專利名稱：全血INF-γ的特異性抗原蛋白、其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過基因工程方法制備的全血INF-Y的特異性抗原蛋白、其制備方法及用途，以及涉及編碼該蛋白的核苷酸序列、重組載體和重組子。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是主要經(jīng)呼吸道傳播的、嚴(yán)重危害我國和全世界的重要傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織，全世界有17-20億的結(jié)核桿菌感染者，每年至少200萬人死于本病(謝建平， 結(jié)核分枝桿菌功能基因組研究的方法學(xué)，微生物通報(bào).2001. 28 (5) 92-97)。因此，準(zhǔn)確篩檢感染者的方法在結(jié)核病的防治甚至最終的消滅中扮演極其重要的作用。現(xiàn)有的診斷技術(shù)對結(jié)核桿菌感染者的診斷非常難。近幾十年來，臨床上采用結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)來診斷結(jié)核桿菌感染者。但TST活性成份是純蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin，PPD)，是結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)上清液的粗提物，含有 200多種成分，與BCG接種和環(huán)境分枝桿菌感染存在交叉反應(yīng)。TST檢測結(jié)果可被現(xiàn)在臨床廣泛使用的疫苗-卡介苗免疫所干擾[P. Andersen, et al. Lancet356 (2000) 1099-1104.]。 從1921年及明卡介苗到現(xiàn)在為止，全山界已有35億人接種卡介苗。因此TST對感染者的診斷價(jià)值受到很大的影響，導(dǎo)致TST診斷的準(zhǔn)確性較低，因此我們無法根據(jù)其結(jié)果判斷是否真正存在結(jié)核分枝桿菌感染。對結(jié)核病病人的診斷技術(shù)中痰涂片抗酸染色或痰菌培養(yǎng)，培養(yǎng)困難，耗時(shí)較長；肺部X射線檢查肺部病理改變也僅在具有典型的臨床癥狀后才能診斷；其他血清學(xué)診斷方法和分子診斷方法缺乏特異性，假陽性率較高。有關(guān)研究人員指出，不同診斷性檢查方法的敏感性和特異性如下分支桿菌培養(yǎng)(分別為73%和100% ) ；PCR(分別為42%和100% )； 胸部X線(分別為67% 77%和66% 76%)；結(jié)核菌素試驗(yàn)(分別為94%和20% )；血清學(xué)(分別為33%和87% )。由此可見，現(xiàn)有的診斷性檢查方法的敏感性和特異性無法同時(shí)達(dá)到最優(yōu)。因此，必須盡快研究結(jié)核病和結(jié)核桿菌感染者的早期、快速、特異和敏感的診斷方法。結(jié)核分枝桿菌感染人體后，首先會被人體的免疫系統(tǒng)識別，激活機(jī)體的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，分泌產(chǎn)生IFN- γ，后者發(fā)揮抗結(jié)核感染作用。部分T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為免疫記憶細(xì)胞， 當(dāng)再次與結(jié)核桿菌相遇后，會再次分泌產(chǎn)生IFN-Y，發(fā)揮抗結(jié)核感染作用?？乖禺惖?IFN-Y產(chǎn)生量與機(jī)體是否感染或發(fā)病密切相關(guān)。因此，如果采用結(jié)核桿菌特異的抗原在體外刺激感染者和患者的T細(xì)胞，可誘導(dǎo)這些T細(xì)胞產(chǎn)生高水平的結(jié)核桿茼抗原特異的 IFN- γ，而非結(jié)核桿菌感染者或非結(jié)核病患者產(chǎn)生的IFN- γ的量與未用抗原刺激產(chǎn)生的量相近，從而實(shí)現(xiàn)診斷的目的。由此可見，尋找并發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌特異性抗原，對發(fā)展新一代的診斷試劑具有重要價(jià)值和意義。1996年，Stover等通過減數(shù)雜交的方法確定了 BCG在體外傳代過程中丟失的域，定義為缺失區(qū)(Region of Difference, RD)，RD區(qū)域存在于結(jié)核分枝桿菌中，而在 BCG和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌中缺失[程渝，李茂全.結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展.國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)和檢驗(yàn)學(xué)分冊.2002 ;23(6) :342-343.]。其中，RDl區(qū)域編碼的早期分抗原靶 6KD(early secreting antigen target 6KD，ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白 10KD(cultufiltrate protein 1OKD，CFP-10)是兩種小分子量分泌蛋白，它們是T細(xì)胞的最主要的抗原之一，可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。另外，MPB64蛋白是結(jié)核分枝桿菌在生長繁殖中分泌的24KDa分子量的蛋白質(zhì)，是一個(gè)有特殊作用的分泌蛋白，可導(dǎo)致強(qiáng)烈的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。MPB64蛋白主要存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群，非結(jié)核分枝桿菌極少數(shù)出現(xiàn)陽性，M. flavescens為弱陽性[樂軍，梁莉，李蘇輝，等.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)快速診斷結(jié)核分枝桿菌感染的臨床應(yīng)用價(jià)值[J].中華檢驗(yàn) 醫(yī)學(xué)雜志，2006，29 (11) =1005-1008.]。然而， 由于這些結(jié)核病特異診斷蛋白質(zhì)的分子量較小，從結(jié)核桿菌的培養(yǎng)物中直接分離純化較為困難，而且生產(chǎn)成本很高；盡管可采用肽合成的方法來進(jìn)行生產(chǎn)，但肽合成的成本非常高， 由此建立的臨床應(yīng)用試劑盒的成本大大增加。另外，通過基因工程技術(shù)單獨(dú)獲得上述抗原的表位，由于體外和體內(nèi)的差異，表達(dá)的產(chǎn)物如國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的，也容易因?yàn)樾纬砂荻サ鞍踪|(zhì)的活性。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有診斷方法的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種敏感性和特異性高的結(jié)核病診斷抗原蛋白，該抗原蛋白可實(shí)現(xiàn)對結(jié)核病病人或早期感染者的快速、特異的診斷， 在阻斷結(jié)核病的傳播和流行，以及對結(jié)核病的控制具有重大意義。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究，最終獲得如下技術(shù)方案一種全血INF-Y的特異性抗原蛋白，它為以下任一一種連接有生物標(biāo)簽的融合蛋白ESAT-6-連接肽-CFP-10、CFP-10-連接肽-ESAT-6、ESAT_6-連接肽 _MPB64、MPB64_ 連接肽-ESAT-6、CFP-10-連接肽 _MPB64、MPB64_ 連接肽-CFP-10.ESAT-6-連接肽-CFP-10-連接肽-MPB64、ESAT-6-連接肽-MPB64-連接肽-CFP-10, CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-MPB64、CFP-10-連接肽-MPB64-連接肽-ESAT-6、MPB64-連接肽-CFP-10-連接肽-ESAT-6和MPB64-連接肽-ESAT-6-連接肽-CFP-10，其中所述的連接肽為不影響 ESAT-6、CFP-10和MPB64免疫原性的短肽。為了進(jìn)一步方便重組蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)，在上述串聯(lián)蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)加入一些純化用生物標(biāo)簽，如組氨酸標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、Trx標(biāo)簽等常用生物標(biāo)簽，這些標(biāo)簽可于蛋白質(zhì)的 N端及C端，標(biāo)簽的使用可方便重組蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)，可大幅降低試劑盒成本，降低臨床檢測費(fèi)用。上述的全血INF-Y的特異性抗原蛋白，其中所述的連接肽的氨基酸序列為SEQ ID :No. 3。上述的全血INF- γ的特異性抗原蛋白，優(yōu)選氨基酸序列為SEQ ID :No. 1的抗原蛋白。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供了編碼全血INF-Y的特異性抗原蛋白的核苷酸序列。尤其提供了編碼氨基酸序列為SEQ ID :No. 1的核苷酸序列SEQ ID NO :2。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供了含有上述多核苷酸的表達(dá)載體，其中載體為 pET28b。
本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供了含有上述表達(dá)載體的微生物，其中所述微生物為大腸桿菌BL21。本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供了氨基酸序列為SEQ ID :No. 1的抗原蛋白的制備方法。本發(fā)明的第五個(gè)目的是通過一下技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)的氨基酸序列為SEQ ID :No. 1的抗原蛋白的制備方法，包括如下步驟SEQ ID NO 2 序列保存于DH5 α中，用NcoI、XhoI內(nèi)切酶分別酶切DH5 α和pET28b表達(dá)載體，回收SEQ ID NO 2序列片斷和pET28b表達(dá)載體，在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21 (DE3)中，轉(zhuǎn)化子在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入終濃度為50 μ g/ml的氨芐青霉素培養(yǎng)， 加入終濃度為0. 5mM的IPTG，37°C，200rpm，誘導(dǎo)表達(dá)8小時(shí)，將所表達(dá)重組蛋白收集、純化即得。本發(fā)明提供的含有上述抗原蛋白的組合物能夠快速、特異性的診斷結(jié)核病。本發(fā)明進(jìn)一步研究了全血INF-Y釋放分析方法，最佳刺激時(shí)間為37°C，10小時(shí)-30小時(shí)，更優(yōu)的刺激時(shí)間為16小時(shí)-24小時(shí)。本發(fā)明提供的全血INF-Y的特異性抗原蛋白具有以下進(jìn)步性；(1)與傳統(tǒng)結(jié)核桿菌診斷相比，利用本發(fā)明提供的全血INF-Y的特異性抗原蛋白診斷需時(shí)短，診斷快速。傳統(tǒng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)診斷需時(shí)間1-2月，TST檢測需要3天，本發(fā)明全部檢測時(shí)間在1-2天內(nèi)能完成。(2)對結(jié)核桿菌能進(jìn)行早期診斷。由于結(jié)核桿菌一旦感染人體，首先就被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所識別，激活體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)生時(shí)間在感染后1-2個(gè)月，因此，利用本發(fā)明提供的全血INF-γ的特異性抗原蛋白的細(xì)胞免疫學(xué)檢測方法即可快速做出診斷。X光片診斷只有在感染名肺部出現(xiàn)明顯的病理改變后才可做出診斷，這通常需要很長的時(shí)間。抗原抗體檢測也只有在疾病癥狀處于活動期的情況下檢測，但環(huán)境中分枝桿菌廣泛存在，其與結(jié)核桿菌的共同抗原，可干擾實(shí)驗(yàn)的診斷結(jié)果。(3)敏感性強(qiáng)、特異性高。由于采用的是結(jié)核桿菌特異性的抗原，只與結(jié)核桿菌感染人體后產(chǎn)的免疫記憶T細(xì)胞起反應(yīng)，因而產(chǎn)生的干擾素是結(jié)核桿菌抗原特異性的 IFN-Y。采用本發(fā)明的抗原進(jìn)行刺激，結(jié)核病抗原特異的全血IFN-Y診斷的敏感性為 100 %，特異性高達(dá)95.7%，具有良好的診斷符合率。(4)方便大規(guī)模生產(chǎn)，大幅降低患者診斷費(fèi)用。因此，本發(fā)明提供的結(jié)核病特異抗原對結(jié)核病的早期診斷有重要意義，因而對結(jié)核病的控制和消滅具有積極的意義。


圖1 含有ESAT6-CFP10融合蛋白的表達(dá)載體pET28b結(jié)構(gòu)示意2 :ESAT6-CFP10融合蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)和純化SDS-PAGE電泳圖1、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) ll、17、26、34、43、55、72、95、130、170Da2、誘導(dǎo)前細(xì)菌3、誘導(dǎo)后細(xì)菌4、誘導(dǎo)超聲后上清
5、誘導(dǎo)超聲后沉淀圖3 :ESAT6-CFP10融合蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)和純化WB電泳圖1、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) ll、17、26、34、43、55、72、95、130、170Da2、誘導(dǎo)前細(xì)菌3、誘導(dǎo)后細(xì)菌 4、誘導(dǎo)超聲后上清5、誘導(dǎo)超聲后沉淀
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步作描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例1ESAT6-CFP10融合蛋白的目的基因的合成及表達(dá)載體的構(gòu)建人工合成的ESAT6-CFP10的DNA序列保存于DH5 α中，再用NcoI、XhoI內(nèi)切酶分別酶切DH5 α和pET28b表達(dá)載體，回收目的片斷和表達(dá)載體，在T4DNA連接酶作用下4°C連接16小時(shí)，用熱休克法轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)中，37°C培養(yǎng)過夜。挑取在平板生長較好的，具有典型大腸桿菌特征的菌落在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入終濃度為30 μ g/ml的卡那霉素，370C，220rpm,培養(yǎng)3小時(shí)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序鑒定，酶圖及測序圖譜和預(yù)期相符合。載體構(gòu)建圖見圖1。實(shí)施例2重組蛋白ESAT6-CFP10串聯(lián)表達(dá)在大腸桿菌中高效表達(dá)挑取在平板生長較好的，具有典型大腸桿菌特征的菌落在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 加入終濃度為50 μ g/ml的氨芐青霉素培養(yǎng)6小時(shí)，加入終濃度為0. 5mM的IPTG，37°C， 200rpm，誘導(dǎo)表達(dá)8小時(shí)，收集菌體，SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果見圖2。實(shí)施例3重組蛋白ESAT6-CFP10串聯(lián)的純化蛋白質(zhì)純化按M-NTA標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，簡要步驟如下，取50ml菌液離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，用超聲波將大腸破細(xì)胞，離心取上清，上清于Tris (50mM，pH8. 0)緩沖液中透析過夜，離心取上清，直接上樣于已用Tris(50mM，pH8. 0)緩沖液平衡的Ni-NTA樹脂中，用Tris (50mM, pH8. 0)緩沖液洗脫平衡后，再用O-IM的咪唑梯度洗脫，收集洗脫峰，將洗脫峰合并，于Tris (50mM，pH8. 0)緩沖液中透析過夜，透析液于真空冷凍干燥機(jī)中凍干即為 ESAT6-CFP10凍干粉，-20—40°C保存?zhèn)溆?。純化的重組ESAT6-CFP10的SDS-PAGE鑒定圖 2和3，重組ESAT6-CFP10的分子量為21. 8Kda,純度高達(dá)95%以上。經(jīng)BCA檢測，回收效率達(dá)到 200mg/L。實(shí)施例4全血INF γ檢測試劑盒-酶聯(lián)免疫法本發(fā)明按標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體篩選方法篩選抗INF Y的單克隆抗體，獲得了兩株針對INFy的不同抗原簇的單克隆抗體，將其中一個(gè)抗體按一定濃度包被酶標(biāo)板，4°C過夜， 再37°C 1-2小時(shí)封閉后，將酶標(biāo)板冷凍干燥后，即為商業(yè)用酶標(biāo)板，另外一株抗體按照標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記生物素。將干擾素Y標(biāo)準(zhǔn)(1 μ g/ml)按要求稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線對照。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，取合適的酶標(biāo)板條，不用的酶標(biāo)板或放入酶標(biāo)板袋中，40C _8°C繼續(xù)保存，在對應(yīng)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)、陽性對照(干擾素Y標(biāo)準(zhǔn)lng/ml)、空白對照及待檢樣品(新鮮血液培養(yǎng)后的上清)，每孔50 μ 1，再加入生物素標(biāo)記抗體，每孔50 μ 1，混合均勻，貼上封口膠，于37°C孵育 30分鐘。將20倍濃縮洗滌液用純化水或雙蒸水20倍稀釋成洗滌工作液。棄去各孔中液體，每孔加入洗滌工作液250 μ 1，靜置數(shù)秒后棄去，重復(fù)5次，拍干。每孔加入親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶ΙΟΟμΙ，貼上封口膠，置37°C溫育30分鐘。重復(fù)洗板步驟。每孔加入底物液100 μ 1，混勻，置37°C避光溫育15分鐘。顯色完畢后，每孔加入終止液50 μ 1，振蕩混勻， 立即置酶標(biāo)儀波長450nm(以空白孔調(diào)零)或雙波長450nm/630nm下測定OD值。靈敏度為 lpg/ml0實(shí)施例5全血INF γ檢測試劑盒-化學(xué)發(fā)光法本發(fā)明按標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體篩選方法篩選抗INF Y的單克隆抗體，獲得了兩株針對INFy的不同抗原簇的單克隆抗體，將其中一個(gè)抗體按一定濃度包被酶標(biāo)板，4°C過夜， 再37°C 1-2小時(shí)封閉后，將酶標(biāo)板冷凍干燥后，即為商業(yè)用酶標(biāo)板，另外一株抗體按照標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記生物素。將干擾素Y標(biāo)準(zhǔn)(lPg/ml)按要求稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線對照。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，取合適的酶標(biāo)板條，不用的酶標(biāo)板或放入酶標(biāo)板袋中，40C _8°C繼續(xù)保存，在對應(yīng)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)、陽性對照(干擾素Y標(biāo)準(zhǔn)lng/ml)、空白對照及待檢樣品(新鮮血液培養(yǎng)后的上清)，每孔50 μ 1，再加入生物素標(biāo)記抗體，每孔50 μ 1，混合均勻，貼上封口膠，于37°C孵育 30分鐘。將20倍濃縮洗滌液用純化水或雙蒸水20倍稀釋成洗滌工作液。棄去各孔中液體，每孔加入洗滌工作液250μ 1，靜置數(shù)秒后棄去，重復(fù)5次，拍干。每孔加入親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶ΙΟΟμΙ，貼上封口膠，置37°C溫育30分鐘。重復(fù)洗板步驟。每孔加入化學(xué)發(fā)光底物液50μ 1，混勻，化學(xué)發(fā)光檢測儀里面穩(wěn)定2min，測425nm光強(qiáng)度，檢測時(shí)間Is。靈敏度為 0. lpg/ml。實(shí)施例6全血INF γ檢測試劑盒-放射免疫法本發(fā)明按標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體篩選方法篩選抗INF γ的單克隆抗體，獲得了兩株針對 INFy的不同抗原簇的單克隆抗體，將其中一個(gè)抗體按一定濃度包被酶標(biāo)板，4°C過夜，再 370C 1-2小時(shí)封閉后，將酶標(biāo)板冷凍干燥后，即為商業(yè)用酶標(biāo)板，另外一株抗體按照標(biāo)準(zhǔn)方法標(biāo)記I125。將干擾素Y標(biāo)準(zhǔn)(lPg/ml)按要求稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線對照。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，取合適的酶標(biāo)板條，不用的酶標(biāo)板或放入酶標(biāo)板袋中，4°C _8°C繼續(xù)保存，在對應(yīng)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)、陽性對照(干擾素Y標(biāo)準(zhǔn)lng/ml)、空白對照及待檢樣品(新鮮血液培養(yǎng)后的上清)， 每孔50μ 1，再加入I125標(biāo)記抗體，每孔50μ 1，混合均勻，貼上封口膠，于適當(dāng)時(shí)間孵育后。 用、計(jì)數(shù)器檢測數(shù)據(jù)。靈敏度為0. lpg/ml。實(shí)施例7試劑盒靈敏度和特異性檢測采集50例確診為結(jié)核病患者及20例健康未結(jié)核感染者的新鮮肝素抗凝靜脈血 3ml，各取Iml全血于無菌培養(yǎng)板中培養(yǎng)，1孔中加入重組ESAT6-CFP10 (濃度為1_50 μ g/ml 進(jìn)行INF γ刺激，另一孔對照，37°C孵育20小時(shí)，離心收集上清，上清可于4°C條件保存數(shù)周，-20°C可保存一年，將上取100μ1加入本公司開發(fā)的人INF γ檢測試劑盒(酶標(biāo)法) 中進(jìn)行檢測，數(shù)據(jù)顯示診斷結(jié)核感染者的敏感性為100%，特異性高達(dá)95.7%，同臨床診斷結(jié)果比較，本試劑盒顯示良好的診斷一致性。因此，本發(fā)明提出的結(jié)核病早期診斷的方法， 必將在結(jié)核病和結(jié)核桿菌感染者的診斷應(yīng)用上具有重要意義，具有良好的社會效益。序列表SEQUENCE LISTING
7
MHHHHHHTEQQffNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQ40
SLTKLAAAffGGSGSEAYQGVQQKffDATATELNNALQNLAR80
TISEAGQAMASTEGNVTGMFANVAMAEMKTDAATLAQEAG120
NFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQffRGAAGTAAQAAVV160
RFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSS200
QMGF204
<110>武漢海吉力生物科技有限公司
<120>全血INF-Y的特異性抗原蛋白、其制備方法及用途
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<210>2 <211>615 <212>DNA <213>人工序列 <400>2atgcatcaccatcatcatca tacagagcagcaatggaattttgccggcatagaggctgcc60
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C￡l￡lC￡l￡l￡l￡l￡ltgggacgccac ggcgactgagcttaataacgctctccaaaatctagcacga240
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WDATATELNN ALQNLARTIS EAGQAMASTE GNVTGMFANV AMAE
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4權(quán)利要求
1.全血INF-γ的特異性抗原蛋白，其特征在于它為以下任一一種連接有生物標(biāo)簽的融合蛋白ESAT-6-連接肽-CFP-10、CFP-IO-連接肽-ESAT-6、ESAT-6-連接肽-MPB64、 MPB64-連接肽-ESAT-6、CFP-10-連接肽-MPB64、MPB64-連接肽-CFP-10、ESAT-6-連接肽-CFP-10-連接肽-MPB64、ESAT-6-連接肽-MPB64-連接肽-CFP-10, CFP-10-連接肽-ESAT-6-連接肽-MPB64、CFP-10-連接肽-MPB64-連接肽-ESAT-6、MPB64-連接肽-CFP-10-連接肽-ESAT-6和MPB64-連接肽-ESAT-6-連接肽-CFP-10，其中所述的連接肽為不影響ESAT-6、CFP-10和MPB64免疫原性的短肽。
2.如權(quán)利要求1所述的全血INF-γ的特異性抗原蛋白，其特征在于所述生物標(biāo)簽為組氨酸標(biāo)簽、GST標(biāo)簽或Trx標(biāo)簽。
3.如權(quán)利要求1所述的全血INF-γ的特異性抗原蛋白，其特征在于所述的連接肽的氨基酸序列為SEQ ID :No. 3。
4.如權(quán)利要求1所述的全血INF-γ的特異性抗原蛋白，其特征在于氨基酸序列為 SEQ ID :No. 1。
5.編碼權(quán)利要求1所述的全血INF-Y的特異性抗原蛋白的核苷酸序列。
6.編碼權(quán)利要求4所述的全血INF-Y的特異性抗原蛋白的核苷酸序列SEQIDNO :2。
7.包含權(quán)利要求6所述的核苷酸序列的載體，其中載體為pET28b。
8.包含權(quán)利要求7所述的載體的微生物，其中微生物為大腸桿菌BL21。
9.制備權(quán)利要求4所述的特異性抗原蛋白的方法，包括如下步驟SEQID N0:2序列保存于DH5a中，用NcoI、XhoI內(nèi)切酶分別酶切DH5a和pET28b表達(dá)載體，回收SEQ ID NO 2 序列片斷和pET28b表達(dá)載體，在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) 中，轉(zhuǎn)化子在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入終濃度為50yg/ml的氨芐青霉素培養(yǎng)，加入終濃度為0. 5mM的IPTG，37°C，200rpm,誘導(dǎo)表達(dá)8小時(shí)，將所表達(dá)重組蛋白收集、純化即得。
10.權(quán)利要求1-4任一所述的抗原蛋白在制備診斷結(jié)合病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過基因工程方法制備的全血INF-γ的特異性抗原蛋白、其制備方法及用途，以及涉及編碼該蛋白的核苷酸序列、重組載體和重組子。本發(fā)明的抗原蛋白為通過連接肽將ESAT-6、CFP-10和MPB64以任意順序連接后獲得的融合蛋白，其中所述的連接肽為不影響ESAT-6、CFP-10和MPB64免疫原性的短肽。本發(fā)明提供的結(jié)核病特異抗原在診斷結(jié)核病時(shí)診斷需時(shí)短、快速，且敏感性強(qiáng)、特異性高，對結(jié)核病的早期診斷有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK102174114SQ201110031079
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者喻德華, 趙平峰, 陳銀芳, 黃 俊 申請人:武漢海吉力生物科技有限公司