專利名稱：增強(qiáng)細(xì)胞生存力和生物產(chǎn)物產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，更特別地涉及通過(guò)改善細(xì)胞培養(yǎng)基的過(guò)程參數(shù)，包括PH值、重量克分子滲透壓濃度和溶解二氧化碳水平的控制來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞密度、細(xì)胞生存力、產(chǎn)物濃度和產(chǎn)物產(chǎn)量的方法。背景
蛋白質(zhì)治療劑和其他生物制品例如單克隆抗體的商業(yè)性生產(chǎn)當(dāng)前一般在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，所述生物反應(yīng)器適合于培養(yǎng)遺傳優(yōu)化的哺乳動(dòng)物、昆蟲或其他細(xì)胞類型的懸浮液。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器一般具有數(shù)百到數(shù)千升工作體積。最常見的全規(guī)模制造廠具有工作體積從約1，000升直到25，000升的工作體積的生物反應(yīng)器。臨床試驗(yàn)的藥物候選物在具有五(5)到幾百升工作體積的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)器中生產(chǎn)。優(yōu)化以實(shí)現(xiàn)最少的時(shí)間量中可能的最高生物產(chǎn)物產(chǎn)量和生物反應(yīng)器規(guī)模擴(kuò)大的相關(guān)的挑戰(zhàn)集中于控制公認(rèn)的關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)，例如PH值、溶解氧(DO)、溫度、營(yíng)養(yǎng)物組成和副產(chǎn)物分布、攪動(dòng)分布、氣體噴射方法、營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)料和產(chǎn)物收獲分布。其他過(guò)程參數(shù)例如溶解的二氧化碳(dC02)和重量克分子滲透壓濃度(S卩，每千克溶液溶解的顆粒的濃度)的重要性近來(lái)才被記錄在文獻(xiàn)中。事實(shí)上，許多商業(yè)的生物反應(yīng)器甚至不具有安裝的裝置來(lái)就地測(cè)量溶解的二氧化碳水平和/或重量克分子滲透壓濃度，不用說(shuō)控制和優(yōu)化這些參數(shù)的裝置。取決于商業(yè)性運(yùn)行的規(guī)?！獜臄?shù)百直到25，000升的生物反應(yīng)器體積，過(guò)程的規(guī)模擴(kuò)大、優(yōu)化和控制構(gòu)成了不同的挑戰(zhàn)。在高于約1，000升的商業(yè)規(guī)模下，如果可能的話，使用當(dāng)前最好的可獲得的技術(shù)和方法，溶解的二氧化碳水平和重量克分子滲透壓濃度的同時(shí)和單獨(dú)控制變得困難。在生物反應(yīng)器中開始制造規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程之前，一般制備種子培養(yǎng)物接種物。這涉及在孵化器中的一系列燒瓶和/或遞增體積的較小生物反應(yīng)器中培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞，直到可獲得足夠的細(xì)胞用于接種到生產(chǎn)生物反應(yīng)器中。所述過(guò)程涉及將細(xì)胞群體從一個(gè)培養(yǎng)容器轉(zhuǎn)移到更大的培養(yǎng)容器中。一般地，細(xì)胞群體的20%稀釋物被用于每次轉(zhuǎn)移或傳代培養(yǎng)。在孵化器中，具有培養(yǎng)基的燒瓶被夾持在轉(zhuǎn)臺(tái)上來(lái)漩渦培養(yǎng)物和促進(jìn)培養(yǎng)基與孵化器中的空氣之間的氣體轉(zhuǎn)移。一般地，用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的孵化器設(shè)置在 37°C、5% 二氧化碳(CO2)和高于約80%的濕度水平。類似的溫度和(X)2水平用于在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的種子培養(yǎng)物。當(dāng)種子培養(yǎng)物達(dá)到足夠的體積和細(xì)胞密度時(shí)，它被接種到生產(chǎn)生物反應(yīng)器中。在種子培養(yǎng)物接種到生物反應(yīng)器培養(yǎng)基中之后，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間，參數(shù)例如 PH值、溫度和溶解氧水平被控制到指定的水平。pH值一般通過(guò)在過(guò)程期間必要時(shí)添加堿性或酸性溶液來(lái)控制。通常使用的堿性溶液包括碳酸氫鈉、碳酸鈉和氫氧化鈉溶液。二氧化碳 (CO2)的溶解通常用于實(shí)現(xiàn)更為酸性的pH值。雖然可以獲得其他酸用于控制pH值，溶解的 CO2和碳酸氫鈉組合形成了細(xì)胞培養(yǎng)物的最穩(wěn)定的和有利的緩沖系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的培養(yǎng)基或溶液的優(yōu)選的溫度是約37°C。培養(yǎng)基或溶液中期望的溶解氧水平一般利用安裝在生物反應(yīng)器底部的噴射器通過(guò)空氣噴射來(lái)實(shí)現(xiàn)，以及利用破裂大的空氣/氧氣泡的葉輪攪動(dòng)培養(yǎng)基或溶液來(lái)增強(qiáng)氧氣從噴射的氣泡向細(xì)胞培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移。用覆蓋氣體吹掃生物反應(yīng)器頂部空間提供了有限程度的表面氣體交換。不利地，空氣噴射和培養(yǎng)基或溶液的攪動(dòng)可能引起泡沫和對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的剪切損傷，其不利地影響細(xì)胞生存力。在培養(yǎng)基的表面上泡沫的積累也導(dǎo)致進(jìn)一步限制表面氣體交換和降低生物反應(yīng)器的可用的工作體積。商業(yè)規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程可以以三種不同的運(yùn)行方式進(jìn)行用于懸浮的細(xì)胞培養(yǎng)物的批量模式和進(jìn)料-分批模式，以及用于固定化細(xì)胞的灌流模式。大部分商業(yè)規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程以進(jìn)料-分批模式運(yùn)行。在進(jìn)料-分批模式中，其他的培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)物在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間的不同時(shí)間添加到生物反應(yīng)器，來(lái)在初始的生物反應(yīng)器建立之后補(bǔ)充碳源和其他營(yíng)養(yǎng)物。在任何生物反應(yīng)器用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)之前，一般它必需被消毒和裝備各種探測(cè)器，以及用于補(bǔ)充氣體供應(yīng)和導(dǎo)入其他進(jìn)料的連接物。溫度探測(cè)器、PH值檢測(cè)器、溶解氧探測(cè)器和溶解CO2探測(cè)器或傳感器被用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液的溫度、pH值、溶解氧和溶解CO2水平。此外，細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液樣品可以在選定的間隔時(shí)間從生物反應(yīng)器中抽出來(lái)測(cè)定細(xì)胞密度和細(xì)胞生存力，以及分析其他特征，例如，代謝物和重量克分子滲透壓濃度。根據(jù)這樣的分析結(jié)果，其他進(jìn)料或其他添加劑可以添加到細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液，以延長(zhǎng)細(xì)胞生存力和提高生物制品的產(chǎn)量。當(dāng)細(xì)胞生存力達(dá)到指定的下閾值時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程可以停止或關(guān)閉。指定的下閾值常常根據(jù)下游回收和收獲的生物制品的純化的結(jié)果經(jīng)驗(yàn)性地確定。在培養(yǎng)過(guò)程期間，哺乳動(dòng)物細(xì)胞展現(xiàn)了三個(gè)階段，S卩，遲緩期、指數(shù)生長(zhǎng)期、以及穩(wěn)定或生產(chǎn)期。遲緩期在接種之后立即出現(xiàn)，一般是哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)新環(huán)境的生理適應(yīng)的階段。在遲緩期之后，哺乳動(dòng)物細(xì)胞被認(rèn)為處于指數(shù)生長(zhǎng)期。在指數(shù)生長(zhǎng)期中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞擴(kuò)增，細(xì)胞密度隨時(shí)間指數(shù)地提高。在指數(shù)生長(zhǎng)期的某些時(shí)點(diǎn)期間，許多細(xì)胞實(shí)際上開始生產(chǎn)期望的蛋白質(zhì)、抗體或生物產(chǎn)物。細(xì)胞密度是指培養(yǎng)物中細(xì)胞的總數(shù)，通常以活細(xì)胞和非活細(xì)胞的密度表示。當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞達(dá)到穩(wěn)定或生產(chǎn)期時(shí)，活細(xì)胞活躍地產(chǎn)生用于下游收獲的生物產(chǎn)物。在這個(gè)階段，總細(xì)胞密度可能一般保持恒定，但是細(xì)胞生存力(即，活細(xì)胞的百分比)傾向于隨著時(shí)間快速地降低。已知哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液中溶解的二氧化碳的數(shù)量敏感。在指數(shù)生長(zhǎng)期期間暴露于過(guò)量的二氧化碳水平的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物可能展現(xiàn)單克隆抗體或其他期望的生物產(chǎn)物的降低的產(chǎn)生。在接種之前，弱堿性培養(yǎng)基的PH值必需用調(diào)節(jié)到最佳值的二氧化碳降低。這個(gè)過(guò)程常常導(dǎo)致在許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的遲緩期的開始時(shí)溶解的二氧化碳的升高的水平。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器中溶解的二氧化碳來(lái)自化學(xué)和生物學(xué)來(lái)源。二氧化碳的化學(xué)來(lái)源是在細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液內(nèi)發(fā)生的平衡化學(xué)反應(yīng)，所述細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液包括含有碳酸氫鈉和/或碳酸鈉的選定數(shù)量的緩沖溶液。另外，二氧化碳可以直接噴射到弱堿性培養(yǎng)基或溶液中來(lái)將肉湯的PH值水平降低到指定水平，通常約7. 0，產(chǎn)生更多的溶解的二氧化碳。二氧化碳的生物學(xué)來(lái)源是生物反應(yīng)器內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的呼吸作用的產(chǎn)物。二氧化碳的這種生物學(xué)來(lái)源隨著細(xì)胞密度提高，一般在大約生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞密度最大的同時(shí)達(dá)到其最大值。然而，隨著產(chǎn)生更多的二氧化碳，細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值傾向于酸性，從而需要另外的碳酸氫鹽來(lái)將細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液的PH值保持在期望的范圍之內(nèi)。
為了補(bǔ)償降低PH值的提高的溶解二氧化碳的作用，人們可以添加碳酸氫鈉以將溶液的PH值維持在指定范圍內(nèi)。補(bǔ)償提高的二氧化碳的效應(yīng)的這些方法對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程具有其他消極后果。首先，溶解二氧化碳水平的任何提高促進(jìn)了細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液重量克分子滲透壓濃度的提高。類似地，調(diào)節(jié)溶液的PH值以補(bǔ)償二氧化碳所需的碳酸氫鈉的添加也提高重量克分子滲透壓濃度。(重量克分子滲透壓濃度代表了每千克溶液溶解的顆粒的數(shù)量，通常通過(guò)冰點(diǎn)下降報(bào)告為mOsm/kg.) 添加碳酸氫鈉也將提高容許進(jìn)入溶液的溶解二氧化碳的平衡飽和水平，使得二氧化碳更難以在曝氣過(guò)程中除去。本領(lǐng)域已知的是，溶解二氧化碳的提高的水平或提高的重量克分子滲透壓濃度對(duì)細(xì)胞密度或產(chǎn)量具有有害的或消極的影響。然而，二氧化碳水平和重量克分子滲透壓濃度的組合的或協(xié)同的效應(yīng)沒有充分地了解。二氧化碳在水中在7的pH值下解離成碳酸氫鹽離子。僅僅部份二氧化碳保持為非解離狀態(tài)的游離C02。由于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)在6. 5到7. 5的范圍內(nèi)的PH值水平下進(jìn)行，從細(xì)胞培養(yǎng)物中除去溶解的二氧化碳因而變得困難。離解的碳酸氫鹽離子不容易除去，一般必需在可以從溶液中脫除它們之前重新結(jié)合成游離二氧化碳。碳酸氫鈉的任何添加來(lái)平衡PH值也將提高溶液中平衡溶解二氧化碳濃度或飽和水平，使得更加難以物理上除去二氧化碳。從哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液除去或脫除溶解二氧化碳的常規(guī)方法是通過(guò)用空氣或空氣/氧氣/氮?dú)獾臍怏w混合物在攪拌罐中噴射細(xì)胞培養(yǎng)物溶液。然而，在攪拌罐中氣體噴射引起對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的不良作用。特別地，在旋轉(zhuǎn)的攪拌器的尖端的氣體-氣泡破裂是高剪切速率的來(lái)源，其損傷哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜，常常足以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。即使當(dāng)損傷是亞致死性時(shí)，在修復(fù)受損的膜期間細(xì)胞生產(chǎn)力受到損害。并且，將空氣或氮?dú)鈬娚涞缴锓磻?yīng)器中產(chǎn)生氣泡，其上升到生物反應(yīng)器內(nèi)溶液的表面，在此氣體被釋放到頂部空間中。在細(xì)胞培養(yǎng)溶液的頂部表面處的氣泡破裂常常比由攪拌器引起的損傷更大地?fù)p害哺乳動(dòng)物細(xì)胞。限制攪拌器速度和限制氣體噴射速率當(dāng)前被看作是避免這樣的損傷和提高細(xì)胞生存力的最佳方式。然而，這些手段都降低了可被除去的二氧化碳的數(shù)量，不能除去的過(guò)量部分還抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和生存力。在大的商業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器中這些缺點(diǎn)是要克服的特別的挑戰(zhàn)，在所述生物反應(yīng)器中剪切速率隨著葉輪的直徑實(shí)質(zhì)上地提高。并且，大規(guī)模生物反應(yīng)器中更大的靜液壓頭傾向于提高二氧化碳的溶解度，意味著需要除去更多以將溶解的ω2水平維持在最佳范圍內(nèi)。發(fā)明概述
本發(fā)明特征在于一種提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，包括步驟通過(guò)經(jīng)由生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面處的表面氣體交換除去(remove)溶解的二氧化碳，在整個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期中將細(xì)胞培養(yǎng)基中的溶解二氧化碳維持在小于約10%的溶解二氧化碳濃度的水平下，其中細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間被維持在特定細(xì)胞的最佳范圍內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間被維持在特定細(xì)胞的最佳范圍內(nèi)。本發(fā)明還可以特征在于一種提高進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的蛋白質(zhì)產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，包括步驟(i)在具有細(xì)胞培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中接種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞培養(yǎng)基具有與溶解二氧化碳平衡的指定水平的碳酸氫鹽和初始水平的重量克分子滲透壓濃度；(ii)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基周期性地添加營(yíng)養(yǎng)物；(iii)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期或生產(chǎn)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基周期性地添加酸或堿來(lái)將PH水平維持在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的指定范圍內(nèi)，而不添加二氧化碳?xì)怏w；(iv)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期或生產(chǎn)期期間調(diào)整生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面上方頂部空間中含氧掃掠氣的體積流量，來(lái)促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面處的表面氣體交換；和(ν)在生長(zhǎng)期或生產(chǎn)期期間調(diào)整置于生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面下方的上流式葉輪的轉(zhuǎn)速。細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解二氧化碳通過(guò)經(jīng)由表面氣體交換脫除 (strip) 二氧化碳在整個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期或生產(chǎn)期維持在低于約10%的溶解二氧化碳濃度的穩(wěn)定水平。細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間維持在特定細(xì)胞的最佳范圍內(nèi)，進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的產(chǎn)物產(chǎn)量被提尚。做為選擇本發(fā)明可以特征在于一種提高進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，包括步驟(i )用細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞培養(yǎng)基具有與溶解二氧化碳平衡的指定水平的碳酸氫鹽；(ii)通過(guò)除去溶解二氧化碳在整個(gè)進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期或生產(chǎn)期將細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解二氧化碳的濃度維持在低于約 10% ；和(iii)從進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期的起始到生產(chǎn)期的結(jié)尾將細(xì)胞培養(yǎng)基中重量克分子滲透壓濃度的提高限制在小于400 mOsmol/kg，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間被維持在特定細(xì)胞的最佳范圍內(nèi)。本發(fā)明還可以特征在于一種控制進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值水平的方法，包括步驟(i )在接種期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基提供二氧化碳和碳酸氫鈉緩沖劑來(lái)建立細(xì)胞培養(yǎng)基中碳酸氫鹽與溶解二氧化碳的指定平衡水平和重量克分子滲透壓濃度的初始水平；(ii)在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間從細(xì)胞培養(yǎng)基脫除溶解二氧化碳；(iii)在生長(zhǎng)期期間和任選地在生產(chǎn)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基添加營(yíng)養(yǎng)物；(iv)在生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基添加酸或堿來(lái)將PH值水平維持在指定范圍內(nèi)，而不添加二氧化碳?xì)怏w用于PH值調(diào)整。作為這種過(guò)程的結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度水平被維持在指定范圍內(nèi)，從生長(zhǎng)期的起始到生產(chǎn)期的結(jié)尾重量克分子滲透壓濃度水平的提高小于400 mOsmol/kg，在生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解二氧化碳的濃度維持在10%或更低。做為選擇本發(fā)明可以特征在于一種在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期期間延長(zhǎng)細(xì)胞生存力和提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，包括步驟(i)在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期期間用水稀釋細(xì)胞培養(yǎng)基，來(lái)降低細(xì)胞培養(yǎng)基中廢物的毒性影響；(ii)在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基添加補(bǔ)充的營(yíng)養(yǎng)物來(lái)補(bǔ)償水的稀釋效應(yīng)；(iii)在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期期間將細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解二氧化碳的濃度維持在10%或更低，并將細(xì)胞培養(yǎng)基中重量克分子滲透壓濃度水平和PH值水平維持在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最佳范圍內(nèi)，其中由于在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期期間哺乳動(dòng)物細(xì)胞的延長(zhǎng)的細(xì)胞生存力蛋白質(zhì)產(chǎn)物產(chǎn)量被提高?？梢员碚鞅景l(fā)明的另一種方式是一種改善產(chǎn)自進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的純度的方法，包括步驟(i)在具有細(xì)胞培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中接種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞培養(yǎng)基具有與溶解二氧化碳平衡的指定水平的碳酸氫鹽和初始水平的重量克分子滲透壓濃度；(ii)向細(xì)胞培養(yǎng)基添加營(yíng)養(yǎng)物從而提高細(xì)胞培養(yǎng)基的重量克分子滲透壓濃度水平來(lái)加速來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)生產(chǎn)；(iii)向細(xì)胞培養(yǎng)基添加酸或堿來(lái)將PH值水平維持在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的指定范圍內(nèi)；(iv)在整個(gè)進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中從細(xì)胞培養(yǎng)基脫除溶解二氧化碳，其中細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解二氧化碳的濃度維持在10%或更低，其中自重量克分子滲透壓濃度的起始水平的重量克分子滲透壓濃度水平的提高被限制在小于約400 mOsmol/kg ；和(ν)在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期或早期生產(chǎn)期期間從生物反應(yīng)器收獲蛋白質(zhì)產(chǎn)物。最后，本發(fā)明可以特征在于一種控制進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)基的重量克分子滲透壓濃度水平的方法，包括步驟(i)在接種期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基提供二氧化碳和碳酸氫鈉緩沖劑來(lái)建立細(xì)胞培養(yǎng)基中碳酸氫鹽與溶解二氧化碳的指定平衡水平和重量克分子滲透壓濃度的初始水平；(ii)在生長(zhǎng)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基添加營(yíng)養(yǎng)物， 從而提高細(xì)胞培養(yǎng)基的重量克分子滲透壓濃度水平；(iii)在生長(zhǎng)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基添加酸或堿來(lái)將PH值水平維持在指定的范圍內(nèi)；(iv)在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期期間從細(xì)胞培養(yǎng)基脫除溶解二氧化碳，其中在生長(zhǎng)期期間細(xì)胞培養(yǎng)基中的溶解二氧化碳的濃度被維持在10%或更低，其中在生長(zhǎng)期的部分期間細(xì)胞培養(yǎng)基中重量克分子滲透壓濃度水平降低，從生長(zhǎng)期的起始到生長(zhǎng)期的結(jié)尾重量克分子滲透壓濃度水平的總體提高小于約 400 mOsmol/kg。附圖的簡(jiǎn)要描述
根據(jù)連同以下的圖畫中呈現(xiàn)的、以下的本發(fā)明的更詳細(xì)的說(shuō)明，本發(fā)明的上述和其他方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得更加明顯，其中
附

圖1是描繪在具有中度水平重量克分子滲透壓濃度的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的三個(gè)不同運(yùn)行的溶解二氧化碳百分比，其中三個(gè)運(yùn)行包括具有高峰值溶解二氧化碳水平的一個(gè)、具有中度峰值溶解二氧化碳水平的另一個(gè)和具有低峰值溶解二氧化碳水平的第三個(gè)；
附圖2A是描繪附圖1的具有中度重量克分子滲透壓濃度的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的三個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中活細(xì)胞密度的圖形；
附圖2B是描繪附圖1的具有中度重量克分子滲透壓濃度的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的三個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的按照百分比的細(xì)胞生存力的圖形；
附圖2C是描繪附圖1的具有中度重量克分子滲透壓濃度的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的三個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中總細(xì)胞密度的圖形；
附圖3A是描繪附圖1的具有中度重量克分子滲透壓濃度的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的三個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中生物產(chǎn)物濃度的圖形；
附圖3B是描繪利用當(dāng)前的動(dòng)態(tài)氣體控制(Dynamic Gas Control，DGC)過(guò)程，如附圖1、 2和3A中描述的典型的低溶解二氧化碳哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的重量克分子滲透壓濃度分布的圖形。附圖3C是描繪附圖1、2和3A中描述的基線哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的重量克分子滲透壓濃度分布的圖形。
附圖4是描繪具有一般恒定的或穩(wěn)定的重量克分子滲透壓濃度的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩個(gè)不同運(yùn)行的、作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中溶解二氧化碳的百分比的圖形，其中第一個(gè)運(yùn)行包括低的峰值溶解二氧化碳水平，第二個(gè)運(yùn)行包括中度的總體峰值溶解二氧化碳水平。附圖5是描繪附圖4的具有中度重量克分子滲透壓濃度和一般恒定或穩(wěn)定的溶解二氧化碳水平的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中活細(xì)胞密度的圖形；
附圖6是描繪附圖4的具有中度重量克分子滲透壓濃度和一般恒定或穩(wěn)定的溶解二氧化碳水平的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中生物產(chǎn)物滴度或濃度的圖形；
附圖7是描繪哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)和生產(chǎn)期期間溶解二氧化碳分布的圖形； 附圖8是描繪其中維持溶解二氧化碳的不同的、但一般恒定的水平的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系另外兩個(gè)不同運(yùn)行中，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中活細(xì)胞密度的圖形；
附圖9是描繪附圖8的具有不同但一般恒定的溶解二氧化碳水平的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩個(gè)不同運(yùn)行的，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中重量克分子滲透壓濃度的圖形；
附圖10是描繪附圖8的具有不同的但一般恒定的溶解二氧化碳水平的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中活細(xì)胞百分比的圖形；
附圖11是描繪附圖8的具有不同的但一般恒定的溶解二氧化碳水平的過(guò)程中哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的兩種個(gè)不同運(yùn)行中、作為按天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中生物產(chǎn)物產(chǎn)量或滴度的圖形；
附圖12是描繪與標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行相比較的、利用當(dāng)前的動(dòng)態(tài)氣體控制(DGC)過(guò)程的兩個(gè)不同運(yùn)行的，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中溶解二氧化碳的圖形；
附圖13是描繪與標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行相比較的、利用當(dāng)前的動(dòng)態(tài)氣體控制(DGC)過(guò)程的兩個(gè)不同運(yùn)行的，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生存力的圖形；
附圖14是描繪與標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行相比較的、利用當(dāng)前的動(dòng)態(tài)氣體控制(DGC)過(guò)程的兩個(gè)不同運(yùn)行的，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中活細(xì)胞密度的圖形；
附圖15是描繪與標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行相比較的、利用當(dāng)前的動(dòng)態(tài)氣體控制(DGC)過(guò)程的兩個(gè)不同運(yùn)行的，作為按照天數(shù)的時(shí)間的函數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中生物產(chǎn)物產(chǎn)量或滴度的圖形；
附圖16是描繪具有變化的重量克分子滲透壓濃度水平的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中IgG滴度對(duì)比峰值(10)2的趨勢(shì)的圖表；
附圖17是描繪具有低水平溶解二氧化碳的DGC型細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中IgG滴度對(duì)比最大重量克分子滲透壓濃度的趨勢(shì)的圖表；
附圖18是提供了在重量克分子滲透壓濃度和溶解二氧化碳的不同組合的各種細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程運(yùn)行期間采集的數(shù)據(jù)的表格；
附圖19A是描繪了利用當(dāng)前的動(dòng)態(tài)氣體控制(DGC)過(guò)程在第一次樣品運(yùn)行期間，對(duì)配置在生物反應(yīng)器中的上流式葉輪的轉(zhuǎn)速的調(diào)整，以及在生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面上方的頂部空間中含氧的掃掠氣的體積流量的調(diào)整的圖形；和
附圖19B是描繪了利用當(dāng)前的動(dòng)態(tài)氣體控制(DGC)過(guò)程在第二次樣品運(yùn)行期間，對(duì)配置在生物反應(yīng)器中的上流式葉輪的轉(zhuǎn)速的調(diào)整，以及在生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面上方的頂部空間中含氧的掃掠氣的體積流量的調(diào)整的另一個(gè)圖形。詳細(xì)說(shuō)明
二氧北石炭、DH龍好灘碰齡胃
大部分商業(yè)規(guī)模的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)轉(zhuǎn)入進(jìn)料-分批過(guò)程，控制以維持相對(duì)恒定的重量克分子滲透壓濃度、PH值和溶解二氧化碳水平是幾乎不可能的。在進(jìn)料-分批過(guò)程中添加營(yíng)養(yǎng)物和細(xì)胞強(qiáng)化劑將總是傾向于提高細(xì)胞培養(yǎng)物重量克分子滲透壓濃度，而PH 值和溶解二氧化碳水平在整個(gè)過(guò)程中不斷變化。例如，在指數(shù)生長(zhǎng)期期間產(chǎn)生的二氧化碳可超出了大多數(shù)當(dāng)前的生物反應(yīng)器的二氧化碳脫除能力，引起溶解二氧化碳水平的持續(xù)提高。溶解二氧化碳水平的這種繼續(xù)提高常常需要添加堿來(lái)中和溶解二氧化碳對(duì)PH值的影響，因?yàn)榭刂萍?xì)胞培養(yǎng)基的PH值被看作是管理任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的最關(guān)鍵參數(shù)之一。提高溶解二氧化碳和添加堿都進(jìn)一步提高了細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液的重量克分子滲透壓濃度。簡(jiǎn)而言之，細(xì)胞培養(yǎng)基或溶液中的 PH值、重量克分子滲透壓濃度和溶解二氧化碳水平都是緊密地相互聯(lián)系的。許多本領(lǐng)域技術(shù)人員相信最低水平的溶解二氧化碳和重量克分子滲透壓濃度將提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的最佳運(yùn)行條件。然而，近期的研究和在此公開的某些經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)另外地表明，溶解二氧化碳的最佳水平和最佳重量克分子滲透壓濃度仍然需要對(duì)每種獨(dú)立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程來(lái)確定。當(dāng)二氧化碳溶于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中時(shí)，它形成HC03_，一種生長(zhǎng)的細(xì)胞的關(guān)鍵離子。隨著溶解二氧化碳建立與HC03_離子的平衡，PH值被降低。對(duì)HC03_的需求與它的緩沖作用無(wú)關(guān)，但是由于二氧化碳、HCO3-和pH值是密切聯(lián)系的，難以限定溶解的二氧化碳的最佳水平和對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的直接影響。當(dāng)在開放的容器中孵育細(xì)胞時(shí)，一般使用95%空氣和 5%二氧化碳的氣體混合物。最初根據(jù)在肺的肺泡腔中存在的二氧化碳來(lái)選擇二氧化碳的濃度。這種二氧化碳濃度是用于肺成纖維細(xì)胞的研究的，但是現(xiàn)在變?yōu)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的典型的二氧化碳濃度。氣相二氧化碳張力將作為溫度的函數(shù)直接地調(diào)節(jié)溶解二氧化碳的濃度。這種調(diào)節(jié)隨后產(chǎn)生H2CO3,其根據(jù)以下反應(yīng)解離
H1O + CO2 O H1CO3 OH+ + HCOf............ (ι)
HCO3-具有十分低的解離常數(shù)，僅產(chǎn)生低濃度的氫離子，獲得僅中度降低的溶液pH值。 提高大氣的二氧化碳的凈結(jié)果是通過(guò)向右移動(dòng)上述(1)中顯示的平衡的系列來(lái)降低PH值。 為了維持固定的PH值，堿，例如碳酸氫鈉被用于中和提高的二氧化碳張力的作用
NaHCQ3 ONa+ + HCO..................⑵
提高的HCO3-濃度抵抗了更高的溶解二氧化碳水平的作用，將上述(1)中的平衡向左側(cè)推動(dòng)，直到平衡可以在碳酸氫鹽系統(tǒng)的PH 7. 4處建立。
總之，在開放容器中的細(xì)胞培養(yǎng)物需要在二氧化碳的大氣中孵育，其濃度與培養(yǎng)基中的碳酸氫鈉平衡。在密封的燒瓶中生長(zhǎng)到中高濃度(IX IO5個(gè)細(xì)胞/mL)的細(xì)胞可能不需要二氧化碳添加到氣相，條件是碳酸氫鹽濃度被保持很低廣4 mM)特別是如果細(xì)胞是高酸生產(chǎn)者的話。然而，在更低的細(xì)胞濃度下(例如，在克隆或接種期間)，以及對(duì)于某些原代培養(yǎng)物，必需向密封燒瓶的氣相添加二氧化碳。當(dāng)需要出口來(lái)容許二氧化碳的平衡化或它的逃逸時(shí)(如對(duì)于高酸生產(chǎn)者)，必需使覆蓋物保持松弛，或使用二氧化碳可透過(guò)的覆蓋物。 孵化器的大部分用95%空氣和5% 二氧化碳的混合物吹掃。在良好控制的生物反應(yīng)器中，將至少在開始時(shí)需要二氧化碳來(lái)將培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)闹?。將需要其他的二氧化碳?lái)中和孵化器中小的容器中生長(zhǎng)的接種物，因?yàn)檫@些傾向于具有比生物反應(yīng)器設(shè)置點(diǎn)更高的PH值。使用二氧化碳的這種起始PH值調(diào)整將提高起始批次的重量克分子滲透壓濃度。隨著在分批過(guò)程中培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期，它們變?yōu)樽畲蟠x活性的，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生它最大的二氧化碳輸出。當(dāng)細(xì)胞密度低時(shí)，大部分二氧化碳可以通過(guò)用空氣噴射發(fā)酵液或用覆蓋氣或空氣掃掠生物反應(yīng)器的頂部空間來(lái)除去。然而，進(jìn)入分批循環(huán)幾天后， 二氧化碳產(chǎn)生將超過(guò)典型的生物反應(yīng)器的正常二氧化碳清除能力。細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)量的二氧化碳將提高溶解二氧化碳水平并降低溶液PH值。為了維持優(yōu)選的pH值，需要添加額外的堿，產(chǎn)生過(guò)多的溶解二氧化碳和不期望的高重量克分子滲透壓濃度。由于二氧化碳產(chǎn)生和脫除速率之間的不平衡的次優(yōu)條件隨著擴(kuò)大到更大的生物反應(yīng)器而變得更為嚴(yán)重。首先，隨著常規(guī)的生物反應(yīng)器大小增加，表面積比體積比降低。對(duì)于相同的覆蓋氣比反應(yīng)器體積，在液體表面處二氧化碳脫除的有效性被大大降低。優(yōu)選的二氧化碳脫除系統(tǒng)和方法的實(shí)例在美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/086665中公開。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的pH倌優(yōu)化
哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的PH值設(shè)置點(diǎn)可以顯著地影響細(xì)胞培養(yǎng)性能。已知細(xì)胞培養(yǎng)基PH值影響許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型的細(xì)胞內(nèi)酶活性。降低的pH值降低了比葡萄糖消耗和乳酸生成率，降低了葡萄糖耗盡的風(fēng)險(xiǎn)或乳酸的毒性水平。在典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中較低的PH值設(shè)置點(diǎn)是約7. 0 ；已知低于約6. 8的pH值抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。還已知中間或中度PH值影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率和比生產(chǎn)率，其最終影響總體培養(yǎng)物生產(chǎn)力。過(guò)低或過(guò)高的PH值可能殺死細(xì)胞。約7. 0到7. 4的pH值范圍通常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程。常常在過(guò)程期間發(fā)生的PH值的大幅變動(dòng)，例如，當(dāng)重新補(bǔ)足培養(yǎng)基時(shí)，對(duì)細(xì)胞具有不良作用。控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的PH值現(xiàn)今是特別重要的，因?yàn)槌Ｒ?guī)地達(dá)到高細(xì)胞密度(>1 X IO6個(gè)細(xì)胞/mL)。 沒有適當(dāng)?shù)腜H值控制，當(dāng)細(xì)胞這樣濃縮時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵液可能快速地變?yōu)樗嵝?。不同類型的哺乳?dòng)物細(xì)胞可能具有不同的生長(zhǎng)最佳pH值。一般地，人類成纖維細(xì)胞在比被建立的細(xì)胞(pH 7. 0-7. 4)更高的pH值(7. 6-7. 8)下生長(zhǎng)，在7. 2-7. 4的pH值下培養(yǎng)原代細(xì)胞是常見的。在低培養(yǎng)密度下人類包皮成纖維細(xì)胞(例如，F(xiàn)S-4)生長(zhǎng)的最佳 PH值，比人類肺成纖維細(xì)胞(例如，MRC-5)的生長(zhǎng)最佳pH值更為堿性。當(dāng)在約IO5個(gè)細(xì)胞 /mL或更小的密度下培養(yǎng)生長(zhǎng)期期間的這些細(xì)胞時(shí)，對(duì)于FS-4，pH值應(yīng)當(dāng)是約7. 7到7. 8， 對(duì)MRC-5細(xì)胞約7. 5到7. 6。對(duì)于CHO細(xì)胞，通常有益的是在附著期間在約7. 0的pH值下培養(yǎng)細(xì)胞。在幾個(gè)小時(shí)之后，CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的pH值可以提高到稍微更高的值。
將細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵液維持在約7. O或更高的pH值代表了對(duì)控制溶解ニ氧化碳水平 的努カ的另ー個(gè)挑戰(zhàn)。因?yàn)楗搜趸伎梢耘c水反應(yīng)，它可以以四種形式的任ー存在于液相 中ra2、H2C03、HC03-_ CO32-。上文式(1)中的平衡關(guān)系表明，在約5.0或以下的pH值下，幾乎所有的溶解ニ氧 化碳是じ仏的形式。在約7.0到9.0之間的pH值下，碳酸氧鹽是碳的主要形式。最后，在 約ll.O或更高的pH值下，幾乎所有的是碳酸鹽。由于大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的pH值 ー般被控制在約pH 7.0到pH 7.4之間，與其中pH值可以更低得多的微生物發(fā)酵過(guò)程相比 時(shí)，ニ氧化碳除去ー般是更困難的。為了從pH約7. O和7. 4之間的細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵液除去溶解ニ氧化碳，限制步驟可 以是化學(xué)的或物理的。由于僅溶解的ニ氧化碳分子被轉(zhuǎn)運(yùn)跨越氣-液界面，碳酸氧鹽必需 重新締合以形成ニ氧化碳分子。將上文的式(1)分成它的兩個(gè)部分，注意的是，以下作為式 (3)和(4)列出的逆反應(yīng)ー般是快速的，而由式(5)代表的反應(yīng)的第ー部分是慢得多的。
權(quán)利要求
1.一種提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，包括步驟通過(guò)經(jīng)由生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面處的表面氣體交換除去溶解的二氧化碳，在整個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期中將細(xì)胞培養(yǎng)基中的溶解二氧化碳維持在小于約10%的溶解二氧化碳濃度的水平下，其中細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間被維持在特定細(xì)胞的最佳范圍內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間被維持在特定細(xì)胞的最佳范圍內(nèi)。
2.一種提高進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，包括步驟在具有細(xì)胞培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中接種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞培養(yǎng)基具有與溶解二氧化碳平衡的指定水平的碳酸氫鹽和初始水平的重量克分子滲透壓濃度；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基周期性地添加營(yíng)養(yǎng)物；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期或生產(chǎn)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基周期性地添加酸或堿來(lái)將pH水平維持在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的指定范圍內(nèi)，而不添加二氧化碳?xì)怏w；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期或生產(chǎn)期期間調(diào)整生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面上方頂部空間中含氧掃掠氣的體積流量，來(lái)促進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面處的表面氣體交換；和在生長(zhǎng)期或生產(chǎn)期期間調(diào)整置于生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面下方的上流式葉輪的轉(zhuǎn)速；其中細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解二氧化碳通過(guò)經(jīng)由表面氣體交換脫除二氧化碳在整個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期或生產(chǎn)期維持在低于約10%的溶解二氧化碳濃度的穩(wěn)定水平；其中細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間維持在特定細(xì)胞的最佳范圍內(nèi)；和其中所述進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的產(chǎn)物產(chǎn)量被提高。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述溶解二氧化碳的濃度在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間穩(wěn)定在約3%到10%之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中重量克分子滲透壓濃度的最佳范圍在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間是約300 mOsmo/kg和700 mOsmo/kg之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)基包括在接種期期間的二氧化碳和碳酸氫鈉緩沖劑，細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值在生長(zhǎng)期或生產(chǎn)期通過(guò)向細(xì)胞培養(yǎng)基添加酸或堿來(lái)維持，其中避免額外的二氧化碳?xì)怏w的添加用于PH值調(diào)整。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程是進(jìn)料-分批過(guò)程，細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期期間隨著營(yíng)養(yǎng)物的添加而提高，細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度在此后不久降低。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)基的溶解氧的濃度通過(guò)生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面處的表面氣體交換維持在特定細(xì)胞的最佳范圍內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)基中的溶解二氧化碳的濃度和溶解氧的濃度通過(guò)在生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間調(diào)整生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面上方頂部空間中含氧的掃掠氣的體積流量來(lái)維持在最佳范圍內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)基中的溶解二氧化碳的濃度和溶解氧的濃度通過(guò)在生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間調(diào)整生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面下方配置的上流式葉輪的轉(zhuǎn)速來(lái)維持在最佳范圍內(nèi)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程是進(jìn)料-分批過(guò)程， 從生長(zhǎng)期的開始到生產(chǎn)期的結(jié)尾所述細(xì)胞培養(yǎng)基中重量克分子滲透壓濃度的提高小于約 300 m0smol/kgo
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基的頂部表面基本上沒有泡沫。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度隨著營(yíng)養(yǎng)物的添加而提高，所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度在此后不久降低。
13.—種控制進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)基的PH值水平的方法，包括步驟在接種期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基提供二氧化碳和碳酸氫鈉緩沖劑來(lái)建立細(xì)胞培養(yǎng)基中碳酸氫鹽與溶解二氧化碳的指定平衡水平和重量克分子滲透壓濃度的初始水平；在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間從細(xì)胞培養(yǎng)基脫除溶解二氧化碳；在生長(zhǎng)期期間和任選地在生產(chǎn)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基添加營(yíng)養(yǎng)物； 在生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基添加酸或堿來(lái)將PH值水平維持在指定范圍內(nèi)， 而不添加二氧化碳?xì)怏w用于PH值調(diào)整；其中細(xì)胞培養(yǎng)基中的重量克分子滲透壓濃度水平維持在指定范圍內(nèi)，從生長(zhǎng)期的開始到生產(chǎn)期的結(jié)尾重量克分子滲透壓濃度水平的提高小于400 mOsmol/kg ；和其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基中的溶解二氧化碳的濃度在生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間維持在10%或更低。
14.一種在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期期間延長(zhǎng)細(xì)胞生存力和提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物產(chǎn)量的方法，包括步驟在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期期間用水稀釋細(xì)胞培養(yǎng)基，來(lái)降低細(xì)胞培養(yǎng)基中廢物的毒性影響；在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基添加補(bǔ)充的營(yíng)養(yǎng)物來(lái)補(bǔ)償水的稀釋效應(yīng)；在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期期間將細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解二氧化碳的濃度維持在10%或更低，并將細(xì)胞培養(yǎng)基中重量克分子滲透壓濃度水平和pH值水平維持在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最佳范圍內(nèi)，其中由于在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生產(chǎn)期期間哺乳動(dòng)物細(xì)胞的延長(zhǎng)的細(xì)胞生存力蛋白質(zhì)產(chǎn)物產(chǎn)量被提高。
15.一種改善產(chǎn)自進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的純度的方法，包括步驟在具有細(xì)胞培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中接種哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞培養(yǎng)基具有與溶解二氧化碳平衡的指定水平的碳酸氫鹽和初始水平的重量克分子滲透壓濃度；向細(xì)胞培養(yǎng)基添加營(yíng)養(yǎng)物從而提高細(xì)胞培養(yǎng)基的重量克分子滲透壓濃度水平來(lái)加速來(lái)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)生產(chǎn)；向細(xì)胞培養(yǎng)基添加酸或堿來(lái)將PH值水平維持在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的指定范圍內(nèi)；在整個(gè)進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中從細(xì)胞培養(yǎng)基脫除溶解二氧化碳，其中細(xì)胞培養(yǎng)基中溶解二氧化碳的濃度維持在10%或更低；其中自重量克分子滲透壓濃度的起始水平的重量克分子滲透壓濃度水平的提高被限制在小于400 mOsmol/kg ；和在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期或早期生產(chǎn)期期間從生物反應(yīng)器收獲蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
16. 一種控制進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)基的重量克分子滲透壓濃度水平的方法，包括步驟在接種期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基提供二氧化碳和碳酸氫鈉緩沖劑來(lái)建立細(xì)胞培養(yǎng)基中碳酸氫鹽與溶解二氧化碳的指定平衡水平和重量克分子滲透壓濃度的初始水平；在生長(zhǎng)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基添加營(yíng)養(yǎng)物，從而提高細(xì)胞培養(yǎng)基的重量克分子滲透壓濃度水平；在生長(zhǎng)期期間向細(xì)胞培養(yǎng)基添加酸或堿來(lái)將PH值水平維持在指定的范圍內(nèi)； 在進(jìn)料-分批哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)期期間從細(xì)胞培養(yǎng)基脫除溶解二氧化碳， 其中在生長(zhǎng)期期間細(xì)胞培養(yǎng)基中的溶解二氧化碳的濃度被維持在10%或更低；其中在生長(zhǎng)期的部分期間細(xì)胞培養(yǎng)基中重量克分子滲透壓濃度水平降低，從生長(zhǎng)期的起始到生長(zhǎng)期的結(jié)尾重量克分子滲透壓濃度水平的總體提高小于約300 mOsmol/kg。
全文摘要
提供了控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中溶解二氧化碳的水平和限制重量克分子滲透壓濃度的方法來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)、生存力和密度，以及提高生物產(chǎn)物濃度和產(chǎn)量。溶解二氧化碳水平和pH值的這種控制以及產(chǎn)生的限制哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中重量克分子滲透壓濃度的能力通過(guò)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間采用可選擇的pH值控制策略和CO2脫除技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這樣的pH值控制技術(shù)和二氧化碳脫除沒有泡沫地、對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒有或很小損害地發(fā)生。
文檔編號(hào)C12Q3/00GK102191275SQ201110031048
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者T. Y. 程 A., 古普塔 A., 赫尼克 B., 格林特 N., 周 Y. 申請(qǐng)人:普萊克斯技術(shù)有限公司