專利名稱：一種可檢測不同株系馬鈴薯病毒的專用引物及其設(shè)計方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種病毒檢測的專用引物及其設(shè)計方法領(lǐng)域，尤其涉及一種可檢測不 同株系馬鈴薯病毒的專用引物及其設(shè)計方法。
背景技術(shù)：
酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核 酸擴(kuò)增技術(shù)。PCR反應(yīng)類似于DNA的天然復(fù)制過程，由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟 構(gòu)成，即在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保 留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。通過PCR，能在一個試管內(nèi) 將所要研究的目的基因或某一 DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，具有特異、敏 感、產(chǎn)率高、快速簡便、重復(fù)性好、易于自動化等突出優(yōu)點(diǎn)，PCR已廣泛應(yīng)用于生物檢測和疾 病診斷等領(lǐng)域。多重PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，原理與常規(guī)PCR基本相同，只是在一個 PCR反應(yīng)體系中加入兩對以上引物，針對多個模板或同一個模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個目的 片段的PCR技術(shù)。在上述兩種PCR反應(yīng)中，引物設(shè)計的好壞直接影響檢測的特異性和靈敏度。近幾年，PCR技術(shù)廣泛用于類病毒、病毒、真菌、線蟲等的檢測方法，它可將極微量 的靶DNA特異的擴(kuò)增上萬倍，從而能檢測到單分子DNA或?qū)γ?0萬個細(xì)胞中僅1個靶分子 的樣品。利用PCR可以檢測出植物組織中含量極低的病毒。此類技術(shù)不僅可以在基因水平 上為植物病毒的檢測提供更靈敏的手段，而且可與核酸序列分析結(jié)合，檢測基因序列的分 子變異，分析病毒株系間的序列同源性，比較親緣關(guān)系，為病毒的鑒定提供可靠依據(jù)。由于 馬鈴薯病毒基因是單鏈正義RNA，所以我們需用RT-PCR的方法擴(kuò)增病毒目的片段。反轉(zhuǎn)錄 酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-polymerase ChainReaction，RT-PCR)的基本原理是以 所需檢測的病毒RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。近年來， RT-PCR在植物病毒檢測上顯示出強(qiáng)大的優(yōu)勢，運(yùn)用這種方法已成功檢測了多種病毒。典型的RT-PCR包括樣品RNA的制備、引物的設(shè)計和合成、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、以 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。RT-PCR的基本步驟是首先提取病毒RNAjg 據(jù)病毒基因序列設(shè)計合成引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。取出擴(kuò)增產(chǎn)物，利 用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測病毒RNA的成功提取是運(yùn)用RT-PCR技術(shù)的前提。同時，RT-PCR 還受到提取物中多酚和多糖的抑制。植物組織中的酚類物質(zhì)被氧化后會和RNA不可逆地結(jié) 合，導(dǎo)致RNA的活性喪失，從而抑制RT-PCR反應(yīng)。最新研究證實在RNA提取緩沖液中加亞 硫酸鈉可改進(jìn)核酸提取質(zhì)量，而且在提取液中不需使用蛋白酶K，從而降低了費(fèi)用。研究表 明，核酸樣品中含有氯原酸會抑制反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。影響PT-PCR的因素還包括反轉(zhuǎn)錄 中dNIPs的濃度，Taq DNA聚合酶的量，緩沖液中Mg2+的濃度，退火溫度，反應(yīng)循環(huán)次數(shù)等。合理的引物設(shè)計是成功應(yīng)用RT-PCR技術(shù)的關(guān)鍵。引物的特異性對反應(yīng)有很大的 影響，如果引物特異性不高，可能在擴(kuò)增的過程中產(chǎn)生非靶標(biāo)條帶，影響檢測結(jié)果的判定。如對某種病毒進(jìn)行檢測，所選病毒基因組中的靶序列應(yīng)為該種病毒的特異保守序列；如對 同種病毒的不同株系進(jìn)行檢測，則應(yīng)選擇該株系的特異序列區(qū)進(jìn)行引物設(shè)計。對于馬鈴薯病毒的檢測，更好的專用引物和檢測條件是該領(lǐng)域研究的重要技術(shù)問 題，而好的引物與引物設(shè)計方法有著密切的關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種可檢測不同株系馬鈴薯病毒的專用引物及其設(shè)計方法。本發(fā)明 要解決的問題之一是提供一種可檢測不同株系馬鈴薯病毒的專用引物，本發(fā)明要解決的另 一個問題是提供一種用上述引物檢測馬鈴薯病毒的方法，本發(fā)明要解決的第三個問題是提 供一種設(shè)計專用引物的方法。一種可檢測不同株系馬鈴薯病毒的專用引物，包括如下引物中的至少一對弓丨物對I序列表的序列1和序列2所示核苷酸序列組成的引物對；弓丨物對II序列表的序列3和序列4所示核苷酸序列組成的引物對；引物對III 序列表的序列5和序列6所示核苷酸序列組成的引物對；弓丨物對IV序列表的序列7和序列8所示核苷酸序列組成的引物對；弓丨物對V序列表的序列9和序列10所示核苷酸序列組成的引物對；引物對VI 序列表的序列11和序列12所示核苷酸序列組成的引物對；所述檢測馬鈴薯病毒是馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯卷葉 病毒、馬鈴薯M病毒或番茄斑萎病毒病。所述專用引物由引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、引物對V和引物對VI組成。另一引物組合方式是專用引物由引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、引物 對V或引物對VI組成。上述可檢測不同株系馬鈴薯病毒專用引物的檢測方法A、病毒總RNA的提取提取馬鈴薯病毒的總RNA。B、RT-PCR 應(yīng)用專用引物對病毒總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)備cDNA模板，應(yīng)用專用引物 對cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得擴(kuò)增產(chǎn)物。C、對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲病毒基因擴(kuò)增條帶，根據(jù)擴(kuò)增片 段大小判斷病毒種類。上述PCR 的反應(yīng)參數(shù)是 94°C 3min，94°C變性 30s，59°C退火 30s，72°C延伸 30s，30 個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢 測。上述可檢測不同株系馬鈴薯病毒專用引物的設(shè)計方法，包括以下方法或步驟a.通過NCBI (美國國立生物信息中心)的GENBANK數(shù)據(jù)庫檢索所有已報道、已發(fā) 現(xiàn)、已提交數(shù)據(jù)庫的上述任一病毒序列；b.將同一病毒序列下載后，使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析，篩選出不同株系的同 一病毒的病毒序列；c.通過DNAMAN軟件將不同株系的同一病毒序列進(jìn)行比對，尋找其保守區(qū)域；d.使用PRIMER5，OLIGO引物設(shè)計軟件在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計引物；
4
e.將設(shè)計好后的備選引物提交到NCBI的BLAST系統(tǒng)中進(jìn)行電子PCR篩選，選擇相 似性為100%，能搜索出最多不同株系同一病毒病毒序列的引物作為標(biāo)準(zhǔn)引物。檢測馬鈴薯Y病毒(PVY)的引物序列是擴(kuò)增片段大小550bpSEQ ID NO. 1 5-GAGCAACTCAATCACAGTTTGATAC-3SEQ ID NO. 2 5-TGTTCTTGACTCCAAGTAGAGTATG-3檢測馬鈴薯S病毒(PVS)的引物序列是擴(kuò)增片段大小SEQ ID NO. 3 5-TTCCAGAGGACGCCTTTGCAATC-3SEQ ID NO. 4 5-GTCTAACTGGCATCAGGGCACAATA-3檢測馬鈴薯A病毒(PVA)的引物序列是擴(kuò)增片段大小300bpSEQ ID NO. 5 5-CGCTCGCAAATGGGAGTGTT-3SEQ ID NO. 6 5-GCTCACTATAGGGGATCCAC-3檢測馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)的引物序列是擴(kuò)增片段大小222bpSEQ ID NO. 7 5-AGGCGCGCTAACAGAGTTCA-3SEQ ID NO. 8 5-CTTGAATGCCGGACAGTCTG-3檢測馬鈴薯M病毒(PVM)的引物序列是擴(kuò)增片段大小630bpSEQ ID NO. 9 5-CGCATACAATATCTGGACTTACAC-3SEQ ID NO. 10 5-CTACTCCAGTAATGCAACTCATC-3檢測番茄斑萎病毒(TSWV)的引物序列是擴(kuò)增片段大小747bpSEQ ID NO. 11 5-GGCAAAGTGAATGTTCTATCTCCTAA-3SEQ ID NO. 12 5-TTCTCCCCTGGCAAAGTCTATC-3本發(fā)明的有益性本發(fā)明提供檢測馬鈴薯病毒的專用引物，本發(fā)明提供了應(yīng)用專 用引物檢測馬鈴薯病毒的RC-PCR最佳檢測方法和檢測條件，基于RC-PCR檢測其特異性強(qiáng)、 靈敏度高、檢測速度快、操作簡便、樣品預(yù)處理簡單、重復(fù)性好、易于分析；本發(fā)明還提供了 設(shè)計所述專用引物的方法，通過該方法篩選出的專用引物與馬鈴薯病毒相似性達(dá)100%可 檢測已報道或發(fā)現(xiàn)的不同株系馬鈴薯病毒；在馬鈴薯病毒檢測中具有廣泛的應(yīng)用價值。


下面結(jié)合具體實施例和

對本發(fā)明進(jìn)一步說明。圖1是PVY引物篩選結(jié)果圖；圖2是PVS引物篩選結(jié)果圖；圖3是PVA引物篩選結(jié)果圖；圖4是PLRV引物篩選結(jié)果圖；圖5是PVM引物篩選結(jié)果圖；圖6是TSWV引物篩選結(jié)果圖；圖7是下游引物濃度比和dNTP濃度對多重RT-PCR同時擴(kuò)增PVY、PVA和PLRV的 影響電泳圖；圖8是Mg2+濃度對三重RT-PCR同時擴(kuò)增PVY、PVA和PLRV三種病毒的影響電泳 圖；圖9是下游引物濃度比對多重RT-PCR同時擴(kuò)增PVM、PVS和TSWV的影響電泳5
圖10是Mg2+濃度對TSWV、PVM和PVS的三重RT-PCR擴(kuò)增的影響電泳圖。
具體實施例以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為常 規(guī)生化試劑商店購買得到的，專用引物由英俊生物技術(shù)公司合成。實施例1專用引物的設(shè)計。以 PVM 為例1.通過 NCBI 的 GENBANK 數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)檢索所有已報 道、已發(fā)現(xiàn)、已提交數(shù)據(jù)庫的PVM序列；2.將盡可能多的PVM序列下載后，使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析，篩選出不同株 系的PVM病毒序列；3.通過DNAMAN軟件將不同株系的PVM病毒序列進(jìn)行比對，尋找其保守區(qū)域(即所 有株系完全相同，沒有變異的一段DNA序列)；4.然后使用PRIMER5，OLIGO等引物設(shè)計軟件在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計篩選引物；5.將設(shè)計好后的備選引物提交到NCBI的BLAST系統(tǒng)中進(jìn)行電子PCR篩 選(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer_blast/index.cgi ？ LINK_L0C = BlastHome)，選擇相似性為100%，能搜索出最多不同株系PVM病毒序列的引物作為標(biāo)準(zhǔn)引 物。同樣方法，通過NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/，美國國立生物信息中心) 檢索已注冊的PVM、PVS、PVY、PVA、PLRV和TSWV六種病毒所有序列后(9個PVA同源序列、 5個PVM同源序列、7個PVS同源序列、30個PVY同源序列、28個TSWV同源序列、^fPLRV 同源序列)，使用DNAMAN軟件確定各個病毒的保守區(qū)域，最后通過0LIG0、PRIMER5等引物 設(shè)計軟件針對該病毒的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物。通過軟件和相關(guān)網(wǎng)站工具對設(shè)計好的多對引物進(jìn)行特異性、高效特征篩選，在比 胃工胃(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)白勺“nucleotide blast'中進(jìn)行同源性檢索，棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物。通過比對，篩選出與六種病毒PVM、PVS、PVY、PVA、PLRV和TSWV相似性達(dá)100%的 引物序列。比較結(jié)果見圖1至圖6。六種病毒主要引物設(shè)計結(jié)果見序列表。實施例2單重RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法。RT-PCR檢測步驟是現(xiàn)有常規(guī)步驟，下面是相關(guān)檢測條件。1、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):20μ 1體系中，RNA 2. 5 μ 1，dNTP 0. 5mM, RNA抑制劑5U，下游引物 0. 5 μ 1，MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶 50U。RT 反應(yīng)條件為42°C 50min，94°C 5min，4°C，保存。2、PCR 反應(yīng)25μ 體系中，cDNA 4 μ 1, dNTP 0. 2mM，Mg2+L 5mM，上下游引物各 0. 4μΜ，Taq 酶 1U。
PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min，94°C變性30s ；59°C退火30s，72°C延伸30s，共 30個循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C，保存。實施例3雙重RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法。RT-PCR檢測步驟是現(xiàn)有常規(guī)步驟，下面是相關(guān)檢測條件。1、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)20μ 1 體系中，RNA 2. 5 μ 1, IOmM dNTPs 2 μ 1，RNA 抑制劑 10U， 5 XMMLV buffer 4 μ 1，20pM 病毒下游引物各 0. 5 μ 1，MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶 IOOU0RT 反應(yīng)條件為42°C 30min,94°C 5min，4°C，保存。2、PCR 反應(yīng)25μ1 體系中，cDNA 4 μ 1，IOmM dNTP 0. 5 μ 1, 10XPCR buffer2. 5 μ l,25mM Mgcl2 2 μ 1，20ρΜ 病毒上下游引物各 1 μ 1，Taq DNA 聚合酶 1. 5U。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min，94°C變性 30s ；59°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 30個循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C，保存。實施例4三重RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法。RT-PCR檢測步驟是現(xiàn)有常規(guī)步驟，下面是相關(guān)檢測條件。1、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)20μ 1 體系中，RNA 2. 5 μ 1, IOmM dNTPs 2 μ 1，RNA 抑制劑 10U， 5 X MMLV buffer 4 μ 1，三種病毒上下游引物各0. 5 1 μ 1，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶200U。RT 反應(yīng)條件為42°C 30min,94°C 5min，4°C，保存。2、PCR 反應(yīng)25μ1 體系中，cDNA 4 μ 1，IOmM dNTP 0. 5 μ 1, 10XPCR buffer2. 5μ l,25mM Mgcl2 2· 5 μ 1，三種病毒上下游引物各0· 5 1 μ 1，Taq DNA聚合酶 2. 5U0PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min，94°C變性 30s ；59°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 30個循環(huán)；最后72°C延伸10min，4°C，保存。實施例5結(jié)合圖7和圖8。三重RT-PCR即一個反應(yīng)中同時檢測3種馬鈴薯病毒，本試驗即同步檢測PVY、PVA、 PLRV。與實施例4三重RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法相同。本試驗設(shè)計的6對不同下游引物濃度比對同時擴(kuò)增PVY、PVA和PLRV3種病毒沒 有明顯的影響，如圖 7(1-6 泳道所示)。dNTP 濃度 1-6 :lmmol/L,8-13 1. 5mmol/L，15-20 2mmol/L ；下游引物濃度 PVY PVA PLRV 比依次為 0. 5 0. 5 0. 5,0. 7 0. 7 0. 7， 1.0 1.0 1.0,0.5 0. 7 1.0,0.7 0.5 1.0,1.0 0.7 0. 5 ;3 種病毒下游引 物不同的6對濃度比均能同時擴(kuò)增出PVA、PVY和PLRV的靶標(biāo)條帶。反體轉(zhuǎn)錄系體中dNTP濃度為lmmol/L、1. 5mmol/L, 2mmol/L時，對三重RT-PCR同 時檢測PVA、PVY和PLRV的影響如圖7所示，當(dāng)dNTP濃度為lmmol/L時能擴(kuò)增出3種病毒 的靶標(biāo)條帶，且靶帶清晰無拖尾和無非特異性條帶(1-6泳道)；當(dāng)dNTP濃度為1. 5mmol/L 時，只能同時擴(kuò)增出PVY和PLRV的靶標(biāo)條帶(8-13泳道)；當(dāng)dNTP濃度為2mmol/L時，3種 病毒的靶標(biāo)條帶均不能擴(kuò)增出來(15-20泳道)。PCR 體系中 Mg2+ 濃度為 2. 5mmol/L, 3. 0mmol/L、3. 5mmol/L 時，對三重 RT-PCR 同時 檢測PVA,PVY和PLRV的影響如圖8所示，1,2泳道Mg2+濃度為3. 5mmol/L ；4，5泳道Mg2+濃度為 3mmol/L ；6，7 泳道 Mg2+ 濃度為 2. 5mmol/L。當(dāng)Mg2+濃度為2. 5mmol/L時，無法進(jìn)行三重擴(kuò)增，只能擴(kuò)增出PLRV的靶標(biāo)條帶(6， 7泳道)；當(dāng)Mg2+濃度增至3. Ommol/L,同樣無法進(jìn)行3種病毒的同步擴(kuò)增，而只能擴(kuò)增出 PVY和PLRV兩種病毒的靶標(biāo)條帶(4，5泳道)；當(dāng)Mg2+濃度增為3. 5mmol/L,才能同時擴(kuò)增 出PVA、PVY、PLRV3種病毒的靶標(biāo)條帶(1,2泳道)。試驗結(jié)果表明，三重RT-PCR同時檢測PVY、PVA和PLRV的體系，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中需加 入 dNTP 1. Ommol/L, RNA 抑制劑(ToYoBa)增至 20U，MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶(ToYoBa)增至 200U，3 種病毒下游引物各0. 7 μ 1，42 V反轉(zhuǎn)錄50min可以合成足夠量的cDNA用于PCR。PCR反應(yīng) 中僅需將Mg2+增至3. 5mmol/L, dNTP增至0. 5mmol/L, Taq酶(ToYoBa)增至2U，上下游引物 各0. 8 μ mol/1 ；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min, 94°C變性30s, 59°C退火30s, 72°C延伸lmin， 30個循環(huán)，最后72°C IOmin0運(yùn)用優(yōu)化后的三重RT-PCR體系對9個馬鈴薯帶毒材料進(jìn)行檢 測，均可穩(wěn)定的同時檢測出PVY、PVA和PLRV。實施例6結(jié)合圖9和圖10。三重RT-PCR即一個反應(yīng)中同時檢測3種馬鈴薯病毒，與實施例4三重RT-PCR標(biāo) 準(zhǔn)化檢測方法相同。本試驗中對PVM、PVS、TSWV及PVM、PVS、PSTVd的兩組病毒組合進(jìn)行了 三重RT-PCR檢測。在反轉(zhuǎn)錄時，對兩組組合設(shè)計了 5對引物濃度比，其擴(kuò)增效果如圖9，1-5泳道 下游引物量 TSWV PVM PVS 分別為 0.5 1. 5 1. 5，1 1. 5 0. 5，1 1 0. 5， 1 1 1.5，1 1 1。同時擴(kuò)增PVM、PVS、TSWV時下游引物量為1 1 1時擴(kuò)增效果 最佳；擴(kuò)增PVM、PVS和PSTVd時，下游引物量為時0.5 0. 5 1擴(kuò)增效果最佳。PCR 體系中 Mg2+ 終濃度分別為 0. 25mmol/L,0. 5mmol/L,0. 75mmol/L 時，對三重 RT-PCR檢測的影響結(jié)果如圖10。結(jié)果表明同時檢測TSWV、PVM、PVS, Mg2+終濃度為0. 25mmol/L,無法進(jìn)行三重擴(kuò) 增，PVM的靶標(biāo)條帶幾乎不能看見，隨著Mg2+濃度的提高，三條靶標(biāo)條帶逐漸明亮，當(dāng)Mg2+終 濃度為0. 75mmol/L效果最佳，靶帶最清晰明亮；同時檢測PSTVd、PVM、PVS, Mg2+終濃度為 0. 25mmol/L僅PSTVd的靶標(biāo)條帶不夠清晰，增加Mg2+終濃度至0. 5mmol/L則同時擴(kuò)增的效
果最佳。
權(quán)利要求
1.一種可檢測不同株系馬鈴薯病毒的專用引物，其特征是包括如下引物中的至少一對引物對I 序列表的序列1和序列2所示核苷酸序列組成的引物對；引物對II 序列表的序列3和序列4所示核苷酸序列組成的引物對；引物對III 序列表的序列5和序列6所示核苷酸序列組成的引物對；引物對IV 序列表的序列7和序列8所示核苷酸序列組成的引物對；引物對V 序列表的序列9和序列10所示核苷酸序列組成的引物對；引物對VI 序列表的序列11和序列12所示核苷酸序列組成的引物對；所述檢測馬鈴薯病毒是馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯S病毒、馬鈴薯A病毒、馬鈴薯卷葉病毒、 馬鈴薯M病毒或番茄斑萎病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可檢測不同株系馬鈴薯病毒的專用引物，其特征是所述專 用引物由引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、引物對V和引物對VI組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可檢測不同株系馬鈴薯病毒的專用引物，其特征是所述專 用引物由引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、引物對V或引物對VI組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的可檢測不同株系馬鈴薯病毒專用引物的檢測方 法，其特征是包括以下步驟A、病毒總RNA的提取提取馬鈴薯病毒的總RNA；B、RT-PCR應(yīng)用專用引物對病毒總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)備cDNA模板，應(yīng)用專用引物對 cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得擴(kuò)增產(chǎn)物；C、對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)擴(kuò)增片段大小判斷病毒種類。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的可檢測不同株系馬鈴薯病毒專用引物的檢測方法，其特征 是所述PCR的反應(yīng)參數(shù)是94°C 3min, 94°C變性30s，59°C退火30s，72°C延伸30s，30個循 環(huán)，最后72°C延伸lOmin，PCR反應(yīng)結(jié)束后，取出擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
6.一種權(quán)利要求1所述的可檢測不同株系馬鈴薯病毒專用引物的設(shè)計方法，其特征 是包括以下方法或步驟，a.通過NCBI的GENBANK數(shù)據(jù)庫檢索所有已報道、已發(fā)現(xiàn)、已提交數(shù)據(jù)庫的上述任一病 毒序列；b.將同一病毒序列下載后，使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對分析，篩選出不同株系的同一病 毒的病毒序列；c.通過DNAMAN軟件將不同株系的同一病毒序列進(jìn)行比對，尋找其保守區(qū)域；d.使用PRIMER5，OLIGO引物設(shè)計軟件在保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計引物；e.將設(shè)計好后的備選引物提交到NCBI的BLAST系統(tǒng)中進(jìn)行電子PCR篩選，選擇相似性 為100%，能搜索出最多不同株系同一病毒病毒序列的引物作為標(biāo)準(zhǔn)引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可檢測不同株系馬鈴薯病毒的專用引物及其設(shè)計方法。本發(fā)明提供的專用引物包括如下引物中的至少一對，序列表中引物對I、引物對II、引物對III、引物對IV、引物對V和引物對VI。本發(fā)明還提供了用所述專用引物進(jìn)行馬鈴薯病毒檢測的方法和條件；本發(fā)明還提供了專用引物的設(shè)計方法。本發(fā)明基于專用引物的RC-PCR檢測其特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測速度快、操作簡便、樣品預(yù)處理簡單、重復(fù)性好、易于分析；通過本發(fā)明設(shè)計篩選出的專用引物與馬鈴薯病毒相似性達(dá)100％可檢測已報道或發(fā)現(xiàn)的不同株系馬鈴薯病毒；在馬鈴薯病毒檢測中具有廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/11GK102146484SQ20111003105
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者萬佳, 劉可, 孟興, 寧紅, 張敏, 張洪峰, 李霄林 申請人:中華人民共和國四川出入境檢驗檢疫局, 四川省農(nóng)業(yè)廳植物檢疫站