專利名稱：一種特異性檢測小麥稈銹菌的pcr方法
技術領域：
本發(fā)明屬農業(yè)生物技術領域，特別是涉及一種特異性檢測小麥稈銹菌的PCR方法。
背景技術：
小麥銹病致病菌包括小麥稈銹菌Puccinia graminis f. sp. tritici、小麥條銹菌 Puccinia striiformis f. sp. tritici禾P小麥葉繡菌Puccinia triticina f. sp. tritici, 是侵染小麥等禾谷類作物的重要致病真菌。小麥稈銹病是世界范圍的小麥病害，在種植小 麥的國家和地區(qū)均有發(fā)生，主要分布于北美、澳洲及非洲等地。我國主要在華東沿海、長江 流域和福建、廣東、廣西的冬麥區(qū)及東北、內蒙古、西北等春麥區(qū)發(fā)生流行，給小麥生產造成 嚴重損失。1949 1966年的17年間，福建省就有6次大發(fā)生，重者損失40% 50%。1956 年江蘇省的流行，造成減產50% 80%，個別田塊甚至絕收。近30年來，由于推廣抗病品 種，基本上控制了該病的流行和危害。但在一些流行區(qū)，感病品種仍占相當大的面積，流行 具有潛在的可能。1998年在非洲的烏干達發(fā)現(xiàn)新型的強致病力小麥稈銹菌Ug99，可克服已 在世界應用30余年的小麥抗病基因Sr31，導致所傳播區(qū)域內小麥最高減產80%，這一新型 小種還沒傳播到中國，但是在中國應提早加強小麥稈銹病的研究和稈銹菌小種的監(jiān)測。病害的早期診斷檢測是準確測報和有效防控的基礎和前提。長期以來，銹病的診 斷主要基于病原菌的生物學及病害癥狀特征，其預測預報主要基于定期、大規(guī)模的田間病 葉調查和溫室病菌的活體分離、培養(yǎng)和鑒定。而在小麥銹病潛育階段，寄主的發(fā)病癥狀不易 觀察，難以界定初侵染的時期和規(guī)模，而且調查鑒定結果的準確性和可靠性在很大程度上 依賴于調查測報人員的經(jīng)驗和技術水平。傳統(tǒng)銹病診斷及病情預報方法耗時費工，難以滿 足病害的快速、高通量診斷檢測實際需求。因此，有必要研發(fā)簡單快捷、靈敏準確的小麥銹 病快速診斷和檢測技術，其于鑒別病害、提高病害預報預測的準確性和快捷性均具有重要 的理論意義和實際應用價值。小麥3種銹病菌的田間癥狀非常相似，一些基層植保工作者時常會產生錯報、誤 報的情況，影響了數(shù)據(jù)的可靠性及預測預報的準確性，進而影響防治策略與防治措施的合 理性。因此利用分子生物學技術，采用PCR、瓊脂糖凝膠電泳等一系列手段來區(qū)分小麥條銹 病、葉銹病和稈銹病3種致病菌是比較準確、快捷的病害診斷檢測技術。目前，中國農業(yè)科學院植物保護研究所麥類病害實驗室已經(jīng)針對這一生產中面 臨的實際問題，建立了小麥條銹菌和葉銹菌生理小種的特異性分子診斷檢測技術(Cao et al. ,2007 ；曹麗華等，2007)。作為一種重要的小麥專性寄生菌，稈銹菌在微衛(wèi)星分子標記方 面的研究遠遠滯后于其他小麥專性寄生菌，如葉銹菌和條銹菌，其SSR標記已有許多研究， 并公開發(fā)表了大量可以直接利用的引物序列。而現(xiàn)有稈銹菌的微衛(wèi)星標記數(shù)量非常有限， 僅有LESJ. SZABO分離的M對引物可用(LES J. SZAB0, 2007)。這嚴重制約了微衛(wèi)星標記在 稈銹菌檢測方面的研究和應用。因此，迫切需要更多獨立分離的、多態(tài)性豐富的稈銹菌微衛(wèi) 星標記。
SSR(simple sequence repeats)又稱短串聯(lián)重復序列或簡單重復序列，是一類廣 泛存在于原核、真核生物基因組中的串聯(lián)重復DNA。SSR核心序列一般為以1 6bp核苷酸 為單位的重復序列，側翼序列大多是保守的單拷貝序列。微衛(wèi)星具有較快的變異速率，而且 這些變異大都位于可積累的中性突變非編碼區(qū)，因此微衛(wèi)星具有豐富的多態(tài)性。SSR標記 最顯著的優(yōu)點是多態(tài)性高、信息量大；一般按照孟德爾方式分離，而呈共顯性遺傳，故可以 區(qū)分雜合子和純合子，對個體鑒定具有重要意義；帶型簡單，實驗結果穩(wěn)定可靠，重復性高； 易于操作，對DNA質量要求不高，并且用量不大，甚至DNA輕度降解后，仍能擴增出目的微衛(wèi) 星座位序列。目前許多物種已有現(xiàn)成的、商品化的SSR引物，并已廣泛應用于遺傳圖譜的構 建、遺傳多樣性分析、基因標記、定位、克隆及輔助育種等。但由于SSR標記必須根據(jù)微衛(wèi) 星兩側的序列設計引物，因此在引物設計之前必須搞清微衛(wèi)星側翼的序列，這使得SSR標 記的獲得一般需要建立、篩選基因組文庫，克隆測序等一系列實驗，因此，人力、物力消耗較 大。如何快速獲得微衛(wèi)星序列是微衛(wèi)星應用中最關鍵的一步。盡管公共數(shù)據(jù)庫如GenBank、 EMBL和DDBJ上可以直接檢索到一些物種的微衛(wèi)星序列，但大多集中在模式物種及經(jīng)濟物 種上。對于像小麥稈銹菌這種微衛(wèi)星序列資源相對較少的物種來說，通過實驗方法來獲得 更多的微衛(wèi)星序列是必須的。Zane 等(2002)提出 FIASCO (Fast Isolation by AFLP Sequences Containing Repeats,借助含重復序列的AFLP序列快速分離SSR)，是將現(xiàn)階段的微衛(wèi)星開發(fā)策略很好 的結合起來的一種開發(fā)SSR的方法。該方法先對基因組DNA進行酶切，加上AFLP接頭，用 帶一個選擇性堿基的引物組進行1次PCR擴增，用生物素標記的探針與變性的擴增產物雜 交，用磁珠富集富含SSR的片段，然后經(jīng)一系列洗滌除去非特異性雜交，變性分離DNA片段 進行第2次擴增得到富含SSR的雙鏈DNA，連接載體轉化克隆測序。這種方法快速簡單并 且高效，省去了很多不必要的步驟，該技術在鳥類、魚類以及很多植物中的應用十分成熟。 目前逐漸開始在植物病原菌中應用，2005年Nakabonge等用此方法分離了 Cryphonectria eucalypti中的SSR標記；Hunter等Q006)在一種桉樹屬重要的葉部病害病原菌 Mycosphaerella nubilosa 中開發(fā)了 10 個微衛(wèi)星標記；Barrtee 等 0006)從 Melampsora Iini開發(fā)了 11對多態(tài)性引物；Barnes等^)08)也用此法對紅松疫病菌(Dothistroma septosporum)開發(fā)了 12對多態(tài)性引物。但此法尚未對小麥稈銹菌的多態(tài)性引物的開發(fā)進 行研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明根據(jù)上述領域的空白和需求，提供一種特異性檢測小麥稈銹菌的PCR方 法，該方法具有特異性好、靈敏度高、操作簡便快速的優(yōu)點。一種特異性檢測小麥稈銹菌(Puccinia graminis)的PCR方法，其步驟如下(1)制備待測DNA模板；(2)預備含有所述待測DNA模板的PCR反應體系；(3)進行PCR反應及結果觀察；其特征在于所述PCR反應體系中的引物是根據(jù)kq ID No. 1所示的序列設計的 正、反向引物，所述PCR擴增的陽性產物ID No. 1所示序列上正向引物完全互補識別 的起始堿基至反向弓I物完全識別的末端堿基之間的核苷酸片段。
所述正向引物為Pgt-FSl-F :5' -CTTGTAAACTCTCTCACATTGCCA-3‘，所述反向引物為Pgt-FSl-R :5' -ACCAGAAACTCATCAAACCTATCC-3 ‘，擴增產物為 330bp。所述PCR反應體系如下模板DNA 20nmol，正向引物40pmol，反向引物40pmol， 2 X PCR Master Mix 10 μ 1，加 ddH20 至 20 μ 1。所述PCR反應的程序如下94°C 3分鐘，94°C 1分鐘，55°C 45秒，72°C 45秒，30個 循環(huán)，72°C 10min，4°C保存。本發(fā)明采用FIASCO法富集小麥稈銹菌的微衛(wèi)星文庫，將富集獲得的微衛(wèi)星片段 經(jīng)過回收純化，連接到PGEM-T載體中，轉化大腸桿菌Dffia感受態(tài)細胞，涂板于含有Amp的 LB固體培養(yǎng)基中，即構建成小麥稈銹菌基因組微衛(wèi)星富集文庫。經(jīng)過藍白斑篩選，挑取白色 克隆到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。將ImL菌液提取質粒，EcoR I酶檢測 確定插入片段的有無及大小。挑取擴增片段在200-500bp之間的陽性克隆測序。測序結果 先用SSR Hunter搜索微衛(wèi)星序列后再用EBI比對去除重復序列。挑選兩側翼區(qū)都足夠長 的微衛(wèi)星序列，從中選擇一條SSR標記，其核苷酸序列如％(1 ID No. 1所示，是稈銹菌特有 的SSR標記序列，可應用于特異性檢測鑒別小麥稈銹菌，這種應用包括用作探針，或者作為 設計特異性引物的模板，設計出的引物擴增待測模板，如果擴增出預期大小的片段說明該 待測模板中含有該SSR標記，也就是說該待測模板中含有小麥稈銹菌的DNA。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，設計的引物為Pgt-FSl-F 5' -CTTGTAAACT CTCTCACATTGCCA-3’ /Pgt-FSl-R 5' -ACCAGAAACTCATCAAACCTATCC-3‘。該對引物用于檢測小麥稈銹菌，具有特異性好、靈 敏度高、操作簡便快速的優(yōu)點，在葉片感病30h時即可檢測到真菌。能夠專一識別小麥稈銹 菌，能夠鑒別小麥幼苗期麥苗的感染情況，使植保工作人員針對致病菌進行提早防治。獲得 該引物后，植保工作人員通過簡單的PCR、瓊脂糖凝膠電泳檢測等技術即可鑒定小麥是否感 染小麥稈銹菌，與其他種類致病菌的鑒定方法結合使用達到鑒別診斷的目的。本發(fā)明還進一步做了 PCR條件的優(yōu)化工作，提供一種更有利于特異性、靈敏性地 擴增目的產物優(yōu)選PCR方案。


圖1.基因組DNA經(jīng)選擴-純化后得到的smear區(qū)域其中1為陰性對照，2、3為模板小麥稈銹菌(21C3)DNA圖2.引物Pgt-FSl-F/Pgt-FSl-R擴增測序結果圖3.引物pgt-FSl-F/Pgt-FSl-R應用在相關小麥真菌中的特異性檢測其中泳道1-19 分別為小麥稈銹菌(Puccinia graminis) 17，19，21，21C1，21C2， 21C3，21C3CKR，21C3CTH，34，34C1，34C2MFR，34C2MFK,34C2MKR,34C3，34C4，34C5，40，116， 194號小種或致病類型，20-22分別為葉銹菌(Puccina triticina)PHK、PHT、THT致病類 型；23-25 分別為條銹菌(Puccinia striiformis) CY29、CY32、CY33 致病類型，26- 分別 為小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa) TCKDl、TCKD2、TCKD3菌株，29-為網(wǎng)腥黑粉菌 (T. caries) TCTSC 菌株，30-32 為光腥黑粉菌(T. foetida) TF1、TF2、TF3 菌株，33-為小麥散 黑粉菌(Ustilago tritici)UMl 菌株，34-玉米絲黑穗病原菌(Sporisorium reilianum)
5SRl菌株、35-為小麥赤霉菌(Fusarium gramminearum) 11027菌株、36-37為小麥赤霉菌 (Fusarium asiaticum) 1012、12003 菌株，39-43 為小麥白粉菌(Blumeria graminis) CPff-U E16、ES-l-S、E32、E06 菌株。圖4.靈敏度檢測其中泳道1-6 小麥稈銹菌Q1C3)模板DNA濃度分別為20ng/l·! 1，lOng/μ l,5ng/ μ l,lng/y 1,0. lng/μ 1,0. Olng/μ 1 ；7 陰性對照圖5.引物I^gt-FSl-F/Pgt-FSl-R在染病葉片中的PCR檢測結果其中泳道1是陰性對照(以DDW為模板)；2是小麥品種McNair 701未被稈銹菌 侵染葉片；3 9分別是小麥稈銹菌21C3侵染6h，12h，24h, 30h, 2d，3d，4d，5d，6d后取樣并 經(jīng)自來水沖洗葉片
具體實施例方式實驗材料小麥稈銹菌21C3小麥稈銹菌分離物稈銹菌(Pucciniagraminis) 17，19，21，21C1，21C2，21C3， 21C3CKR,21C3CTH,34，34C1,34C2MFR,34C2MFK,34C2MKR,34C3,34C4,34C5，40，116，194，葉 銹菌(Puccina triticina) PHK、PHT、THT 致病類型，條銹菌(Puccinia striiformis) CY29、 CY32、CY33 致病類型，小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa)TCKDl、TCKD2、TCKD3 菌 株、光腥黑粉菌(T. foetida)TFU TF2、TF3菌株、網(wǎng)腥黑粉菌(T. caries)TCTSC菌株、小麥 散黑穗病菌(Ustilago tritici)UMl菌株、玉米絲黑穗病原菌(Sporisorium reilianum) SRl菌株、小麥赤霉菌(Fusarium gramminearum) 11027菌株、小麥赤霉菌(Fusarium asiaticum) 1012、12003 菌株、小麥白粉菌(Blumeria graminis)CPff-U E16、ES-l-S、E32、 E06菌株。以上菌株均為已經(jīng)發(fā)表在其它文獻中的已知菌株，且本實驗室均有保存，可向公 眾發(fā)放用于驗證試驗。小麥品種McNair 701，可商購，本實驗室有保存，可向公眾發(fā)放。實施例1 小麥稈銹菌的擴繁本發(fā)明以中國麥區(qū)19份小麥稈銹菌單孢分離物為實驗材料，在中國農業(yè)科學院 植物保護研究所常溫室進行鑒定與大量擴繁，具體步驟如下1.種植小麥稈銹病感病品種McNair 701，待第1葉片完全展開第2片新葉長時， 接種19份小麥稈銹菌分離物。2.接種前先將葉片表面噴施0. 5%。的土溫-20溶液潤濕，然后用潔凈手指夾住葉 片自下而上輕輕抹去葉片表面的蠟質。用潔凈梭形接種針，蘸水輕輕挑取孢子(對于病葉， 在挑取時應盡量選擇清晰，獨立的夏孢子堆)，輕輕涂抹于麥苗的葉片正面。接種完成后，立 即將接種針用清水沖洗，然后蘸取75%酒精在酒精燈上灼燒消毒，以防污染后續(xù)標樣的接 種。將接種完畢的麥苗放入保濕 筒，在葉片表面上噴上一層均勻細密的水霧后封閉保濕筒， 置于15-25°C遮光及90% -100%的相對濕度條件下保濕18_24h，之后置于15_30°C常溫室 中，并適當補充光照至12-1 !，約5-7d后葉片顯出褪綠斑剪去第二片心葉并罩上干凈透明 的玻璃罩，待孢子堆充分發(fā)育后備用。
3.在葉片顯斑后的7-10天內夏孢子成熟時，進行第一次收菌，將麥苗小心橫放于 一個垂直放置的玻璃罩子上，用已消毒過的接種針從根部輕輕抖動葉片或輕輕敲打罩在麥 苗外的玻璃罩，使夏孢子散落到玻璃罩內，移去麥苗并輕敲玻璃罩，使夏孢子集中成一條直 線，裝入寫好標簽的指形管。實施例2 =FIASCO法篩選小麥稈銹菌微衛(wèi)星標記鏈霉親和素磁珠購自hvitrogen北京公司，磁珠型號Dynakads M-280Str印tavidin。磁性分離架購自hvitrogen 北京公司，型號 DynaMag -Spin magnet 123-20D生物素標記探針核苷酸序列為(TC) 10，3'端經(jīng)生物素修飾，合成自上海生工生 物工程技術服務有限公司。步驟1.基因組DNA的提取(1)預處理參照Paul J. Zambino的方法并加以改良稱取IOmg小麥稈銹菌21C3的夏孢子、25mg硅藻土、250 士 IOmg直徑Imm滅菌玻璃 珠分別裝入2. 5ml滅菌螺口離心管，置于-30°C保存至少ld，欲抽提時立即從冰箱取出。(2)研磨置離心管于MPi^astft·印-24中，設6. 5M/s, IOs處理1次，共處理2次。(3)水浴加入預熱 600 μ 1 CTAB 緩沖液(pH8. 0),60 μ 120 % SDS 緩沖液和 5 μ 1 蛋白酶K溶液，蝸旋混勻，65°C恒溫水浴lh。裂解過程中每IOmin混勻一次，越到后期動作 越要溫和，防止DNA破碎。(4)抽提待提取體系冷至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇混合溶液，4°C， M493Xg離心lOmin。取上清液至新離心管，再重復抽提操作2次。(5)去RNA 取上清至新離心管中，加入2μ 110mg/ml RNA酶，37°C恒溫水浴l_2h。(6)精提同抽提步驟。(7)沉淀轉上清至新離心管，加入2倍體積無水乙醇，4°C，1M93 Xg離心lOmin，
棄上清。(8)洗滌加入300 μ 1預冷70%乙醇，用移液器沖洗2遍。(9)溶解真空干燥lOmin，溶于20 μ 1 TE溶液(ρΗ8. 0)，4°C保存。利用紫外分光 光度計檢測DNA的濃度和純度，調整濃度至lOOng/μ 1，_20°C保存?zhèn)溆?。步驟2.基因組DNA的酶切、連接及特定大小DNA片段的獲得用MseI限制性內切酶65°C下切割基因組DNA 3h，隨后與MseI A/Msel B(5~-TACT CAGGACTCAT-3" -GACGATGAGTCCTGAG-3") 16°C連接過夜。消化連接產物稀釋后，采用 AFLP 接頭特異性Mse I-N引物組(5、-GATGAGTCCTGAGTAAN-3)進行PCR預擴增，將PCR循環(huán)數(shù)設 定在21個循環(huán)，PCR反應成功的標志是電泳產物中出現(xiàn)一個Smear區(qū)域(300_800bp)，如圖 1。步驟3.生物素探針雜交生物素標記探針核苷酸序列為(TC) 10，3端聯(lián)生物素，合成自上海生工生物工程 技術服務有限公司。取上述PCR預擴增產物10μ L，95°C水浴解鏈5min，加入50°C預熱的含有0. 1 % SDS的6 X SSC雜交緩沖液(pH7. 0)85 μ L和生物素標記探針5 μ L，構成100 μ L雜交體系。PCR儀中50°C反應30min，取出后，緩慢冷卻至室溫，加入300 μ L TEm00溶液(1 OOmM NaCl， IOmM Tris-HClpH7. 5, ImM EDTA)混勻，4°C保存?zhèn)溆?。取Img的鏈霉親和素磁珠(購自hvitrogen北京公司，磁珠型號Dynabeads M-280Streptavidin)，加入400 μ L ΤΕΝ100溶液仔細洗滌3次，每次洗滌都用磁性分離架 (購自hvitrogen北京公司，型號DynaMag -Spin magnet 123-20D)固定磁珠。洗滌完 畢后，用200 μ L TEmOO溶液重懸磁珠，接著加入到生物素探針雜交液中，室溫反應lh， 待磁珠吸附完畢，用磁架固定磁珠，移去雜交混合液。沉淀用400 μ LTEN1000溶液(IOmM Tris-HCiamM EDTA，IM NaCl ρΗ7. 5)室溫下洗滌3次，將與磁珠非特異性結合的DNA片段 洗脫。然后用400 μ L含0. SDS的0. 2X SSC特異性雜交洗脫液(ρΗ7. 0)室溫下洗滌磁 珠3次，每次5分鐘，再于50°C下洗滌lOmin，最后使用400 μ L 0. 2 X SSC室溫下洗滌磁珠 IOmin,以除去殘留SDS，洗滌過程中不時的攪動或輕輕用移液器吹打。步驟4.磁珠富集微衛(wèi)星DNA片段在上述完成洗滌后的磁珠中加入50 μ L無菌水，然后于95°C下水浴5min，用磁架 收集磁珠后，迅速吸取上清液，按1 2的比例加入100 μ L冰凍乙醇，再加入10 μ L 5mol/ L的醋酸鈉助沉，4 °C、13000r/min離心20min，棄上清后，用70 %酒精再清洗2遍，4 °C， 13000r/min離心20min，小心的移去乙醇，真空干燥機中干燥lOmin，加入50 μ L無菌水溶解
沉淀，4°C保存?zhèn)溆?。步驟5.目的DNA片段的洗脫和精制以上述單鏈目的DNA片段為模板，用MseI-N引物組進行PCR擴增獲得雙鏈微衛(wèi) 星DNA片段。PCR擴增的20 μ L反應體系中包含無菌水8.8 μ L，10*PCR buffer 2 μ L， dNTP (2. 5mmol/L)2y L，MseI-N 引物組(IOmM) 2 μ L，Taq 酶(5U/μ L) 0· 2 μ L，模板DNA 5μ L。PCR反應條件為94°C預變性5min，經(jīng)94°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸 Imin共32個循環(huán)后，72°C放置lOmin，以完成末端加A步驟。步驟6 微衛(wèi)星富集文庫的構建完成雙鏈衛(wèi)星片段PCR擴增后，將PCR產物回收純化，連接到pGEM-T載體中，轉化 大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，鋪板于含有Amp的LB固體培養(yǎng)基中，即構建成稈銹菌基因組
微衛(wèi)星富集文庫。實施例3.微衛(wèi)星序列的鑒定和特異性引物設計實施例2中步驟6的轉染細胞，經(jīng)過藍白斑篩選，挑取白色克隆到含有Amp的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。將ImL菌液提取質粒，EcoR I酶檢測確定插入片段的有無 及大小。挑取擴增片段在200-500bp之間的陽性克隆送出測序。測序結果先用SSRHimter 搜索微衛(wèi)星序列后再用EBI比對去除重復序列獲得一批SSR標記。挑選兩側翼區(qū)都足夠長 的微衛(wèi)星序列，其中一條SSR標記如kq ID No. 1所示，用I^rimer 5.0軟件設計引物，設計 出的引物Pgt-FSl-F/Pgt-FSl-R，其序列為Pgt-FSl-F 5' -CTTGTAAACTCTCTCACATTGCCA-3‘Pgt-FSl-R 5' -ACCAGAAACTCATCAAACCTATCC—3‘引物對在小麥稈銹病菌中特異性擴增出330bp的產物見圖3，其序列如kq ID No. 2所示，測序序列圖2。PCR優(yōu)化引物的反應條件如下
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模板DNA(20ng/ul)1 μ 1Primer (20pmol/μ 1)2μ 12 X PCRMasterMix10 μ 1ddH207 μ 1所述PCR反應的程序如下94"C 3min94°C Imin55°C 45s72°C 45sGoto Step 2 for 30circle72 °C IOmin4 "C forever實施例4 小麥稈銹菌特異性SSR標記的檢測應用靈敏度檢測梯度稀釋純化后的稈銹菌Q1C3)模板DNA，濃度為O.Olng/μΙ^Ο. lOng/yL、 1. OOng/μ L、5. OOng/μ L、10. OOng/μ L、和 20. OOng/μ L，選用特異性引物 Pgt-FSl-F/ Pgt-FSl-R進行擴增。PCR體系及程序與實施例4相同。PCR反應產物經(jīng)凝膠電泳，結果如圖4所示從1. OOng/μ L-20. OOng/ μ L的模板 DNA中均檢測到長度為330bp的DNA片段。特異性檢測以小麥重要病原菌葉銹菌(Puccina triticina)PHK、PHT、THT致病類型，條 銹菌(Puccinia striiformis)CY29、CY32、CY33 致病類型，小麥矮腥黑粉菌(Tilletia controversa) TCKDU TCKD2, TCKD3 菌株、光腥黑粉菌(T. foetida) TFUTF2.TF3 菌株、網(wǎng)腥 黑粉菌(T. caries) TCTSC菌株、小麥散黑穗病菌(Ustilago tritici) UMl菌株、玉米絲黑穗 病原菌(Sporisorium reilianum) SRl 菌株、小麥赤霉菌(Fusarium gramminearum) 11027 菌株、小麥赤霉菌(Fusarmm asiaticum) 1012、12003菌株、小麥白粉菌(Blumeria graminis)CPff-U E16、ES-l-S、E32、E06菌株為對照，對供試的19個小麥稈銹菌菌株進行 回檢，PCR程序及體系同實施例4。結果如圖3所示，在所有參檢的小麥稈銹菌中均呈現(xiàn)陽 性擴增，顯示出該DNA片段對小麥稈銹菌的檢測具有高度的?；?；而在3個小麥條銹菌菌 株、3個小麥葉銹菌株、及其它病原真菌中則沒有擴增到該片段(圖3)。在染病葉片中檢測以小麥稈銹菌菌株01C3)室內苗期接種McNair 701，接種菌量為5mg/盆，對照 處理噴滑石粉。接種后6h，12h，24h, 30h, 2d，3d，4d，5d，6d取小麥葉片，以無菌水清洗葉表 面去除未侵染小麥稈銹菌夏孢子后，液氮速凍，儲存于-80°C，用于病害顯癥前小麥稈銹菌 的檢測。小麥稈銹菌成功侵染小麥后，一般需要7-14天甚至更長時間才能產生新的傳播 體-病菌夏孢子。室內接種后小麥葉片DNA的PCR結果表明，小麥稈銹菌侵入寄主后30h， 即可利用該SSR標記檢測到稈銹菌的特異性DNA片段，見圖5。因此，在小麥生產實踐中，可 以在病害潛育階段進行PCR檢測，根據(jù)稈銹菌特異性SSR標記的出現(xiàn)概率進行病害早期預警，以提早開展病害流行測報和及時指導病害防治，這對于降低小麥稈銹病的防治成本、阻 斷病害的擴散蔓延、確保我國小麥安全生產具有重要意義。
權利要求
1.一種特異性檢測小麥稈銹菌(Puccinia graminis)的PCR方法，其步驟如下(1)制備待測DNA模板；(2)預備含有所述待測DNA模板的PCR反應體系；(3)進行PCR反應及結果觀察；其特征在于所述PCR反應體系中的引物是根據(jù)％(1 ID No. 1所示的序列設計的正、反 向引物，所述PCR擴增的陽性產物為kq ID No. 1所示的序列上正向引物完全互補識別的 起始堿基至反向弓I物完全識別的末端堿基之間的核苷酸片段。
2.根據(jù)權利要求1所述的PCR方法，所述正向引物為 Pgt-FSl-F :5' -CTTGTAAACTCTCTCACATTGCCA-3‘， 所述反向引物為Pgt-FS 1-R 5 ‘ -ACCAGAAACTCATCAAACCTATCC-3 ‘，擴增陽性產物為 330bp。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的PCR方法，所述PCR反應體系如下模板DNA20nmol，正 向引物 40pmol，反向引物 40pmol，2XPCRMasterMix 10 μ 1，力卩 ddH20 至 20 μ 1。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的PCR方法，所述PCR反應的程序如下94°C3分鐘，94°C 1 分鐘，55°C 45 秒，72°C 45 秒，30 個循環(huán)，72°C 10min，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明“一種特異性檢測小麥稈銹菌的PCR方法”，屬于農業(yè)生物技術領域。其步驟如下(1)制備待測DNA模板；(2)預備含有所述待測DNA模板的PCR反應體系；(3)進行PCR反應及結果觀察；其特征在于所述PCR反應體系中的引物是根據(jù)Seq ID No.1所示的序列設計的正、反向引物，所述PCR擴增的陽性產物為Seq ID No.1所示的序列上正向引物完全互補識別的起始堿基至反向引物完全識別的末端堿基之間的核苷酸片段。本發(fā)明的方法具有特異性好、靈敏度高、操作簡便快速的優(yōu)點。能夠為植保工作人員提供可靠的預報參數(shù)，以便于及時采取合理的防治措施。
文檔編號C12Q1/04GK102146464SQ201110031068
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權日2011年1月28日
發(fā)明者劉博 , 劉太國, 王曦, 陳萬權, 高利 申請人:中國農業(yè)科學院植物保護研究所