專利名稱：一種基于微狹縫結(jié)構(gòu)的全pdms微流控細胞捕獲芯片及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PDMS微流控細胞捕獲芯片及微流控細胞捕獲控制。
背景技術(shù)：
細胞是非常微小的具有獨特生命活動的基本單元，傳統(tǒng)的細胞研究通常以大量細胞樣本為對象，期望獲得同類細胞的普遍性質(zhì)。然而，即使是同一類型的細胞之間也或多或少存在差異，因此這種分析實際上僅能提供整體細胞樣本的平均響應(yīng)，而忽略了單一細胞及細胞之間的詳細信息。細胞行為的異質(zhì)性無論對于細菌還是動物真核細胞都是其固有性質(zhì)，在細胞生長、分化及感染等所有復(fù)雜生物事件中也是普遍存在的。因此，在生物及化學(xué)研究中，對實驗條件的可控化，尤其是對于單細胞的控制，將有助于科學(xué)家對細胞調(diào)控機制和分子水平相互作用等基本生命過程的理解，也一直是推動科技不斷發(fā)展的強大動力。目前，最成功的單細胞捕獲及操縱當屬膜片鉗和激光光鑷技術(shù)。前者是通過負壓將一個單細胞捕獲在單根玻璃微電極吸管端口，并用于記錄細胞膜離子通道分子活動的單細胞分析技術(shù)。激光光鑷技術(shù)是利用一束高度匯聚的激光形成的三維勢阱來俘獲和操控細胞、細胞器甚至生物大分子等大多數(shù)生物微粒。但這兩種技術(shù)均需復(fù)雜儀器，且效率太低。近些年發(fā)展起來的微流控技術(shù)或芯片實驗室技術(shù)為細胞操控及分析提供了新的發(fā)展思路?；谖⒊叨认虏煌奈锢砘瘜W(xué)原理，科學(xué)家已發(fā)展出具有各種功能和不同應(yīng)用的微流控細胞芯片。作為細胞后續(xù)分析及研究的基本前提，細胞的分離和捕獲，尤其是單細胞尺度上，幾乎在所有微流控細胞分析裝置中都是重要一環(huán)。目前，用于芯片上細胞分離和捕獲的手段涉及光、電、聲、磁、流體力學(xué)、機械加工以及化學(xué)方法等眾多領(lǐng)域，主要分為接觸式和非接觸式兩種。光、電、聲、磁等作用都為非接觸式。光學(xué)手段是激光光鑷技術(shù)與芯片技術(shù)的結(jié)合，利用了多數(shù)芯片如玻璃、PDMS及其他高分子材料的透明特性，它可實現(xiàn)單細胞捕獲和操控，但其涉及儀器復(fù)雜，操控單一，限制較多。電學(xué)方法是與微流控芯片最成功的結(jié)合手段，不僅有利于儀器集成，且有多種作用方式，如電滲、電泳、介電電泳(nDEP，pDEP) 等方式，不僅可進行群體細胞的捕獲和分離，還可實現(xiàn)單細胞捕獲。但是這種方式往往需要在芯片上集成精細電極，需要復(fù)雜的電源控制；另外，電壓對細胞活性及溶液體系都有不利的影響。聲學(xué)和磁學(xué)是新興的非接觸式細胞控制手段，但其控制效果有限，很難實現(xiàn)單細胞捕獲和操控?；瘜W(xué)方法作為一種選擇性強，生物兼容性好的方法在微流控芯片上的應(yīng)用日益廣泛。它往往結(jié)合微機械加工手段通過化學(xué)修飾實現(xiàn)區(qū)域化的細胞粘附和結(jié)合，可達到單細胞選擇性捕獲，通常用于細胞培養(yǎng)、免疫分析等，但其捕集效率較差，控制力較弱，且需要復(fù)雜的化學(xué)修飾處理。還有一種化學(xué)方法是利用水凝膠包裹細胞形成捕獲，這種方法作用溫和，但其可操作性較差。微機械加工技術(shù)結(jié)合流體力學(xué)控制用于整體及單個細胞樣本的捕獲是目前最有效的細胞固定方式。這種技術(shù)往往通過加工尺寸與細胞相匹配的微井、微孔、微壩、微狹縫及微管道等幾何陷阱或障礙來捕獲細胞，不僅可形成開放陣列體系， 還可以在微通道中實現(xiàn)對細胞的控制。這種方法無需其他控制手段和儀器，對細胞無損傷，可兼容其他分析或控制方法，可在單細胞尺度上研究其刺激響應(yīng)、相互作用以及遷移、分化、凋亡等生理過程，尤其適用于對懸浮細胞進行研究。其缺點是對微加工技術(shù)要求較高， 在普通化學(xué)實驗室中難以實現(xiàn)。因此，探尋一種簡單通用的，采用常規(guī)加工手段即可實現(xiàn)的芯片制作方法，及在普通實驗室中即可實現(xiàn)的高效率、高分辨率的細胞捕獲方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免昂貴設(shè)備及精細未加工手段的使用，而提供一種制作簡單的、高效通用的微流控細胞捕獲方法，用于拓展普通實驗室中對細胞進行研究的有效手段。
本發(fā)明的目的通過如下措施來達到
一種雙層結(jié)構(gòu)的細胞捕獲芯片，它是基于微狹縫結(jié)構(gòu)的全聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控細胞捕獲芯片，它由上下兩片固化的聚二甲基硅氧烷薄片構(gòu)成，，在聚二甲基硅氧烷薄片上分別制作有不同尺寸及形狀的微型下凹通道，上、下兩片聚二甲基硅氧烷疊合時，使上、 下兩層通道沿邊緣相互平行交錯，形成10士5 μ m的單個或多個狹縫，該狹縫用于阻擋細胞形成對有限數(shù)量細胞的可控捕獲。上述的雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，所述的通道狹縫可以通過通道對準鍵合的方法制得。上述的雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，所述的通道狹縫長度及數(shù)量可以通過不同通道組合和對準方法進行調(diào)控。上述的雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，可通過調(diào)整狹縫的長度和大小對捕獲細胞的數(shù)量進行控制，可形成從單個細胞到幾十個細胞的有效捕獲。上述的雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，可利用流體動力學(xué)原理對細胞進行捕獲，并可在捕獲后通過出入口的壓力控制釋放細胞，從而可重復(fù)進行細胞的捕獲操作。一種制作上述的雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片的方法，它包括下列步驟
步驟1.玻璃通道制作玻璃芯片通道采用標準光刻和化學(xué)濕法刻蝕技術(shù)制備。采用商品化勻膠鉻版，根據(jù)通道設(shè)計圖案進行光刻，蝕刻深度為30-50 μ m ；
步驟2.制作上下兩層聚二甲基硅氧烷(PDMS)微通道薄片以上述玻璃芯片為陰性模板，在其上澆鑄一定量PDMS，加熱固化，剝離后即得具有相應(yīng)陽模結(jié)構(gòu)的PDMS芯片，將此PDMS陽模經(jīng)空氣等離子體處理后，迅速在表面旋涂質(zhì)量百分濃度為0. Γ0. 5%的聚乙烯醇(PVA)水溶液，并于紅外燈下烘干，以此PDMS芯片為陽性模板，在其上澆鑄聚二甲基硅氧烷，固化后可輕松剝離，即可得到與刻蝕玻璃芯片通道一致的PDMS芯片；
步驟3.狹縫制作與芯片鍵合將制作好相應(yīng)通道的上下兩片PDMS芯片同時經(jīng)等離子體處理，迅速在其上滴加數(shù)滴去離子水，然后將上片蓋在下片上，此時由于水的存在，兩片 PDMS可相互順利滑動，將兩層上的微通道平行對準，使其形成整條或部分長度的狹縫，在顯微鏡下調(diào)整狹縫寬度使之不超過15 μ m(小于相應(yīng)細胞尺寸)，用濾紙吸去大部分多余水分，保持上下兩層芯片位置并置于紅外燈下烘干，約30min后即可鍵合穩(wěn)固而得到狹縫捕獲芯片，狹縫長度可根據(jù)對準管道部分進行調(diào)整，上片需預(yù)留上下兩層通道的出入口以進行進樣操作和壓力調(diào)整。
4
上述的制作雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片的方法，所述的步驟3可以進行通道組合與狹縫調(diào)控可采用不同構(gòu)型的微通道進行組合形成不同長度的狹縫，用于調(diào)控捕獲細胞的數(shù)量；可采用直線通道組合形成較長狹縫，從而形成細胞的直線排列；也可采用點狀通道組合或直線與點狀通道組合形成多個捕獲狹縫，實現(xiàn)對少量細胞的捕獲；同時，由于可通過上下兩片PDMS的滑動靈活控制通道的對準位置，可采用合適的點狀通道組合，交叉對準形成微小狹縫，對單個細胞進行捕獲。本發(fā)明的雙層細胞捕獲芯片可方便地對單個及多個細胞進行捕獲和釋放，其步驟為
在上層通道入口處注入細胞懸液，由于液體靜壓力的差別，細胞跟隨溶液流向出口并向下層管道形成分流，受狹縫阻擋，細胞沿流動方向不斷在狹縫上排列聚集形成捕獲，多余細胞隨懸液從出口排出；保持壓力作用，還可對捕獲細胞進行清洗等操作。將樣品溶液自入口吸出，在下層通道出入口注入緩沖溶液，使液體壓力反向，即使溶液反向流過狹縫，可釋放捕獲的細胞，并從上層通道出口排出，從而可重復(fù)對細胞進行捕獲和釋放。本發(fā)明的具體效果如下本發(fā)明方法通過簡單的芯片制作方法，利用微通道對準鍵合方法制作可用于捕獲少量細胞的狹縫結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)的利用流體動力原理和微結(jié)構(gòu)的芯片上細胞捕獲技術(shù)相比，該發(fā)明具有以下優(yōu)點1、制作方法簡單、可靠，成本低廉，采用全 PDMS材質(zhì)及水潤滑鍵合方法，不需過多修飾步驟；2、無需超凈室，無需精密微加工儀器及手段，僅利用傳統(tǒng)刻蝕方法即可形成適用于細胞尺寸的狹縫結(jié)構(gòu)，普通化學(xué)實驗室中即可實現(xiàn)，便于普及；3、該方法制得結(jié)構(gòu)可方便調(diào)整，實現(xiàn)從單個細胞到數(shù)十個細胞的捕獲和排列，捕獲效率高，控制簡便；4、該芯片為軟質(zhì)芯片，同時PDMS材質(zhì)使得后續(xù)修飾及集成操作簡單可行，還可制作集成微電極用于對細胞進行實時監(jiān)控和分析檢測。


圖1. PDMS微通道芯片制作示意圖2狹縫制作及芯片集成示意圖。(a)下層PDMS芯片微通道；(b)上層PDMS芯片微通道；(I)PBS緩沖溶液入口 ；(2) PBS緩沖溶液出口 ；(1，)細胞溶液入口 ；(2，)細胞溶液出口 ；
圖3.細胞捕獲及狹縫調(diào)控。(a，e)直線通道組合；(b，f)點狀通道、直線通道組合； (c, g)直線通道、點狀通道組合；(d，h)點狀通道、點狀通道組合；
圖4.少量細胞捕獲及單細胞捕獲。(a)點狀對應(yīng)狹縫一多個細胞捕獲；(b)點狀交錯狹縫一多個細胞捕獲；(c)點狀交錯狹縫一單個細胞捕獲。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實例對本發(fā)明作進一步說明。實驗過程中使用的水均為二次蒸餾水，實驗所用試劑包括磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，氯化鉀，氯化鈉，聚乙烯醇等均為分析純。所用細胞為人胃癌細胞株(BGC-823)。實施例1.雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片的制作1.采用如圖1所示的方式制備PDMS微通道芯片。步驟1.玻璃通道制作玻璃芯片通道采用標準光刻和化學(xué)濕法刻蝕技術(shù)制備。 采用商品化勻膠鉻版，根據(jù)通道設(shè)計圖案進行光刻，蝕刻深度為30-50 μ m ；
步驟2.制作上、下兩層聚二甲基硅氧烷(PDMS)微通道薄片以上述玻璃芯片為陰性模板，在其上澆鑄一定量PDMS，加熱固化，剝離后即得具有相應(yīng)陽模結(jié)構(gòu)的PDMS芯片。將此PDMS陽模經(jīng)空氣等離子體處理后，迅速在表面旋涂質(zhì)量百分濃度為0. Γ0. 5%的聚乙烯醇(PVA)水溶液，并于紅外燈下烘干，以此PDMS芯片為陽性模板，在其上澆鑄一定量PDMS， 固化后可輕松剝離，即可得到與刻蝕玻璃芯片通道一致的PDMS芯片。2.采用如圖2所示的方式制備狹縫及集成細胞捕獲芯片
步驟3.狹縫制作與芯片鍵合將制作好相應(yīng)通道的上下兩片PDMS芯片同時經(jīng)等離子體處理，迅速在其上滴加數(shù)滴去離子水，然后將上片蓋在下片上，此時由于水的存在，兩片 PDMS可相互順利滑動，將兩層上的微通道平行對準，使其形成整條或部分長度的狹縫，在顯微鏡下調(diào)整狹縫寬度使之不超過15 μ m(小于相應(yīng)細胞尺寸)，用濾紙吸去大部分多余水分，保持上下兩層芯片位置并置于紅外燈下烘干，約30min后即可鍵合穩(wěn)固而得到狹縫捕獲芯片。狹縫長度可根據(jù)對準管道部分進行調(diào)整，上片需預(yù)留上下兩層通道的出入口以進行進樣操作和壓力調(diào)整。步驟4.通道組合與狹縫調(diào)控可采用不同構(gòu)型的微通道進行組合形成不同長度的狹縫，用于調(diào)控捕獲細胞的數(shù)量?？刹捎弥本€通道組合形成較長狹縫，從而形成細胞的直線排列；也可采用點狀通道組合或直線與點狀通道組合形成多個捕獲狹縫，實現(xiàn)對少量細胞的捕獲。同時，由于可通過上下兩片PDMS的滑動靈活控制通道的對準位置，可采用合適的點狀通道組合，交叉對準形成微小狹縫，對單個細胞進行捕獲。實施例2.采用雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，對細胞的捕獲和釋放
為了表征該芯片對細胞的捕獲效果，我們采用不同的通道組合制作微狹縫，對懸浮 BGC-823細胞樣品進行了捕獲，結(jié)果如圖3所示。其步驟為
步驟1.在上層通道入口處注入細胞懸液，由于液體靜壓力的差別，細胞流向溶液向出口并向下層管道分流，受狹縫阻擋，細胞沿流動方向不斷在狹縫上排列聚集形成捕獲，多余細胞隨懸液從出口排出；保持壓力作用，還可對捕獲細胞進行清洗等操作。步驟2.將樣品溶液自入口吸出，在下層通道出入口注入緩沖溶液，使液體壓力反向，即使溶液反向流過狹縫，可釋放捕獲的細胞，并從上層通道出口排出，從而可重復(fù)對細胞進行捕獲和釋放。實施例3.采用雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，捕獲數(shù)個細胞或單個細胞
為了表征該芯片對少量細胞的捕獲性能，我們采用減小狹縫長度及采用交錯鍵合的方式對數(shù)個及單個細胞進行了捕獲，結(jié)果如圖4所示。
權(quán)利要求
1.一種雙層結(jié)構(gòu)的細胞捕獲芯片，其特征是它是基于微狹縫結(jié)構(gòu)的全聚二甲基硅氧烷微流控細胞捕獲芯片，它由上下兩片固化的聚二甲基硅氧烷薄片構(gòu)成，，在聚二甲基硅氧烷薄片上分別制作有不同尺寸及形狀的微型下凹通道，上、下兩片聚二甲基硅氧烷疊合時， 使上、下兩層通道沿邊緣相互平行交錯，形成10士5 μ m的單個或多個狹縫，該狹縫用于阻擋細胞形成對有限數(shù)量細胞的可控捕獲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，其特征是所述的通道狹縫通過通道對準鍵合的方法制得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，其特征是所述的通道狹縫長度及數(shù)量通過不同通道組合和對準方法進行調(diào)控。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，其特征是通過調(diào)整狹縫的長度和大小對捕獲細胞的數(shù)量進行控制，形成從單個細胞到幾十個細胞的有效捕獲。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，其特征是利用流體動力學(xué)原理對細胞進行捕獲，并在捕獲后通過出入口的壓力控制釋放細胞，從而可重復(fù)進行細胞的捕獲操作。
6.一種制作上述的雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片的方法，它包括下列步驟步驟1.玻璃通道制作玻璃芯片通道采用標準光刻和化學(xué)濕法刻蝕技術(shù)制備；采用商品化勻膠鉻版，根據(jù)通道設(shè)計圖案進行光刻，蝕刻深度為30-50 μ m ；步驟2.制作上、下兩層聚二甲基硅氧烷(PDMS)微通道薄片以上述玻璃芯片為陰性模板，在其上澆鑄一定量PDMS，加熱固化，剝離后即得具有相應(yīng)陽模結(jié)構(gòu)的PDMS芯片，將此 PDMS陽模經(jīng)空氣等離子體處理后，迅速在表面旋涂質(zhì)量百分濃度為0. Γ0. 5%的聚乙烯醇水溶液，并于紅外燈下烘干，以此PDMS芯片為陽性模板，在其上澆鑄聚二甲基硅氧烷，固化后可輕松剝離，即可得到與刻蝕玻璃芯片通道一致的PDMS芯片；步驟3.狹縫制作與芯片鍵合將制作好相應(yīng)通道的上、下兩片PDMS芯片同時經(jīng)等離子體處理，迅速在其上滴加數(shù)滴去離子水，然后將上片蓋在下片上，此時由于水的存在，兩片PDMS可相互順利滑動，將兩層上的微通道平行對準，使其形成整條或部分長度的狹縫， 在顯微鏡下調(diào)整狹縫寬度使之不超過15 μ m，用濾紙吸去大部分多余水分，保持上、下兩層芯片位置并置于紅外燈下烘干，約30min后即可鍵合穩(wěn)固而得到狹縫捕獲芯片，狹縫長度可根據(jù)對準管道部分進行調(diào)整，上片需預(yù)留上下兩層通道的出入口以進行進樣操作和壓力調(diào)整。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制作雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片的方法，所述的步驟3進行通道組合與狹縫調(diào)控采用不同構(gòu)型的微通道進行組合形成不同長度的狹縫，用于調(diào)控捕獲細胞的數(shù)量；采用直線通道組合形成較長狹縫，從而形成細胞的直線排列；也可采用點狀通道組合或直線與點狀通道組合形成多個捕獲狹縫，實現(xiàn)對少量細胞的捕獲；同時，由于通過上、下兩片PDMS的滑動靈活控制通道的對準位置，采用點狀通道組合，交叉對準形成微小狹縫，對單個細胞進行捕獲。
全文摘要
一種雙層結(jié)構(gòu)細胞捕獲芯片，它是基于微狹縫結(jié)構(gòu)的全PDMS微流控細胞捕獲芯片，它由上、下兩片固化的聚二甲基硅氧烷薄片構(gòu)成，在聚二甲基硅氧烷薄片中分別制作有不同尺寸及形狀的微型通道，上下兩層通道沿邊緣相互平行交錯，通道對準鍵合的方法形成10±5μm狹縫，狹縫長度及數(shù)量可通過不同通道組合和對準方法進行調(diào)控，從而可對捕獲細胞的數(shù)量進行控制。該芯片通過流體動力學(xué)原理，利用狹縫結(jié)構(gòu)阻擋細胞形成對有限數(shù)量細胞的捕獲，同時可通過調(diào)整流體壓力控制釋放細胞，實現(xiàn)對細胞的重復(fù)捕獲。該芯片采用常規(guī)的芯片制作方法，實現(xiàn)對單個及多個細胞的捕獲和釋放，同時可集成微電極對捕獲細胞進行實時監(jiān)測。本發(fā)明公開了其制作方法和過程。
文檔編號C12M1/00GK102174369SQ20111003110
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者勾洪磊, 徐靜娟, 陳洪淵 申請人:南京大學(xué)