男性不育的生物標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于診斷男性不育的方法，包含指示男性不育的生物標(biāo)志物，包含鑒定和檢測(cè)指示男性不育的生物標(biāo)志物的方法，還包含用于診斷或檢測(cè)男性不育的試劑盒。本發(fā)明結(jié)合精液常規(guī)檢查，可實(shí)現(xiàn)對(duì)男性不育癥的準(zhǔn)確診斷。
【專利說明】男性不育的生物標(biāo)志物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物標(biāo)志物，特別是涉及男性不育的生物標(biāo)志物，包含用于鑒定篩選男性不育相關(guān)生物標(biāo)志物的方法，包含用于檢測(cè)男性不育生物標(biāo)志物的方法，還包含用于診斷或檢測(cè)男性不育的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]男性不育已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的重大公共健康問題。傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析(精子數(shù)量、存活力、活動(dòng)率和形態(tài)等常規(guī)精液分析)是目前判斷男性生育力的常用手段，但是僅僅依靠精液常規(guī)分析來預(yù)測(cè)男性生育狀況仍是很不準(zhǔn)確的。臨床上對(duì)絕大部分的男性不育患者的真正不育原因仍然不清楚，尤其是臨床上大約有近30%的男性不育患者的常規(guī)精液分析結(jié)果均正常和接近正常，因此長(zhǎng)期以來臨床對(duì)男性不育的診斷存在很大的困難，主要原因是精子數(shù)量、存活力、活動(dòng)率和形態(tài)等常規(guī)精液分析指標(biāo)只能反映最基本的精液質(zhì)量，而不能反映所有的精子功能，因此需要發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物并輔助傳統(tǒng)的精液常規(guī)分析，實(shí)現(xiàn)對(duì)男性不育癥的準(zhǔn)確診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種診斷男性不育的方法，一般涉及體液樣品的分析性測(cè)試。在一些方面中，包含了用于指示男性不育的生物標(biāo)志物，包含用于鑒定和檢測(cè)指示男性不育生物標(biāo)志物的方法，還包含用于診斷或檢測(cè)男性不育的試劑盒。本發(fā)明作為一種輔助診斷方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)男性不育的準(zhǔn)確診斷。
[0004]在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本文提供了一種診斷男性不育的方法，包括:
(a)提供男性受試者體液樣品，體液樣品選自受試者尿液、血清、血漿、血液、精液、精子、精漿、唾液，尤其是尿液；
(b)體液樣品經(jīng)過必要的前處理，包括使其保持液體狀態(tài)，稀釋，離心或過濾去除沉
淀；
(C)通過酶免疫測(cè)定或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)方法測(cè)定受試者體液中乙酰肉堿、天冬氨酸、肉堿C3: 1、酮肉堿、亮氨酰脯氨酸、肉堿C8、甲基黃嘌呤、肉堿C10:2、肉堿C10: 1、腺嘌呤的一種或兩種或多種任意組合的指示男性不育生物標(biāo)志物的水平，并與所對(duì)應(yīng)的參考水平進(jìn)行比較，其中所述至少一種指示男性不育生物標(biāo)志物的水平與參考水平的差異指示該受試者患有男性不育。
[0005]在一個(gè)實(shí)施方案中，參考水平是指未患男性不育的受試者對(duì)照群體中對(duì)應(yīng)的所述體液中對(duì)應(yīng)的所述至少一種指示男性不育生物標(biāo)志物的水平。
[0006]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述男性受試者不局限于人類，還包括所有的哺乳動(dòng)物。
[0007]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酶免疫測(cè)定是指固相酶免疫測(cè)定(ELISA)。
[0008]在本發(fā)明的另一方面，本文提供了一種用于鑒定和檢測(cè)指示男性不育生物標(biāo)志物的方法，該方法包括: (a)通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定患有男性不育受試者群體和未患男性不育受試者群體的體液樣品中所有可檢測(cè)生物標(biāo)志物的水平；
(b)將測(cè)得的患有男性不育受試者群體和未患男性不育受試者群體的體液樣品中所有可檢測(cè)生物標(biāo)志物的水平一一對(duì)應(yīng)進(jìn)行比較，顯著差異的生物標(biāo)志物被鑒定為指示男性不育的生物標(biāo)志物。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述體液選自受試者尿液、血清、血楽:、血液、精液、精子、精漿、唾液，尤其是尿液。
[0010]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法并不局限于鑒定指示男性不育生物標(biāo)志物，還包括獨(dú)立用于指示男性不育生物標(biāo)志物的測(cè)定。
[0011]在本發(fā)明的另一方面，本文提供了一種用于診斷檢測(cè)男性不育的試劑盒，其包括:
(a)所述乙酰肉堿、天冬氨酸、肉堿C3:1、酮肉堿、亮氨酰脯氨酸、肉堿CS、甲基黃嘌呤、肉堿C10:2、肉堿C10: 1、腺嘌呤指示男性不育生物標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品；
(b)用于檢測(cè)所述指示男性不育生物標(biāo)志物的存在的介質(zhì)；
(c)用于檢測(cè)所述指示男性不育生物標(biāo)志物的所述介質(zhì)的試劑和/或說明書。
[0012]在一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測(cè)所述指示男性不育生物標(biāo)志物的存在的所述介質(zhì)為抗體、抗體片段或抗體衍生物。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述的抗體、抗體片段或抗體衍生物可特異性地結(jié)合于所述指示男性不育生物標(biāo)志物或其修飾配體。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述試劑盒用于測(cè)定來自受試者的體液樣品中所述乙酰肉堿、天冬氨酸、肉堿C3: 1、酮肉堿、亮氨酰脯氨酸、肉堿C8、甲基黃嘌呤、肉堿C10:2、肉堿C10: 1、腺嘌呤的至少一種指示男性不育生物標(biāo)志物的水平，并與所對(duì)應(yīng)的參考水平進(jìn)行比較，其中所述至少一種指示男性不育生物標(biāo)志物的水平與參考水平的差異指示該受試者患有男性不育。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考水平可以通過使用未患男性不育的受試者對(duì)照群體來確定，對(duì)于人類受試者，一種更常見的測(cè)定是來自多個(gè)正常個(gè)體的結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)組合。
[0016]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)定通過固相酶免疫測(cè)定(ELISA)進(jìn)行。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:(1)檢測(cè)所需樣品為體液，獲取方便，避免了機(jī)體損傷、射線成像等有害復(fù)雜的過程；(2)作為一種輔助診斷方法，結(jié)合常規(guī)精液檢查，可實(shí)現(xiàn)對(duì)不育癥，尤其是對(duì)常規(guī)精液檢查正常而被認(rèn)為不明原因的不育癥的準(zhǔn)確診斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為:肉堿C8的ROC分析。實(shí)線是肉堿C8風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC分析(AUC=0.65，P=4.06E-04);虛線是參比線并且表示0.5的AUC (即無差別)。
[0019]圖2為:肉堿C10:1的ROC分析。實(shí)線是肉堿ClO:1風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC分析(AUC=0.62，P=L 71E-03);虛線是參比線并且表示0.5的AUC (即無差別)。
[0020]圖3為:肉堿C10:2的ROC分析。實(shí)線是肉堿ClO: 2風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC分析(AUC=0.64，P=2.30E-04);虛線是參比線并且表示0.5的AUC (即無差別)。
[0021]圖4為:酮肉堿的ROC分析。實(shí)線是酮肉堿風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC分析(AUC=0.66，P=L 67E-04);虛線是參比線并且表示0.5的AUC (即無差別)。
[0022]圖5為:乙酰肉堿的ROC分析。實(shí)線是乙酰肉堿風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC分析(AUC=0.69，P=2.11E-03);虛線是參比線并且表示0.5的AUC (即無差別)。
[0023]圖6為:甲基黃嘌呤的ROC分析。實(shí)線是甲基黃嘌呤風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC分析(AUC=0.65，P=8.77E-04);虛線是參比線并且表示0.5的AUC (即無差別)。
[0024]圖7為:亮氨酰脯氨酸的ROC分析。實(shí)線是亮氨酰脯氨酸風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC分析(AUC=0.66，P=2.64E-04);虛線是參比線并且表示0.5的AUC (即無差別)。
[0025]圖8為:肉堿C3:1的ROC分析。實(shí)線是肉堿C3:1風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC分析(AUC=0.68，P=2.19E-06);虛線是參比線并且表示0.5的AUC (即無差別)。
[0026]圖9為:腺嘌呤的ROC分析。實(shí)線是腺嘌呤風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC分析(AUC=0.61，P=9.63E-04);虛線是參比線并且表示0.5的AUC (即無差別)。
[0027]圖10為:天冬氨酸的ROC分析。實(shí)線是天冬氨酸風(fēng)險(xiǎn)因子的ROC分析(AUC=0.68，P=5.22E-05);虛線是參比線并且表示0.5的AUC (即無差別)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]通過借助以下實(shí)施例將更詳細(xì)說明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說明性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例
[0029]樣品收集
尿液樣品來自135名不育癥男性患者和158名正常健康男性對(duì)照。本文中男性不育癥患者為與其配偶經(jīng)過一年以上沒采取避孕措施的正常性生活仍然不育，但其配偶經(jīng)臨床檢查被評(píng)估為生育功能正常。正常對(duì)照為與其配偶一年內(nèi)正常生育的男性。男性不育患者的平均年齡為29.45+4.47，年齡范圍為24-34歲；正常對(duì)照男性平均年齡為29.11+5.07，年齡范圍為24-34歲。全部尿液樣品均在南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收集，所有受試者均簽署書面知情同意書。
[0030]尿液制備
分析前，在室溫下溶解尿液樣品。將300μ L去離子水加入300μ L尿液中，在4 ° C下，12000 Xg離心10分鐘。在進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜(LC/MS)分析前，用注射過濾器使樣品離心后上清液通過孔徑0.22ΜΠ1的濾膜過濾。
[0031]LC/QT0F-MS 條件
尿液代謝圖譜通過Ultimate-3000液相色譜儀(美國(guó)戴安公司)與MicrOTOF-Q I1-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(Bruker Daltonics, USA)聯(lián)用系統(tǒng)獲得。反相分離使用的是填料孔徑為2.1 X 150 mm 2.6 Mm的C18色譜柱(Phenomenex, USA),柱溫維持在30 ° C,進(jìn)樣體積為5yL。流動(dòng)相為(A) 0.1%的甲酸水溶液和(B) 0.1%的甲酸乙腈溶液的混合液，洗脫梯度如下:在1.5分鐘內(nèi)，流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)由5%上升到20%，在8.5分鐘時(shí)流動(dòng)相B上升到60%，0.1分鐘后流動(dòng)相B上升到95%并保持1.9分鐘，再在0.1分鐘內(nèi)下降至5%，最終流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)在5%維持3分鐘。流動(dòng)相流速為200 μ L /min。質(zhì)譜儀在正離子，ESI掃描模式下運(yùn)行，掃描范圍為50到lOOOm/ζ。數(shù)據(jù)在centiOid模式下收集。毛細(xì)管電壓和端板偏移電位分別設(shè)置為4500V和-500V。噴霧氣壓設(shè)置為0.6bar，干氣流量為6 L/min，溫度為200° C。利用二級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步潛在的生物標(biāo)志物。碰撞氣為氬氣，對(duì)于每一個(gè)生物標(biāo)志物，碰撞能范圍調(diào)整為IOeV到35eV。
[0032]數(shù)據(jù)分析
對(duì)所有采集到的色譜圖進(jìn)行峰對(duì)齊、背景噪音去除和保留時(shí)間-分子量離子對(duì)的提取，經(jīng)過歸一化和pareto模式化后，導(dǎo)入SMCA-P vl2軟件進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析。利用正交偏最小方差判別分析(OPLS-DA)對(duì)不育患者和可育的對(duì)照樣本進(jìn)行區(qū)別并篩選生物標(biāo)志物。在訓(xùn)練集中，基于對(duì)變化的顯著貢獻(xiàn)各種代謝物被鑒定為潛在的生物標(biāo)志物。基于從OPLS-DA模型中構(gòu)建的變量重要性投影(VIP)圖和S圖，篩選出潛在的生物標(biāo)志物，并用Wilcoxon-Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)一步證實(shí)。P值小于0.005則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異顯著性。
[0033]生物標(biāo)志物鑒定
等量混合所有樣本制備一個(gè)混合的尿液樣本，分析該混合樣本以獲得目標(biāo)生物標(biāo)志物的精確分子量信息和同位素模式。使用輔助軟件DataAnalysis 4.0 (Bruker Daltonics,USA)計(jì)算擬合篩選到的代謝物的可能的分子式，篩選出的尿液生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)信息提交用于數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為Human Urine Metabolome Database (HMDB, http://www.urinemetabolome.ca/)和 Metabolite and Tandem MS Database (METLIN, http://metlin.scripps.edu/),并對(duì)候選標(biāo)志物進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,最終通過與商品化的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，確認(rèn)鑒定出的特異代謝物。
[0034]統(tǒng)計(jì)分析
使用SPSS Statistics 18軟件(SPSS Inc.)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。米用Mann-Whitney非參數(shù)U檢驗(yàn)法比較病例組和對(duì)照組之間的生物標(biāo)志物水平，P值小于0.05指示差異顯著性。米用 SPSS Statistics 18 軟件(SPSS Inc.)進(jìn)行受試者操作特征(Receiver OperatingCharacteristic Curve, ROC)曲線分析，以評(píng)估這些生物標(biāo)志物區(qū)分不育個(gè)體和可育對(duì)照個(gè)體的預(yù)測(cè)能力。通過ROC曲線計(jì)算曲線下面積(AUC)。對(duì)區(qū)分不育個(gè)體具有最強(qiáng)的預(yù)測(cè)力的是具有最大的ROC曲線下面積的每一個(gè)生物標(biāo)志物或標(biāo)志物組合。通過檢索那些同時(shí)具有最高靈敏度和特異性的生物標(biāo)志物，確定每個(gè)生物標(biāo)志物的最佳截點(diǎn)。
[0035]病例的尿液代謝組學(xué)研究
采用有監(jiān)督的OPLS-DA最大化不育病人和可育的對(duì)照個(gè)體之間的代謝圖譜差異。選擇對(duì)兩組之間的分類貢獻(xiàn)最大的變量作為潛在的生物標(biāo)志物用于不育癥的診斷。首先，采用變量的VIP得分作為篩選潛在生物標(biāo)志物的擴(kuò)展集的一個(gè)重要因素。VIP得分大于3.0的變量在此步驟中被選中。其次，從候選名單中移除jack-knifing置信區(qū)間小于O的變量。然后，采用從OPLS-DA模型中建立的S-plot進(jìn)一步排除不合適的變量。挑選S-plot中絕對(duì)P值大于0.04和相對(duì)P (corr)值大于0.02的變量。由于對(duì)模型分類貢獻(xiàn)微弱，位于矩陣點(diǎn)中心附近的變量被移除。采用Wilcoxon-Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)作為最終程序,排除P值大于0.005的變量。最后，結(jié)合VIP和S-plot以及顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果,最初的56個(gè)變量中的17個(gè)被選定為生物標(biāo)志物并進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定。
[0036]17個(gè)潛在生物標(biāo)志物中的10個(gè)被鑒定出來并列于表1，包括六種脂酰肉堿，腺嘌呤，天冬氨酸，亮氨酰脯氨酸和甲基黃嘌呤。[0037]表1從不育患者和健康對(duì)照個(gè)體中獲得的尿液差異代謝物
【權(quán)利要求】
1.一種用于診斷男性不育的方法，其特征在于: (a)檢測(cè)受試者體液中至少一種指示男性不育生物標(biāo)志物的水平，其中至少一種指示男性不育生物標(biāo)志物選自乙酰肉堿、天冬氨酸、肉堿C3: 1、酮肉堿、亮氨酰脯氨酸、肉堿C8、甲基黃嘌呤、肉堿ClO: 2、肉堿C10: 1、腺嘌呤； (b)將所述受試者體液中至少一種指示男性不育生物標(biāo)志物的水平與參考水平進(jìn)行比較，其中所述至少一種指示男性不育生物標(biāo)志物的水平與參考水平的差異指示該受試者患有男性不育。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中，所述參考水平是未患男性不育的受試者對(duì)照群體中對(duì)應(yīng)的所述體液中對(duì)應(yīng)的所述至少一種指示男性不育生物標(biāo)志物的水平。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述方法，其中，所述體液選自受試者尿液、血清、血漿、血液、精液、精子、精漿、唾液，尤其是尿液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述方法，其中，所述受試者為男性，但不局限于人類，包括其它所有哺乳動(dòng)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述方法，其中，所述測(cè)定通過酶免疫測(cè)定或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測(cè)定進(jìn)行。
6.一種用于鑒定和檢測(cè)指示男性不育生物標(biāo)志物的方法，其特征在于: (a)測(cè)定患有男性不育受試者群體和未患男性不育受試者群體的體液樣品中的所有可檢測(cè)生物標(biāo)志物的水平； (b)將測(cè)得的患有男性不育受試者群體和未患男性不育受試者群體的體液樣品中的所有可檢測(cè)生物標(biāo)志物的水平一一對(duì)應(yīng)進(jìn)行比較，顯示差異的生物標(biāo)志物被鑒定為指示男性不育的生物標(biāo)志物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其中，所述體液選自受試者尿液、血清、血漿、血液、精液、精子、精漿、唾液，尤其是尿液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其中，所述測(cè)定通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求6和權(quán)利要求8所述方法，其中，所述液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法不局限于指示男性不育生物標(biāo)志物的鑒定，包括獨(dú)立用于指示男性不育生物標(biāo)志物的測(cè)定。
10.一種用于診斷檢測(cè)男性不育的試劑盒，包括用于檢測(cè)在權(quán)利要求1中所述的指示男性不育生物標(biāo)志物的存在的介質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中，用于檢測(cè)所述生物標(biāo)志物的存在的所述介質(zhì)為抗體、抗體片段或抗體衍生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體、抗體片段或抗體衍生物可特異性地結(jié)合于權(quán)利要求1所述的指示男性不育生物標(biāo)志物或其修飾配體。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中，用于檢測(cè)權(quán)利要求1所述的指示男性不育生物標(biāo)志物的方法為固相酶免疫測(cè)定(ELI SA )。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，還包括用于使用在權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的方法中檢測(cè)生物標(biāo)志物的所述介質(zhì)的試劑和/或說明書。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103630678SQ201310112391
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月29日
【發(fā)明者】張潔, 申河清, 王展林 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所