōu)選實施方案是測定至少蛋白P_p53(Serl5)、p-H2A.X(Serl39)、 p-Chkl (Ser345)和p-Chk2 (Thr68)的表達水平以及p21和任選地ATR及MDM2的總蛋白水 平。
[0070] 高度優(yōu)選地測定蛋白 p-p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、 p-Chkl (Ser345)、p-ATR (Ser428)、p-cdc2 (Thr 14/Tyr 15)、Gadd45a 和 p-Chk2 (Thr68)的表 達水平。
[0071] 不用說，將任何優(yōu)選實施方案中的所述各自優(yōu)選的標志蛋白的表達與對照系統(tǒng)中 的蛋白表達相比較。
[0072] 如果系統(tǒng)或其樣品能夠表達多種蛋白并且將多種蛋白的表達模式與對照系統(tǒng)中 的表達模式相比較，則可化合物特異性地表征基因毒性。具體地，通過多種蛋白的關系和/ 或改變的調(diào)控的量級測定表達模式。本發(fā)明的篩選法不僅評價了對待評價的細胞具有基因 毒性活性的化學物質(zhì)的效應，而且還顯示了該效應的細節(jié)。通過單個地評價分類的蛋白的 表達水平，可能區(qū)分具有基因毒性活性的化合物是如何影響待評價的細胞的。
[0073] 本發(fā)明還教導篩選法的實施方案，其中相較于顯示非基因毒性效應的哺乳動物， 測定取自施用了一種或多種待篩選的化合物的哺乳動物，優(yōu)選實驗室哺乳動物的生物樣 品，其中表達水平的升高表示增加的化合物對于基因毒性易感病態(tài)具有治療作用的可能 性。對于治療作用，包括了定量水平。"治療作用"在一定程度上緩解了疾病的一個或多個 癥狀，或使一個或多個與疾病或病態(tài)或其病因相關的生理或生物化學參數(shù)部分或完全地恢 復正常。此外，表達"治療有效量"表示與未接受該量的對應受試者相比較具有下列結果的 量：疾病、綜合征、狀況、抱怨、障礙或副作用的改善的治療、治愈、預防或消除，或還有疾病、 抱怨或障礙的進展的減慢。表達"治療有效量"還包括對于增強正常生理功能是有效的量。 數(shù)種化合物的測試使得選擇最適合于哺乳動物受試者的治療的該化合物成為可能。根據(jù)特 定細胞的體外數(shù)據(jù)，有利地針對所述細胞預調(diào)整選擇的化合物的體內(nèi)劑量率。因此，治療作 用得到顯著增強。
[0074] 在本發(fā)明的另一個方面，在例如一系列化合物內(nèi)鑒定了具有最?。ㄇ癬)基因毒性 的化合物或非（前_)基因毒性化合物，其中表達水平的最低升高或未升高表示適合于其期 望的用途的所述化合物。用途可以是治療性的或非治療性的，并且不受限于任何特定目的， 但與本領域中已知的期望用途相容（例如手冊、紙等）。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，提供了用于 給患者施用治療性化合物的方法，包括利用一系列化合物進行本發(fā)明的篩選方法，鑒定不 具有基因毒性和前-基因毒性活性的化合物，和給需要所述化合物的期望用途的患者施用 所述化合物。應理解，方法的目的不在于任何用途和/或?qū)τ谒鲇猛咀罹呋钚缘幕衔?的鑒定，而在于在期望的用途過程中不利（前_)基因毒性效應的消除。
[0075] 本發(fā)明還涉及用于監(jiān)控發(fā)生因增殖、分化和/或損傷修復的失調(diào)（因響應利用 化合物的治療而導致的）而引起的、介導的和/或傳播的癌癥、腫瘤、轉(zhuǎn)移和/或血管生 成的障礙的可能性的方法，其中測定取自哺乳動物的生物樣品中選自p-p53(Serl5)、p21、 ρ-Η2Α· X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl (Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/ Tyrl5)、Gadd45a和p_Chk2 (Thr68)的至少兩種蛋白的表達水平，其中至少一種所述蛋白的 表達水平的升高表明所述化合物具有基因毒性和/或前-基因毒性活性，并且所述可能性 增加，所述哺乳動物需要利用給所述哺乳動物施用所述化合物的這樣的治療。優(yōu)選通過上 文中所示的本發(fā)明的篩選方法獲得化合物。因此，本說明書關于篩選法的先前教導是有效 的且可應用的而非限于監(jiān)控法（如果是有利的）。
[0076] 上述多個基因的鑒定提供了用于評估狀態(tài)、狀況或治療的進展的強有力工具。具 體地，可在事件例如手術、治療方案起始或治療方案完成之如在患者中鑒定多個基因，以提 供基線結果。隨后可在這樣的事件過程中或之后將該基線與使用相同方法獲得的結果相比 較。該信息可用于診斷和預后目的。
[0077] 本發(fā)明的監(jiān)控方法可用于人和獸醫(yī)學。哺乳動物優(yōu)選為實驗室哺乳動物和/或非 人生物體。在本文中，可在疾病發(fā)作前或發(fā)作后施用化合物一次或數(shù)次，用作療法。術語 "有效量"或"有效劑量"或"劑量"可在本文中互換使用，并且表示對疾病或病態(tài)具有預防 性或治療性相關傷腦筋的藥物化合物的量，即該量在組織、系統(tǒng)、動物或人中引起為例如研 究者或醫(yī)生所尋找或期望的生物或醫(yī)學反應。
[0078] 本發(fā)明的上述醫(yī)學產(chǎn)品特別地用于治療性治療。監(jiān)控被當作一種類型的治療，其 中優(yōu)選以不同的間隔施用化合物，例如以增強反應和完全消除病原體和/或基因毒性介導 的疾病的癥狀。可應用相同的化合物或不同的化合物。還可將藥劑用于減少發(fā)生疾病的可 能性或甚至預先預防由于基因毒性影響造成的與增殖、分化和/或損傷修復相關的那些疾 病的起始，或用于治療出現(xiàn)和連續(xù)的癥狀。在本發(fā)明的含義中，如果受試者具有上述生理或 病理狀況例如家族素因、遺傳缺陷或先前通過的疾病，則預防性治療是合理的。本發(fā)明考慮 的疾病優(yōu)選為癌癥、腫瘤、轉(zhuǎn)移和/或血管生成的障礙。
[0079] 根據(jù)本發(fā)明的所述化合物可以以它們的最終非鹽形式使用。在另一方面，本發(fā)明 還包括以它們藥學上可接受的鹽形式存在的這些化合物的用途，所述鹽形式可通過本領域 已知的方法從不同的有機及無機酸和堿產(chǎn)生。在本文中可互換使用的表達"藥學上可接受 的鹽"和"生理上可接受的鹽"在本關系中被用來表示活性成分，該成分包含以其鹽之一的 形式存在的根據(jù)本發(fā)明的化合物，特別地如果該鹽形式相較于活性成分的游離形式或更早 使用的活性成分的任何其它鹽形式賦予活性成分改善的藥代動力學的話。活性成分的藥物 可接受鹽形式還可首次提供具有其先前不具有的期望的藥代動力學性質(zhì)的該活性成分，并 且相對于其在體內(nèi)的治療功效甚至可對該活性成分的藥代動力學具有積極影響。
[0080] 此外，本發(fā)明涉及用于預測患者響應利用藥物的治療性治療而遭受腫瘤的可能 性的體外方法，包括步驟：（i)測量來自所述患者的組織或血漿的活檢樣品的至少兩種蛋 白的表達水平，所述蛋白選自 p-p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、 p-Chkl(Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 p-Chk2(Thr68)， （ii) 將來自所述患者的組織或血漿的組織樣品離體地暴露于所述藥物，和（iii)測量步驟（ii) 的所述暴露的樣品中的步驟（i)中指定的所述蛋白的表達水平，以及計算步驟（i)和（iii) 中測量的表達水平的差異，其中該步驟（iii)相較于步驟（i)中獲得的所述蛋白的至少一 種的表達水平的升高表示所述藥物具有基因毒性和/或前基因毒性活性并且所述可能性 增加。
[0081] 本發(fā)明的目的還有使用選自 p_p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、 p-ATM(Serl981)、p-Chkl (Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2 (Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 p-Chk2(Thr68)的至少兩種蛋白作為標志蛋白來篩選具有基因毒性和/或前基因毒性活性 的化合物。本說明書關于篩選法的先前的教導是有效的且可應用的而非限于所述用途（如 果是有利的）。
[0082] 本發(fā)明的另一個目的是使用與至少一種標志蛋白特異性相互作用的物質(zhì)來檢 測基因毒性或前基因毒性活性。本發(fā)明的優(yōu)選方面是使用至少兩種抗體（每一種抗體 具有對選自 P_p53(Serl5)、p21、P-H2A. X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl (Ser345)、 p_ATR(Ser428)、p_cdc2 (Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 p_Chk2 (Thr68)的不同蛋白的特異性結 合）來檢測基因毒性和/或前基因毒性活性?？贵w優(yōu)選直接用同位素例如生色團、發(fā)光體 或色原標記，或間接用生物素標記，鏈霉抗生物素蛋白復合物可隨后結合所述生物素。通過 測定抗體的存在或不存在，可檢測目標標志蛋白的存在或不存在。本說明書關于篩選法的 先前的教導被認為是有效的且可應用的而非限于所述抗-標志物抗體的所述用途（如果是 有利的）。
[0083] 本發(fā)明還可作為用于檢測基因毒性和/或前基因毒性活性的試劑盒來進行實 踐，其包含至少兩種抗體，每一種具有對選自P_p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、 p-ATM (Ser 1981)、p-Chkl (Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 p-Chk2(Thr68)的不同蛋白的特異性結合。試劑盒被特別地設計來進行本發(fā)明的方法以篩 選具有基因毒性和/或前基因毒性活性的化合物。本發(fā)明的試劑盒可包括物品，其包括書 面說明書或指導用戶如何實踐本發(fā)明的方法。本說明書關于篩選法的先前的教導被認為是 有效的且可應用的而非限于試劑盒（如果是有利的）。
[0084] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，首次提供了用于篩選具有基因毒性活性的化合物的方法，該 方法利用達到9種蛋白的獨特蛋白表達模式。本發(fā)明教導與基因毒性相關的標志蛋白的特 征表達指紋。數(shù)據(jù)支持體外機制分析（mechanistic profiling in-vitro)相較于單終點檢 測是強有力的預測基因毒性的工具。機制分析在這樣的數(shù)據(jù)解釋過程中具有益處，并且機 制研究是促進具有基因毒性的化合物的分類的強有力工具。此外，機制數(shù)據(jù)將改善具有基 因毒性的化合物的化學表征和風險評估。在藥物開發(fā)過程中將蛋白分析用于早期篩選，有 助于對不同分子進行評級和在開發(fā)早期突出顯示具有基因毒性特征的化合物，從而通過阻 止隨后的體內(nèi)測試來節(jié)省成本和動物。
[0085] 可將發(fā)現(xiàn)的9種假定的標志蛋白用于篩選未知化合物，所述化合物有效地允許在 藥物開發(fā)早期特異性地和靈敏性地鑒定和表征它們的基因毒性和前基因毒性潛力。能夠在 功能上表達達到9種標志蛋白的細胞系統(tǒng)的基因毒性應激導致相較于該細胞系統(tǒng)的對照 這些標志蛋白的增加的表達和激活。組合的上述蛋白具有協(xié)同作用，從而使得能夠檢測具 有高性能的基因毒素。不同表達的蛋白的分析特別適合用于高通量測試系統(tǒng)?；诟吆?成像（HCI)的蛋白表達分析可用可有利地用于具有未知作用模式的基因毒素和預測它們 在藥物發(fā)現(xiàn)過程早期產(chǎn)生基因毒性效應的潛能。除此以外，使用HCI的基于細胞的模型具 有以少量化合物需要快速產(chǎn)生數(shù)據(jù)的有利方面?？梢砸院唵蔚?，有成本效益的可靠方式來 進行本發(fā)明的檢測法以及生成監(jiān)控法（arising monitoring method)。以至少75%，更優(yōu) 選至少80%，最優(yōu)選至少90%的靈敏度和/或特異度篩選具有（前-)基因毒性活性的化 合物。在本文中，"靈敏度"是指相對于所有陽性測試化合物經(jīng)正確測試為陽性的化合物的 數(shù)量，"特異度"是指相對于所有陰性化合物經(jīng)測試為陰性的化合物的數(shù)量?？蓪⒃撎禺愋?標志物組與其它基因毒性終點如微核測定組合來產(chǎn)生用于廣泛的潛在地具有基因毒性的 化合物的高預測性篩選系統(tǒng)。
[0086] 將本文中引用的所有參考資料通過引用整體并入本發(fā)明的公開內(nèi)容。
[0087] 應理解本發(fā)明不限定于本文中描述具體方法、特定物質(zhì)、用途和陣列，因為這樣的 物質(zhì)可變化。還應理解，本文中使用的術語僅為了描述具體的實施方案，并且無意限定本 發(fā)明的范圍，所述范圍僅由所附權利要求界定。如本文中所用，包括所附權利要求，除非上 下文另外明確地指出，否則單詞例如〃一個/ 一種（a)〃、〃一個/ 一種（an)〃和〃所指物 (the)"的單數(shù)形式包括它們對應的復數(shù)所指物。因此，例如"一個/ 一種化合物"包括單 個/種或多個/種不同的化合物，"一個/一種方法"包括對于本領域普通技術人員來說 是已知的等同步驟和方法等等。除非另外定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具 有與本發(fā)明所屬的領域內(nèi)的普通技術人員通常理解的含義相同的含義。
[0088] 根據(jù)本發(fā)明是必需的技術詳細地描述于本說明書中。未詳細描述的其它技術對應 于本領域普通技術人員公知的已知標準方法，或描述更詳細地描述于引用的參考資料、專 利申請或標準文獻中。雖然與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本 發(fā)明的實踐或測試，但在下文中描述了適當?shù)膶嵗?。下列實施例通過舉例說明但非限制的 方式提供。在實施例中，使用無污染活性（在可行的情況下）的標準試劑和緩沖液。特別 地解釋實施例以便它們不限定于明確顯示的特征組合，但如果本發(fā)明的技術問題得以解決 則可無限制地組合舉例說明的特征。
[0089] 表1列出了 5種分析的蛋白和具有它們的翻譯后修飾的4種補充標志物、（別名） 蛋白名稱、（別名）基因名稱和登錄號，其對于每一種蛋白都是唯一。
[0090] 表2列出了用（前_)基因毒素（環(huán)磷酰胺、7, 12-二甲基苯并蒽、黃曲霉毒素&、 2-乙酰氨基芴、放射菌素D、磺酸甲酯、依托泊苷）和非基因毒素（D-甘露醇、苯乙福明HC1、 孕酮）測試的 9 種蛋白標志物（p-p53(Serl5)、p21、P-H2A. X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、 p-Chkl(Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thr14/Tyr15)、Gadd45a 和 p-Chk2(Thr68))。陽 性/陰性結果分別通過紅/綠顏色顯示。
[0091] 表3列出了由歐洲替代方法驗證中心（ECVAM)推薦的組1化學藥品（"在體外哺 乳動物細胞基因毒性測試中應當被檢測為陽性的體內(nèi)基因毒素"）以判斷體外基因毒性測 試的性能（Kirkland 等人，2008, Mutat. Res. 653, 99-108)。
[0092] 表4列出了由歐洲替代方法驗證中心（ECVAM)推薦的組2化學藥品（"非 DNA反應性化學藥品，包括非基因毒性致癌物，其在體外哺乳動物細胞基因毒性測試中 應當產(chǎn)生陰性結果"）以判斷體外基因毒性測試的性能（Kirkland等人，2008，Mutat. Res. 653, 99-108)。
[0093] 表5列了由歐洲替代方法驗證中心（ECVAM)推薦的組3化學藥品（"應當在體外 哺乳動物細胞基因毒性測試中產(chǎn)生陰性結果但未曾被報導通常以高濃度或高細胞毒性水 平在小鼠淋巴瘤細胞中誘導染色體畸變或tk突變的化學藥品。"）以判斷體外基因毒性測 試的性能（Kirkland 等人，2008, Mutat. Res. 653, 99-108)。
[0094] 表6列出了由ECVAM推薦的組1化學藥品（"在體外哺乳動物細胞基因毒性測試 中應當被檢測為陽性的體內(nèi)基因毒素"）和它們的受自發(fā)熒光（AF)限制的測試的最高濃 度、基于先前的實驗（Cyto)和沉淀（Prec)的細胞毒性，以及〈50%的兩個細胞毒性參數(shù)每 有效視野選擇的細胞計數(shù)（selected cell count per valid field) (SCC)和CMFDA細胞質(zhì) 平均強度（CMFDA)的最高濃度。
[0095] 表7列出了由ECVAM推薦的組2化學藥品（"非DNA反應性化學藥品，包括非基因 毒性致癌物，其在體外哺乳動物細胞基因毒性測試中應當產(chǎn)生陰性結果"）和它們的受自發(fā) 熒光（AF)限制的測試的最高濃度、基于先前的實驗（Cyto)和沉淀（Prec)的細胞毒性，以 及〈50%的兩個細胞毒性參數(shù)每有效視野選擇的細胞計數(shù)（SCC)和CMFDA細胞質(zhì)平均強度 (CMFDA)的最高濃度。
[0096] 表8列出了由ECVAM推薦的組3化學藥品（"應當在體外哺乳動物細胞基因毒性 測試中產(chǎn)生陰性結果但未曾被報導通常以高濃度或高細胞毒性水平在小鼠淋巴瘤細胞中 誘導染色體畸變或tk突變的化學藥品。")，和它們的受自發(fā)熒光（AF)限制的測試的最高濃 度、基于先前的實驗（Cyto)和沉淀（Prec)的細胞毒性，以及〈50%的兩個細胞毒性參數(shù)每 有效視野選擇的細胞計數(shù)（SCC)和CMFDA細胞質(zhì)平均強度（CMFDA)的最高濃度。
[0097] 表9列出了用由ECVAM推薦的組1化學藥品（"在體外哺乳動物細胞基因毒性測 試中應當被檢測為陽性的體內(nèi)基因毒素"）測試的5種蛋白標志物（p-p53(Serl5)、p21、 P-H2A. X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl (Ser345))的結果。陽性 / 陰性結果分別由紅 /綠色顯示。
[0098] 表10列出了用由ECVAM推薦的組2化學藥品（"非DNA反應性化學藥品，包括非 基因毒性致癌物，其在體外哺乳動物細胞基因毒性測試中應當產(chǎn)生陰性結果"）測試的5種 蛋白標志物（P_p53(Serl5)、p21、p-H2A. X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl (Ser345))的 結果。陽性/陰性結果分別由紅/綠色顯示。
[0099] 表11列出了用由ECVAM推薦的組3化學藥品（"應當在體外哺乳動物細胞基因毒 性測試中產(chǎn)生陰性結果但未曾被報導通常以高濃度或高細胞毒性水平在小鼠淋巴瘤細胞 中誘導染色體畸變或tk突變的化學藥品。"）測試的5種蛋白標志物（p-p53(Serl5)、p21、 P-H2A. X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl (Ser345))的結果。陽性 / 陰性結果分別由紅 /綠色顯示。
[0100] 表12列出了使用MILLIPLEX MP磁珠試劑盒和Luminex系統(tǒng)獲得的細胞裂解物 中磷酸化p53(Serl5)的變化和p21的總蛋白水平的結果。 實施例
[0101] ?化學藥品和細胞培養(yǎng)基補充劑
[0102] 測試的化合物組被歐洲替代方法驗證中心（ECVAM)推薦來判斷體外基因 毒性測試的性能：列出了 3組已測試的化合物中的兩組（表3、4和5) (Kirkland 等人，2008, Mutat. Res. 653, 99-108)。以97 %的最低純度獲得所有測試的化合 物。除來自Calbiochem(Darmstadt，德國）的環(huán)磷酰胺外，大部分化合物訂購自 Sigma_Aldrich(Taufkirchen，德國）；2_ 乙醜氛基莉和泰素來自 Acros Organics(Geel，l：匕 利時），二甲基亞硝胺和氟草隆來自Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg,德國），2-氨基-3 甲基咪唑并[4, 5-f]喹諾酮和2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4, 5-f]吡啶來自Apollo Scientific Ltd. (Bredbury, UK)，N, N-二環(huán)己基硫脈來自 LGC(Teddington, UK)，氨唑來自 TCI Europe (Zwi jndrecht，比利時）以及硫酸麻黃喊來自 LGC (Teddington, UK)。DMEM/F12、 慶大霉素和丙酮酸鈉購自Invitrogen Corp. (Karlsruhe,德國）。胎牛血清（FBS)獲自 HyClone(Order No. SV30160. 03, Lot No. RSJ30856, HyClone UK Ltd. , Cramlington, UK)〇 B-萘黃酮/苯巴比妥誘導的大鼠肝S9(0rder No.R1081.S9，Lot No.0710507)訂購自 Tebu-bio (Offenbach,德國）。胰蛋白酶、β-煙酰胺腺噪呤二核苷酸W -磷酸還原的四 鈉鹽水合物（NADPH)和青霉素/鏈霉素溶液獲自Sigma-Aldrich (Taufkirchen，德國）。氯 化鎂、氯化鉀、磷酸二氫鈉一水合物和磷酸氫二鈉七水合物購自Merck KGaA(Darmstadt,德 國）。
[0103] ?細胞培養(yǎng)
[0104] 將 H印G2 細胞（Order No. HB-8065, Lot. 58483209, ATCC, Manassas, USA)于培養(yǎng)瓶 中在37°C和5%0)2下培養(yǎng)在DMEM/F12(具有L-谷氨酰胺和補充有10% (v/v)FBS、l% (v/ v)青霉素（l〇kU/ml)/鏈霉素（10mg/ml)溶液的 15mM Hepes、0. 1% (v/v)慶大霉素（50mg/ ml)和ImM丙酮酸鈉）中。取決于實驗，在使用胰蛋白酶使細胞脫離后，將適當數(shù)目的細胞 接種至板上，在處理之前將細胞在37°C和5% CO2下處理24h。利用第4-20代的細胞進行 所有實驗3次。
[0105] 9種假定標志蛋白的測試
[0106] ?細胞處理和劑量選擇
[0107] 將細胞接種至黑色多聚D-賴氨酸涂覆的96孔板（BD Biocoat, Franklin Lakes，USA) (0. 02x IO6個細胞/孔）上，放置24h以進行附著，隨后用測試化合物處理。對 于每一種化合物，利用2倍系列稀釋度測試7個濃度。DMSO 1% (v/v)用作實驗的載體對 照。對于具有直接基因毒性和前基因毒性的化合物處理方法不同。具有直接基因毒性的 化合物的處理是持續(xù)的，并且在48h過程中每日進行重復。將具有前基因毒性的化合物與 代謝活化系統(tǒng)一起溫育6h(以限制S9-混合物的細胞毒性作用）。在該時期后，用細胞培 養(yǎng)基洗滌細胞，隨后進行18-h的恢復期。在48h過程中每日重復該處理。所使用的代謝 活化系統(tǒng)由下列組分和濃度組成：8mM MgCl2、32. 8mM KCl、12mM NADPH、124mM磷酸鹽緩沖 液和2500pmol/ml細胞色素P450(CYP)(于預混合物中的含量），對應于在用細胞培養(yǎng)基以 1:3. 33稀釋后作為終濃度的2. 4mM MgCl2、9. 8mM KC1、3. 6mM NADPH、37. 2mM磷酸鹽緩沖液 和 750pmol/ml CYP。
[0108] ?免疫突光染色
[0109] -用于細胞毒性參數(shù)的染色方案：
[0110] 處理后，用PBS (Gibco Invitrogen, Karlsruhe,德國）漂洗細胞，隨后用 10 μ M的細胞培養(yǎng)基中的CellTracker Green 5-氯甲基熒光素二乙酸酯（CMFDA) (Invitrogen, Karlsruhe,德國）進行染色。CMFDA本身是非突光的，被活細胞中的酯酶 水解成熒光染料。與硫醇基的反應導致可滲透細胞的熒光染料-加合物。酯酶活性可 用作細胞活力的指不器（Papadopoulos 等人，1994, J Tmmunol Methods 177, 101-111)。 在于37 °C進行30min的溫育期后，用PBS洗滌細胞，隨后3. 7 %的PBS中的甲醛 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen，德國）固定 20min。隨后，用 0· 05% Tween 20 進行 2 次額 外的洗滌步驟，隨后用PBS洗滌細胞，最后添加PBS和測量細胞。
[0111] -用于假定標志蛋白的染色方案：
[0112] 處理后，用 PBS (Gibco Invitrogen, Karlsruhe,德國）漂洗細胞，隨后用 3. 7 % 的 PBS 中的甲醒（Sigma-Aldrich, Taufkirchen,德國）固定 20min。在用 PBS 洗漆 2 次后，封閉細胞，用PBS中的7. 5 %山羊血清（Sigma-Aldrich, Taufkirchen,德國）和 0· 3 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen，德國）透化細胞 30min。將每一 種一抗分別于封閉/透化溶液中稀釋至如下終濃度：1〇μ g/ml抗-Gadd45a兔單克隆 抗體 IgG(Cell Signaling, Danvers, USA)、10 μ g/ml 抗-p21 兔單克隆抗體 IgG(Cell Signaling, Danvers, USA) ;5yg/ml 抗-p_ATM(Serl981)兔單克隆抗體 IgG(Cell Signaling, Danvers, USA) ;10μ g/ml 抗-p_ATR(Ser428)兔單克隆抗體 IgG(Cell Signaling，Danvers，USA) ;4μ g/ml 抗-p-cdc2(Tyrl5/Thrl4)兔多克隆抗體 IgG(Santa Cruz Biotechnology, Inc. ,Santa Cruz, USA) ;20μ g/ml 抗-p_Chkl(Ser345)兔單克 隆抗體 IgG(Cell Signaling，Danvers，USA) ;20yg/ml 抗-p_Chk2(Thr68)兔單克隆抗 體 IgG(Cell Signaling, Danvers, USA) ;2· 5 μ g/ml 抗-p-組蛋白 Η2Α· X(Serl39)兔單 克隆抗體 IgGl (Cell Signaling, Danvers, USA)或 2 μ g/ml 抗-p-p53 (Serl5)兔單克 隆抗體IgG(Invitrogen, Karlsruhe,德國），隨后添加所述抗體。在溫育16-18h后，用 0. 05%的PBS中的Tween 20(Calbiochem, Darmstadt,德國）洗漆細胞2次，添加封閉/ 透化溶液中的二抗/16 μ M Hoechst染色溶液。將二抗（Alexa Fluor 488山羊抗-兔 IgG, Invitrogen, Karlsruhe,德國）稀釋至終濃度2 μ g/ml。在Ih的溫育后，用0· 05 % Tween 20進行2次額外的洗滌步驟，用PBS洗滌細胞，最后添加PBS，測量細胞。
[0113] ?圖像獲取和細胞毒性參數(shù)的分析：
[0114] 在 ArrayScan VTI HCS 讀數(shù)器（Cellomics, Pittsburgh, USA)上，使用 IOx 物鏡進 行圖像獲取。為了檢測足夠的細胞，采集在每一個孔的中間開始的20個圖像。
[0115] 對于每一種染料按照激發(fā)/發(fā)射波長選擇濾光片：
[0116] -用于細胞毒性參數(shù)的方案：
[0117] 通道 1 :365±25 和 515± IOnm(XF93-Hoechst)，用于 Hoescht 33342，
[0118] 通常 2:475±20 和 515±10nm(XF93-FITC)，用于 CMFDA
[0119] ?圖像獲取和假定標志蛋白的分析：
[0120] 在 ArrayScan VTI HCS 讀數(shù)器（Cellomics, Pittsburgh, USA)上，使用 20x 物鏡進 行圖像獲取。為了檢測足夠的細胞，采集在每一個孔的中間開始的20個圖像。
[0121] 對于每一種染料按照激發(fā)/發(fā)射波長選擇濾光片：
[0122] -用于假定標志蛋白的方案：
[0123] 通道 1:365±25 和 515± IOnm(XF93-Hoechst)，用于 Hoescht 33342
[0124] 通道 2:475±20 和 515±10nm(XF93-FITC)，用于 Alexa Fluor 488 山羊抗-兔
[0125] 使用軟件 iDev 和 Bioapplication 4. 0 版（Cellomics, Pittsburgh, USA)分析圖 像。將染色的細胞核用于核和細胞質(zhì)（圍繞核的環(huán)）的定位。
[0126] 產(chǎn)生下列讀出參數(shù)：
[0127] -用于細胞毒性參數(shù)的方案：
[0128] 通道1 :每有效視野選擇的細胞計數(shù)
[0129] 通道2 :CMFDA細胞質(zhì)平均強度
[0130] -用于假定標志蛋白的方案：
[0131] 通道2:蛋白核平均強度
[0132] ?數(shù)據(jù)分析和解釋
[0133] 針對每一種化合物和濃度計算處理樣品相對于載體對照的倍數(shù)調(diào)控。使用學生氏 t檢驗測定統(tǒng)計顯著性（P-值〈0. 05)?；趯φ罩岛拖噍^于對照值的3倍標準差的增加選 擇每一個參數(shù)的閾值。對于p-p53 (Serl5)、p-H2A. X(Serl39)和p-ATM(Serl981)，閾值被設 置至1.5，對于口21、口-〇^1(56『345)、口-六丁1?(56『428)、口-。(1。2〇>1'15/1111'14)和6&(1(145〇， 閾值被設置至1. 6,對于p-Chk2 (Thr68)閾值被設置至1. 9。不包括具有沉淀或自發(fā)熒光 的濃度以及至少在兩個細胞毒性參數(shù)（每有效視野選擇的細胞計數(shù)和細胞質(zhì)中的CMFDA強 度）之一中顯示> 50%的細胞毒性作用的濃度。
[0134] 5種標志蛋白的測試
[0135] ?細胞處理和劑量選擇
[0136] 將細胞接種至黑色多聚D-賴氨酸涂覆的96孔板（BD Biocoat, Frankl in Lakes，USA) (0. 02x IO6個細胞/孔）中，放置24h以進行附著，隨后用由ICH S2 (Rl)指導 (EMA，2011)推薦的ImM的最大濃度的測試化合物進行處理。對于每一種化合物，利用2倍 系列的稀釋度測試9個濃度。DMSO 1% (v/v)用作實驗的載體對照。對于具有直接基因毒 性和前基因毒性的化合物，處理方法不同。具有直接基因毒性的化合物的處理正在進行， 并且在48h過程中每日進行重復。將具有前基因毒性的化合物與代謝活化系統(tǒng)一起溫育 6h (以限制S9-混合物的細胞毒性作用）。在該時期后，用細胞培養(yǎng)基洗滌細胞，隨后進行 18-h的恢復期。在48h過程中每日重復該處理。使用的代謝活化系統(tǒng)由下列組分和濃度 組成：8mM MgC12、32. 8mM KCl、12mM NADPH、124mM 磷酸鹽緩沖液和 2500pmol/ml 細胞色素 P450 (CYP)(于預混合物中的含量），對應于在用細胞培養(yǎng)基以1:3. 33稀釋后作為終濃度的 2.4111^%(：12、9.811111((：1、3.61111隱0?!1、37.21111磷酸鹽緩沖液和75(^111〇1/1111〇￥?。
[0137] ?免疫熒光染色
[0138] 利用和不利用代謝活化系統(tǒng)對每一種化合物進行兩種不同的染色法：
[0139] -染色方案1:
[0140] 處理后，用 PBS (Gibco Invitrogen, Karlsruhe,德國）漂洗細胞，隨后用 3. 7 % 的卩1^中的甲醒（3丨81]^-41(11'；[(311，131^1^1'(311611，德國）固定細胞20111；[11。在用？133進行 額外的洗滌步驟后，用2%的？83中的驢血清（1^11丨?0代，5(*￥ &此&(*，德國）和0.25% 的 Triton X-100(Sigma-Aldrich, Taufkirchen，德國）封閉和透化細胞 30min。將 一抗于封閉/透化溶液中稀釋至如下終濃度：2μ g/ml抗-p_p53(Serl5)兔單克隆抗 體 IgG(Invitrogen, Karlsruhe,德國），0· 8 μ g/ml 抗-p21 山羊多克隆抗體 IgG, (R&D systems, Minneapolis, USA) ;4 μ g/ml 抗-p-組蛋白 Η2Α· X (Serl39)小鼠單克隆抗體 IgGl (Millipore, Schwalbach,德國），隨后添加所述抗體。在溫育16_18h后，用0. 05 % 的PBS中的Tween 20 (Calbiochem, Darmstadt,德國）洗漆細胞，隨后添加封閉/透化溶液 中的二抗/16 μ M Hoechst染色溶液。將二抗以1:400稀釋（Alexa Fluor 488驢抗-兔、 Alexa Fluor 555 驢抗-山羊、Alexa Fluor 647 驢抗-小鼠，Invitrogen, Karlsruhe,德 國）。在Ih的溫育后，用0. 05% Tween 20進行兩個額外的洗滌步驟，用PBS洗滌細胞，最 后添加PBS，測量細胞。
[0141] -染色方案2:
[0142] 處理后，用PBS (Gibco Invitrogen, Karlsruhe,德國）漂洗細胞，隨后用 10 μ M的細胞培養(yǎng)基中的CellTracker Green 5-氯甲基熒光素二乙酸酯（CMFDA) (Invitrogen, Karlsruhe,德國）染色30min。CMFDA本身是非突光的，被活細胞中的酯酶 水解成熒光染料。與硫醇基的反應導致可滲透細胞的熒光染料-加合物。酯酶活性可用 作細胞活力的指不器（Papadopoulos 等人，1994, J Tmmunol Methods 177, 101-111)。隨 后，用PBS洗滌細胞，然后用3. 7%的PBS中的甲醛（Sigma-Aldrich，Taufkirchen，德國） 固定20min。隨后，用PBS洗滌細胞，用2%的PBS中的驢血清（Millipore，Schwalbach，德 國）和 0· 25% 的 PBS 中的 Triton X-100 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen，德國）封閉和透化 細胞30min。將一抗于封閉/透化溶液中稀釋至如下終濃度：4 μ g/ml抗-p-Chkl (Ser345) 山羊多克隆抗體IgG(santac;ruz，SantaC;ruz，USA)、4μg/ml抗-p-ATM(Se;rl981)小鼠單 克隆抗體IgGlK (Millipore，Schwalbach，德國），隨后添加至細胞。在溫育16-18h后，用 0. 05%的PBS中的Tween 20(Calbiochem，Darmstadt，德國）洗漆細胞，添加封閉/透化溶 液中的二抗/16yMHoechst染色溶液。將二抗以1:400稀釋（Alexa Fluor 555驢抗-山 羊、Alexa Fluor 647 驢抗-小鼠，Invitrogen, Karlsruhe,德國）。在溫育 Ih后，用 0.05% Tween 20進行2次額外的洗滌步驟，用PBS洗滌細胞，最終添加PBS，測量細胞。
[0143] ?圖像獲聚和分析
[0144] 在 ArrayScan VTI HCS 讀數(shù)器（Cellomics, Pittsburgh, USA)上，使用 20x 物鏡進 行圖像獲取。為了檢測足夠的細胞，采集在每一個孔的中間開始的50個圖像。
[0145] 對于每一種染料按照激發(fā)/發(fā)射波長選擇濾光片：
[0146] -方案 1:
[0147] 通道 1:365±25 和 515± IOnm(XF93-Hoechst)，用于 Hoescht 33342
[0148] 通道 2:475±20 和 515± IOnm(XF93-FITC)，用于 Alexa Fluor 488 驢抗-兔
[0149] 通道 3:549±4和 600±12.511111(父卩93-丁1?11'〇，用于六16叉3?111(^ 555 驢抗-山羊
[0150] 通道 4:655±15 和 730±25nm(XF110-Cy5(敏感度）），用于 Alexa Fluor 647 驢 抗-小鼠
[0151] -方案 2:
[0152] 通道 1 :365±25 和 515± IOnm(XF93-Hoechst)，用于 Hoescht 33342
[0153] 通道 2 :475±20 和 515±10nm(XF93-FITC)，用于 CMFDA
[0154] 通道 3 :549±4 和 600±12.5nm(XF93-TRITC)，用于 Alexa Fluor 555 驢抗-山羊
[0155] 通道 4 :655±15 和 730±25nm(XF110-Cy5(sensi tive))，用于 Alexa Fluor 647 驢抗-小鼠。
[0156] 利用軟件 iDev 和 Bioapplication 4 版（Cellomics, Pittsburgh, USA)進行圖像 分析。將兩個測定中的染色的細胞核用于核和細胞質(zhì)（圍繞核的環(huán)）的定位。
[0157] 產(chǎn)生每一個孔的下列讀出參數(shù)：
[0158] -方案 1:
[0159] 通道2 :p-p53(Serl5)核平均強度
[0160] 通道3 :p21核平均強度
[0161] 通道 4 :ρ-Η2Α· X (Ser 139)核平均強度
[0162] -方案 2:
[0163] 通道1 :每有效領域選擇的細胞計數(shù)
[0164] 通道2 :CMFDA細胞質(zhì)平均強度
[0165] 通道 3 :p-Chkl (Ser345)核平均強度
[0166] 通道 4 :p_ATM(Serl981)核平均強度
[0167] ?數(shù)據(jù)分析和解釋
[0168] 針對每一種化合物和濃度計算處理樣品相對于載體對照的倍數(shù)調(diào)控。使用學生氏 t檢驗測定統(tǒng)計顯著性（P-值〈0. 05)?；趯φ罩岛拖噍^于對照值的3倍標準差的增加選 擇每一個參數(shù)的閾值。對于對于p-Chkl (Ser345)和p-H2A. X(Serl39)，閾值被設置至2. 1， 對于p21、p-ATM(Serl981)，閾值被設置至1. 8,對于p-p53 (Serl5)閾值被設置至1. 9。如果 5種蛋白的至少一種顯示高于該閾值的倍數(shù)變化，則化合物被設置為陽性。否則化合物被設 置為陰性。不包括具有沉淀或自發(fā)熒光的濃度以及至少在兩個細胞毒性參數(shù)（每有效視野 選擇的細胞計數(shù)和細胞質(zhì)中的CMFDA強度）之一中顯示> 50%的細胞毒性作用的濃度。
[0169] 研究的目的在于使用HepG2細胞開發(fā)新型的基于特異性和靈敏性高含量成像的 體外誘變劑和前誘變劑測試系統(tǒng)。由于其有限的代謝能力，建立用于前誘變劑測試的IfepG2 細胞與代謝活化系統(tǒng)（MAS大鼠肝S9)的組合系統(tǒng)。達到9種不同的參與DNA損傷修復反 應的蛋白用作化合物誘導的基因毒性的假定標志。在利用（前_)基因毒素（環(huán)磷酰胺、 7, 12-二甲基苯并蒽、黃曲霉毒素&、2-乙酰氨基芴、放線菌素D、甲磺酸甲酯、依托泊苷）和 非-基因毒素（D-甘露醇、苯乙福明HC1、孕酮）處理后48h，使用HCI技術定量蛋白表達和 活化的變化。
[0170] 使用9種假定的標志蛋白中的5種進行最佳分類。選擇上述9種標志 物（p-p53(Ser15)、p21、P-H2A. X(Ser139)、p-ATM(Ser1981)、p-Chkl(Ser345)、 p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a、p-Chk2(Thr68))中的 5 個最具預測性的 標志物。盡管所述 5 種標志物 p-p53(Serl5)、ρ21、ρ-Η2Α· X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、 p-Chkl (Ser345)被實驗預定，p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a、 p-Chk2 (Thr68)的額外分析使得能夠更詳細地表征化合物的作用模式，將它們用作補充標 志物。
[0171] 在用（前_)基因毒素（環(huán)磷酰胺、7, 12-二甲基苯并蒽、黃曲霉毒素&、2-乙酰 氨基芴、放線菌素D、甲磺酸甲酯、依托泊苷）和非-基因毒素（D-甘露醇、苯乙福明HC1、孕 酮）處理后48h，使用HCI技術定量9種假定標志物p-p53 (Serl5)、p21、p-H2A. X (Serl39)、 p-ATM (Ser 1981)、p-Chkl (Ser345)、p-ATR (Ser428)、p-cdc2 (Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 ?-〇^2(11^68)的分析。使用9種假定標志蛋白中的5種標志（?-?53(561'15)、？21、？-!12八· 父(561'139)、口-六丁]?(561'1981)和口-〇^1(56『345))(表2)進行最佳分類。
[0172] 由ECVAM推薦的組I化學藥品（"在體外哺乳動物細胞基因毒性測試中應當被檢 測為陽性的體內(nèi)基因毒素"）的分析導致4種假陰性化合物。乙基亞硝脲、二甲基亞硝胺、 2, 4-二氨基甲苯和氯化鎘對于測試的任何蛋白標志物產(chǎn)未產(chǎn)生陽性結果。因此，具有20種 測試的體內(nèi)基因毒素中的18種分類為陽性的化合物的該測試系統(tǒng)的靈敏度為80% (表6 和9)。
[0173] 組2化學藥品（"非DNA反應性化學藥品，包括非基因毒性致癌物，其在體外哺 乳動物細胞基因毒性測試中應當產(chǎn)生陰性結果"）導致兩個假陽性測試化合物。孕酮和 Phenanthracene對于p-ATM(Serl981)都產(chǎn)生陽性結果，從而導致23種測試化合物中的兩 種假陽性測試化合物。因此，可計算91. 3%的特異度（表7和10)。
[0174] 組3化學藥品（"非DNA反應性化學藥品，包括非基因毒性致癌物、代謝毒物，以及 應當在體外哺乳動物細胞基因毒性測試中產(chǎn)生陰性結果但未曾被報導通常以高濃度或高 細胞毒性水平在小鼠淋巴瘤細胞中誘導染色體畸變或tk突變的其它化學藥品"）導致4種 假陽性測試化合物。沒食子酸丙酯、對-硝基酚、丁香酚和2, 4-二氯苯酚產(chǎn)生陽性結果，從 而導致19種測試化合物中的4種假陽性測試化合物。因此，可計算78. 9%的特異度（表8 和 11)。
[0175] 這5種蛋白是用于在藥物發(fā)現(xiàn)過程早期鑒定潛在基因毒素的潛在候選者。
[0176] · Luminex 分析
[0177] 將磁珠試劑盒（Milliplex MAP)用于使用Luminex系統(tǒng)檢測細胞裂解物中磷酸化 p53(Serl5)的變化以及p21的總蛋白水平。
[0178] MILLIPLEX MAP基于Luminex xMAP技術。Luminex使用專利技術來用兩種突光染 料內(nèi)部顏色編碼微球體。通過這些染料的精確濃度，可產(chǎn)生100種不同的有色珠粒，其每一 種用特定捕獲抗體涂覆。在通過珠粒捕獲來自測試樣品的分析物后，引入生物素化檢測抗 體。隨后用鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白（SAPE)綴合物、報道分子溫育反應混合物來在每 一個微球體表面上完成反應。對微球體進行照明，內(nèi)部染料發(fā)熒光，從而標識用于特定測定 的微球體組。第二照明光源激發(fā)PE，報道分子上的熒光染料。最后，高速數(shù)字-信號處理器 鑒定每一個單個微球體，并基于熒光報道分子信號定量其生物測定的結果。
[0179] 如下文中所述進行測定的性能，使用來自MILLIPLEX MAP試劑盒（EMD Millipore Cat.#46-662 和 46_621)的試劑。
[0180]-細胞裂解方案
[0181] 可在相同板中處理、洗滌和裂解生長在無菌96孔組織培養(yǎng)級板中貼壁或非貼壁 細胞，但需要在分開的96孔濾板中進行過濾。方案步驟如下：對于非貼壁細胞，將組織培養(yǎng) 板以500x g離心2分鐘以沉淀細胞。如果使用貼壁細胞，這始于下一步驟。通過抽吸除去 培養(yǎng)基，添加100 μ L冰冷PBS或TBS。對于非貼壁細胞，重復第一步驟。通過抽吸除去洗滌 液。添加35 μ L/孔含有磷酸酶抑制劑（包括ImM正釩酸鈉（Na3VO4))和新配制的蛋白酶抑 制劑的冰冷的IX MILLIPLEX MAP裂解緩沖液。將板置于定軌搖床（600-800rpm)上在4°C 進行10-15分鐘。將裂解物于-70°C貯存直至準備使用。
[0182] -免疫測定方案
[0183] 將過濾的裂解物于MILLIPLEX? MP測定緩沖液中以至少1:1稀釋。用于測定 的蛋白濃度的建議工作范圍為1至25 μ g的總蛋白/孔（25 μ L/孔，40至1000 μ g/mL)。將 50yL測定緩沖液添加至板的每一個孔，加蓋，在室溫（20-25°C)于板搖床上混合10分鐘。 傾倒測定緩沖液，通過將板倒置從所有孔除去殘留量，靈巧地將其輕叩至吸濕巾上數(shù)次。將 IX珠粒懸浮液渦旋10秒，將25 μ L IX珠粒懸浮液添加至每一個孔。將25 μ L的測定緩 沖液、重建的對照細胞裂解物和樣品裂解物添加至適當?shù)目?，在板搖床（600_800rpm)上于 2-8°C避光溫育過夜（16-20小時）。將手提式磁力分離塊貼附于板，放置60秒以待珠粒沉 降，隨后傾倒出樣品和對照。從磁力分離塊取出板，用每孔IOOuL測定緩沖液洗滌反。重 復總共2次洗滌。添加25 μ L/孔的1XMILLIPLEX MP檢測抗體。密封板，加蓋覆蓋，在室 溫（20-25°C )于板搖床上攪拌溫育1小時。貼附磁力分離塊，等待60秒，隨后傾倒出檢測 抗體。添加25μ L的IX MILLIPLEX MP鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白（SAPE)。密封板，用 蓋子覆蓋，在室溫（20_25°C )于板搖床上攪拌溫育15分鐘。將25 μ L的MILLIPLEX MAP擴 增緩沖液添加至每一個孔。密封板，加蓋覆蓋，在室溫（20_25°C )于板搖床上攪拌溫育15 分鐘。貼附磁力分離塊，等待60秒，隨后傾倒出SAPE/擴增緩沖液。將珠粒懸浮于150 μ L MILLIPLEX MP測定緩沖液中，于板搖床上混合5分鐘，隨后使用Luminex系統(tǒng)進行分析。
[0184] -數(shù)據(jù)分析和解釋
[0185] 針對每一種化合物和濃度計算處理樣品相對于載體對照的倍數(shù)調(diào)控。基于對照值 和相較于對照值3倍標準差的增加選擇每一個參數(shù)的閾值。對于p-p53 (Ser 15)和p21，將 閾值設置至1.5。如果至少一種蛋白顯示高于該閾值的倍數(shù)變化，則所述化合物被設置為陽 性。否則化合物被設置為陰性。
[0186] 用于使用Luminex系統(tǒng)檢細胞裂解物中測磷酸化p53 (Serl5)的變化以及p21的 總蛋白水平的MILLIPLEX MAP磁力珠粒試劑盒的結果示于表12中。檢測具有基因毒性的 化合物甲磺酸甲酯和依托泊苷以及非基因毒性D甘露醇。
[0187] 表 1
[0188]
【權利要求】
1. 一種用于就基因毒性和/或前基因毒性活性篩選化合物的方法，包括測定用一種 或多種化合物溫育的系統(tǒng)中相對于未用所述化合物溫育的系統(tǒng)，選自p-p53(Serl5)、p21、 p-H2A. X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl (Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/ Tyrl5)、Gadd45a和p-Chk2(Thr68)的至少兩種蛋白的活性形式的表達水平的步驟。
2. 權利要求1的方法，其中測定至少蛋白p_p53(Serl5)和p21的表達水平。
3. 權利要求1或2的方法，其中測定至少蛋白p-p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、 p-ATM(Serl981)和 p-Chkl (Ser345)的表達水平。
4. 權利要求1至3的任一項的方法，其中測定蛋白p-p53 (Serl5)、p21、p-H2A. X (Ser 139)、p-ATM(Ser 1981)、p-Chkl (Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/Tyrl5)、 Gadd45a 和 p_Chk2 (Thr68)的表達水平。
5. 權利要求1至4的任一項的方法，其中通過免疫突光染色或Luminex技術測定表達 水平。
6. 權利要求1至5的任一項的方法，其中用化合物溫育的系統(tǒng)中相對于未用所述化合 物溫育的系統(tǒng)的至少一種所述蛋白的表達水平的升高表示所述活性。
7. 權利要求6的方法，其中所述表達水平升高至少1. 5倍。
8. 權利要求7的方法，其中施用降低的濃度的化合物以提供具有1至1. 1倍的表達水 平。
9. 權利要求1至8的任一項的方法，其中以至少80%的靈敏度和/或特異度篩選具有 所述活性的化合物。
10. 權利要求1至9的任一項的方法，其中具有最低（前-)基因毒性的化合物或 非_(前_)基因毒性化合物被鑒定，并且其中表達水平的最低升高或無升高表明所述化合 物，其適合用于其期望的用途。
11. 一種用于給患者施用治療性化合物的方法，包括利用一系列化合物進行權利要求 1至10的任一項的方法，鑒定不具有基因毒性和前-基因毒性活性的化合物，以及給需要所 述化合物的期望的用途的患者施用所述化合物。
12. 用于監(jiān)控發(fā)生癌癥、腫瘤、轉(zhuǎn)移和/或血管生成障礙的可能性的方法，所述疾病或 障礙因響應利用化合物的治療而導致的增殖、分化和/或損傷修復的失調(diào)引起、介導和/ 或傳播，其中測定取自哺乳動物的生物樣品中選自P_p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、 p-ATM(Serl981)、p-Chkl (Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 p-Chk2 (Thr68)的至少兩種蛋白的表達水平，其中至少一種所述蛋白的表達水平的升高表 明所述化合物具有基因毒性和/或前-基因毒性活性并且所述可能性得以增加，所述哺乳 動物需要利用給所述哺乳動物施用所述化合物的這樣的治療。
13. -種用于預測患者響應利用藥物的治療性治療而患腫瘤的可能性的體外方法，包 括如下步驟：（i)測量來自所述患者的組織或血漿的活檢樣品的選自P-P53 (Serl5)、p21、 p-H2A. X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、p-Chkl (Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2(Thrl4/ Tyrl5)、Gadd45a和p-Chk2(Thr68)的至少兩種蛋白的表達水平，（i i)將來自所述患者的 組織或血漿的樣品離體地暴露于所述藥物，和（i i i)測量步驟（i i)的所述暴露的樣品 的步驟（i)中指定的所述蛋白的表達水平以及計算步驟（i)和（i i i)中測量的表達水平 的差異，其中相較于步驟（i)，該步驟（i i i)中獲得的所述蛋白的至少一種的表達水平的 升高表示所述藥物具有基因毒性和/或前-基因毒性活性并且所述可能性得以增加。
14. 至少兩種蛋白用作用于篩選具有基因毒性和/或前-基因毒性活性的化合物的 標志蛋白的用途，所述蛋白選自 P_p53(Serl5)、p21、p-H2A.X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、 p-Chkl (Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2 (Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 p-Chk2 (Thr68)。
15. -種用于檢測基因毒性和/或前基因毒性活性的試劑盒，其包含至少兩種抗體， 每一種抗體特異性結合選自 P_p53(Serl5)、p21、p-H2A. X(Serl39)、p-ATM(Serl981)、 p-Chkl (Ser345)、p-ATR(Ser428)、p-cdc2 (Thrl4/Tyrl5)、Gadd45a 和 p-Chk2 (Thr68)的不 冋蛋白。
【文檔編號】G01N33/50GK104364649SQ201380030301
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2013年5月28日 優(yōu)先權日:2012年6月13日
【發(fā)明者】S·O·穆勒, Y·迪茨 申請人:默克專利股份有限公司