專(zhuān)利名稱：新的干擾素－胸腺肽融合蛋白及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)和藥物領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及人α干擾素2b(HuIFNα2b，以下簡(jiǎn)稱IFN)與人胸腺肽(Thymosin，以下簡(jiǎn)稱THY)的融合蛋白，編碼該融合蛋白的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞，用基因工程制備該融合蛋白的方法，以及該融合蛋白在如病毒性感染等疾病治療和機(jī)體免疫增強(qiáng)中的應(yīng)用。
干擾素首先發(fā)現(xiàn)于1957年，即Isaaca和Lindenmann稱之為能夠誘導(dǎo)對(duì)同源或異源病毒性感染產(chǎn)生抗性的細(xì)胞產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)40多年的研究，干擾素的兩個(gè)大類(lèi)(IFN-α/β或稱為I型IFN和IFN-γ或稱為II型IFN)的基因、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其受體基因、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)均有了較為深入的研究。在此期間發(fā)現(xiàn)了許多IFN的生物活性，如誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、激活自然殺傷細(xì)胞等等。然而其中抗病毒活性最為公認(rèn)。IFN-α是由白細(xì)胞產(chǎn)生，具有較強(qiáng)的抑制病毒繁殖、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，以及免疫調(diào)節(jié)等作用。目前IFN-α已被批準(zhǔn)用于病毒性感染等多種疾病的治療。
Capon D.J.等人報(bào)道，HuIFNα2b可提高免疫能力，從而起到抗病毒治療效果(Capon D.J.，Shepard，H.M.and Goeddel D.V.，Mol.Cell.Biol.5(4)，768-779，1985)。
胸腺肽(Thymosin)，也稱胸腺素，是Abraham等于1965年首先從胸腺中分離得到的。胸腺肽是一種具有促進(jìn)T-淋巴細(xì)胞分化、成熟和增強(qiáng)細(xì)胞免設(shè)功能的由28個(gè)氨基酸組成的多肽。該活性多肽目前已廣泛應(yīng)用于治療免疫缺陷、腫瘤、病毒性感染和自身免疫病等等疾病。
因此IFN-α和THY具有相似和相輔相成的生物活性，如兔調(diào)節(jié)、病毒性感染和腫瘤等疾病的治療等。然而，目前IFN-α和THY制劑都是單獨(dú)生產(chǎn)，臨床上IFN-α和THY也都是單獨(dú)給藥，這樣導(dǎo)致了藥物成本高。此外，IFN-α和THY的制備(尤其是分離純化)也較繁瑣。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)新的具有IFN-α和THY兩者生物活性的藥物。此外，本領(lǐng)域還迫切需要開(kāi)發(fā)成本低廉和或步驟簡(jiǎn)便的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供一種新的具有IFN-α和THY兩者生物活性的藥物，它是IFN-α和THY的融合蛋白。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼所述融合蛋白的DNA、含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的另一目的是提供一種成本低廉和或步驟簡(jiǎn)便的生產(chǎn)所述IFN-THY融合蛋白的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種融合蛋白，它包括人α干擾素2b的氨基酸序列、人胸腺肽的氨基酸序列、以及位于人α干擾素2b氨基酸序列和人胸腺肽氨基酸序列之間的1-20個(gè)氨基酸的連接肽序列。
較佳地，所述的接頭序列含4-10個(gè)氨基酸。更佳地，所述的融合蛋白包括SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的DNA分子，它編碼本發(fā)明上述的融合蛋白。較佳地，所述的DNA分子編碼包括SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列的融合蛋白。更佳地，所述的DNA分子包括SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述DNA分子的載體。較佳地，所述的載體包括重組家蠶核型多角體病毒(Bobyx Mori Nuclear polyhedrosis virus)BacITCGMCC No.0504。還提供了含有上述載體的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明融合蛋白的方法，它包括步驟在適合表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)上述的宿主細(xì)胞，或者培養(yǎng)含上述宿主細(xì)胞的動(dòng)物，從而表達(dá)出所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，它包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的本發(fā)明的融合蛋白。
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，將IFN基因和THY基因融合在一起，并在家蠶幼蟲(chóng)中進(jìn)行高效表達(dá)，產(chǎn)生IFN-THY的融合蛋白，這樣既保留了IFN的各種生物活性，又使其帶上了THY的刺激機(jī)體增強(qiáng)免疫的活性，使其成為一種新型的病毒性感染治療、抑制病毒復(fù)制和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的藥物。
定義如本文所用，術(shù)語(yǔ)“干擾素和胸腺肽的融合蛋白”、“IFN-THY融合蛋白”等可互換使用，都指由干擾素氨基酸序列和胸腺肽氨基酸序列融合而成的蛋白，其中在兩者之間可以有或者沒(méi)有連接肽序列。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)融合蛋白中“干擾素氨基酸序列”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，該序列與天然的或變異的干擾素具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有與天然干擾素基本上相同的生物活性。優(yōu)選的干擾素氨基酸序列包括α干擾素，更佳地α干擾素2b，最佳地天然的人α干擾素2b的氨基酸序列。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)融合蛋白中“胸腺肽氨基酸序列”指在所述融合蛋白中的一部分氨基酸序列，該序列與天然的或變異的胸腺肽具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有與天然胸腺肽基本上相同的生物活性。優(yōu)選的胸腺肽氨基酸序列是人的天然胸腺肽序列。
干擾素和胸腺肽的序列可以源自人，也可以源自非人的動(dòng)物。然而，優(yōu)選的是人的天然序列。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“連接肽”指位于干擾素氨基酸序列和胸腺肽氨基酸序列之間的、起連接作用的短肽。連接肽的長(zhǎng)度通常為1-20個(gè)氨基酸，較佳地為3-10個(gè)氨基酸，最佳地為4-6個(gè)氨基酸。技術(shù)人員可安裝本領(lǐng)域常規(guī)方法設(shè)計(jì)連接肽。通常，連接肽不影響或嚴(yán)重影響干擾素氨基酸序列和胸腺肽氨基酸序列形成正確的折疊和空間構(gòu)象。
編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR擴(kuò)增或合成的方法獲得干擾素和或胸腺肽的編碼DNA序列，然后將其拼接在一起，形成編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。
在獲得了編碼本發(fā)明新融合蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過(guò)分離純化得到本發(fā)明的新的融合蛋白。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”包括質(zhì)粒、粘粒、表達(dá)載體、克隆載體、病毒載體等。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，更佳地是家蠶細(xì)胞。
在獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞后，可在適合表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，從而表達(dá)出融合蛋白。然后再分離出表達(dá)的融合蛋白。
然而，更佳地的表達(dá)系統(tǒng)是家蠶表達(dá)系統(tǒng)。目前已經(jīng)證明，由于有家蠶淋巴血本身的大量蛋白的保護(hù)作用，和一些未知機(jī)理的作用，家蠶表達(dá)生產(chǎn)的藥物，可以直接經(jīng)過(guò)口服給藥進(jìn)入血液循環(huán)。因此，家蠶表達(dá)生產(chǎn)藥物不僅可以免除病人的注射的痛苦和被感染的危險(xiǎn)，而且可以免除藥物的分離和純化過(guò)程，大大降低藥物的生產(chǎn)成本。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將IFN-THY融合基因克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，并提供了含IFN-THY融合基因的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒。用所述重組昆蟲(chóng)桿狀病毒感染家蠶，可使家蠶產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白。
本發(fā)明的IFN-THY融合蛋白具有IFN活性和THY活性。在一個(gè)實(shí)施例中，將家蠶淋巴血經(jīng)5000rpm 5分鐘離心后取上清，直接用于IFN活性測(cè)定。結(jié)果表明，96小時(shí)表達(dá)樣品IFN活力為3.72×104IU/ml，110小時(shí)表達(dá)樣品為3.10×105IU/ml。同時(shí)還將淋巴血上清進(jìn)行了胸腺肽玫瑰花結(jié)法活性測(cè)定。結(jié)果表明，24-110小時(shí)表達(dá)樣品的玫瑰花結(jié)形成率均在10％以上(見(jiàn)圖6)，即表明均有明顯的胸腺肽活性。
在本發(fā)明的另一方面，提供了含有外源IFN-THY融合基因的家蠶。在所述家蠶的部分或全部細(xì)胞中，含有外源的外源IFN-THY融合基因。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包括有效量的本發(fā)明的新型IFN-THY融合蛋白，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在制備這些組合物時(shí)，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋?zhuān)虬诳梢阅z囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時(shí)，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括濕潤(rùn)劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。
組合物可制成單元或多元?jiǎng)┬?。各劑型包含為了產(chǎn)生所期望的治療效應(yīng)而計(jì)算出預(yù)定量的活性物質(zhì)，以及合適的藥劑學(xué)賦形劑。
該藥物組合物可根據(jù)待治療的疾病并以對(duì)病人有益的劑量(取決于體重和其他考慮因素)進(jìn)行施用，這可以由醫(yī)務(wù)人員確定。此外，本發(fā)明的融合蛋白還可與其他治療藥物聯(lián)用。
綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下(1)以基因工程的方法制備了IFN和THY的融合蛋白，避免了化學(xué)交聯(lián)法存在的操作繁瑣、交聯(lián)效率低、產(chǎn)物不均一、蛋白質(zhì)容易失活以及成本較高等缺點(diǎn)；(2)在一種載體上同時(shí)生產(chǎn)IFN和THY，避免了重復(fù)勞動(dòng)；(3)家蠶表達(dá)的蛋白類(lèi)藥物可以直接口服，避免了蛋白質(zhì)分離純化的高成本操作，以及為病人解除了注射的痛苦的被感染的威脅；(4)家蠶幼蟲(chóng)只需用桑葉喂養(yǎng)，成本很低。
家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)的IFN-THY融合蛋白，既具有IFN的生物活性，又具有THY的生物活性，是一種如病毒性感染等疾病治療和增強(qiáng)機(jī)體免疫的新型藥物。


圖1是IFN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。
圖2顯示了含IFN-THY融合基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)pET-IT。
圖3顯示了含IFN-THY融合基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK-IT。
圖4顯示了第二輪噬斑篩選的Southern點(diǎn)雜交結(jié)果。
圖5是家蠶表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖譜，其中泳道1-6分別是重組病毒感染后不同時(shí)間的樣品，泳道7為分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
圖6是家蠶表達(dá)產(chǎn)物的THY活性的條形示意圖，其中對(duì)照為生理鹽水和BmPAK感染的家蠶血淋巴。
圖7是本發(fā)明IFNα2b/THY融合蛋白的氨基酸序列及其編碼DNA序列。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1IFN-THY融合基因的合成以及大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為了使IFN-THY融合蛋白具有正確的空間構(gòu)象，以GGGGS為連接肽使IFN和THY連接在一起。根據(jù)IFN基因序列以及連接肽的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)引物IFNPRI1和IFNPRI2，其核苷酸序列分別為IFNPRI15’GCCATATGTG CGATCTGCCT CAAACC 3’(SEQ ID NO3)IFNPRI25’ATGGATCCAC CACCGCCTTC CTTACTTCTT AAACTTTC 3’(SEQ ID NO4)其中，IFNPRI1為IFN成熟蛋白N端的編碼序列；IFNPRI2為IFN C端以及連接肽編碼序的互補(bǔ)序列。
以IFNPRI1和IFNPRI2為引物，含IFN基因的pSK-IFN質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增帶有連接肽核苷酸序列的IFN基因序列，在其5’端和3’端分別引入NdeI和BamHI酶切位點(diǎn)。PCR條件為94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)，第一個(gè)循環(huán)94℃變性5min，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸10min，結(jié)果獲得了約500bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖純化后，克隆到pSK(+)的EcoRV位點(diǎn)中，構(gòu)建質(zhì)粒pSK-IFNL。經(jīng)測(cè)序分析證明IFN基因和連接肽核苷酸序列完全正確。
用NdeI和BamHI雙酶切，分離pSK-IFNL質(zhì)粒上的IFN及連接肽核苷酸序列，并與事先經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切的pET-28a(+)相連接，構(gòu)建形成質(zhì)粒pET-IFNL。
根據(jù)THY的氨基酸序列，并按真核生物偏愛(ài)的密碼子設(shè)計(jì)合成了THY1和THY2兩個(gè)片段，其核苷酸序列分別為
THY15’GGCGGATCCG GCTCTGACGC TGCTGTGGAC ACCTCTTCTG AAATCACCACCAAGGACCTG AAGGAAAAGA AGG 3’(SEQ ID NO5)THY25’CCAAGGACCT GAAGGAAAAG AAGGAAGTGG TGGAAGAAGC TGAAAACGGCTGAAGCTT 3’(SEQ ID NO6)其中，THY1為T(mén)HY N端的編碼序列，引入BamHI酶切位點(diǎn)；THY2為T(mén)HY C端編碼序列的互補(bǔ)序列，引入XhoI酶切位點(diǎn)。
將THY1和THY2兩個(gè)片段1∶1混合，加入dNTP和Klenow酶進(jìn)行補(bǔ)平，克隆到pSK(+)的EcoRV位點(diǎn)中，構(gòu)建質(zhì)粒pSK-THY。經(jīng)測(cè)序分析證明合成的THY基因序列正確。
用BamHI和XhoI雙酶切，分離pSK-THY質(zhì)粒上的THY基因，并與事先經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切的pET-IFNL質(zhì)粒相連接，構(gòu)建含IFN-THY融合基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-IT(圖2)。該質(zhì)粒在從5’至3’方向依次含有IFN基因，GGGGS連接肽編碼序列，以及THY基因。
IFN-THY融合基因的DNA序列如SEQ ID NO1所示，其中編碼區(qū)為第1-594位。所編碼的IFN-THY融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，共198個(gè)氨基酸，分子量為22kDa。
實(shí)施例2含IFN-THY融合基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK-IT的構(gòu)建將含IFN-THY融合基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-IT先用NdeI酶切，然后用Klenow酶補(bǔ)平，再用XhoI酶切，用低熔點(diǎn)瓊脂糖分離IFN和THY的融合基因片段，并與事先經(jīng)BamHI酶切并用Klenow酶補(bǔ)平后再用XhoI酶切的pBacPAK8相連接，構(gòu)建含IFN-THY融合基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK-IT(圖3)。該質(zhì)粒在從5’至3’方向依次含有IFN基因，GGGGS連接肽編碼序列，以及THY基因。
實(shí)施例3含IFN-THY融合基因的重組昆蟲(chóng)桿狀病毒的獲得取5微升含IFN-THY融合基因的昆蟲(chóng)桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacPAK-IT和6微升經(jīng)Bsu36I酶切線性化的修飾病毒BmBacPAK6，加入100微升無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基混均。取6微升Lipofectin加入100微升無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基混均。將兩者混勻，室溫放置15分鐘，加入800微升無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基混勻。將事先培養(yǎng)在35mm培養(yǎng)皿中的Bm N細(xì)胞用無(wú)血清的TC-100培養(yǎng)基洗滌兩次，并逐滴加入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和Lipofectin混合物，27℃培養(yǎng)4-5天，收取上清進(jìn)行第一輪噬斑篩選。取5微升上清感染35mm培養(yǎng)皿中的Bm N細(xì)胞，1小時(shí)后棄去上清并加入等量混合的TC-100培養(yǎng)基和低熔點(diǎn)瓊脂糖。4-5天后挑取噬斑，感染Bm N細(xì)胞3-4天，保存上清，細(xì)胞用NaOH裂解用于Southern印跡斑點(diǎn)雜交。取陽(yáng)性克隆的上清進(jìn)行第二輪噬斑篩選(見(jiàn)圖4，箭頭所指的噬斑)。取陽(yáng)性克隆的上清感染Bm N細(xì)胞擴(kuò)增，即可得到大量的含IFN-THY融合基因的重組桿狀病毒。
該重組桿狀病毒被命名為重組家蠶核型多角體病毒(Bobyx Mori Nuclearpolyhedrosis virus)BacIT，并于2000年11月6日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)，北京)，保藏號(hào)為CGMCC No.0504。
實(shí)施例4、IFN-THY融合基因在家蠶五齡幼蟲(chóng)中的表達(dá)取實(shí)施例3中擴(kuò)增的含IFN-THY融合基因的重組桿狀病毒，注射到五齡家蠶幼蟲(chóng)體內(nèi)，每頭注射10微升左右。分別取24、48、72、96和110小時(shí)表達(dá)的家蠶淋巴血，5000rpm 5min離心后取上清，用PBS pH 7.4稀釋10倍后，加入等體積的2×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，取20微升進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，從24小時(shí)開(kāi)始就有IFN-THY融合蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖5)，IFN-THY融合蛋白的分子量為約22kDa。
實(shí)施例5IFN-THY融合蛋白的IFN活性測(cè)定采用L929細(xì)胞(小鼠成纖維細(xì)胞系)病變抑制法測(cè)定IFN活性。在96孔板中倍比稀釋待測(cè)家蠶淋巴血上清(每孔50微升，設(shè)三個(gè)重復(fù))，隨后各孔加入50微升L929細(xì)胞懸液(4×104細(xì)胞)，設(shè)細(xì)胞和病毒對(duì)照，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，棄去孔中液體，各孔加入100微升濾泡口炎病毒(VSV)懸液(250 TCID50/ml)(TCIDtissue culture infectious dose)，細(xì)胞對(duì)照孔中加入100微升培養(yǎng)基，培養(yǎng)36小時(shí)，當(dāng)病毒對(duì)照孔中L929細(xì)胞幾乎全部發(fā)生病變時(shí)終止培養(yǎng)。棄去孔中液體，每孔加入0.5％的結(jié)晶紫液(結(jié)晶紫0.5克，NaCl 0.85克，溶于50ml無(wú)水乙醇，3ml甲醇，47ml蒸餾水中)200微升，置37℃15min，用自來(lái)水洗去殘余的染料，每孔加入200微升脫色液(50ml乙二醇單甲醛與50ml蒸餾水混均)，用震蕩器震蕩，待染料完全從細(xì)胞內(nèi)脫出，用分光光度計(jì)在540nm波長(zhǎng)處比色。以下列公式計(jì)算IFN效價(jià)


結(jié)果表明，96小時(shí)表達(dá)樣品IFN活力為3.72×104IU/ml，110小時(shí)表達(dá)樣品為3.10×105IU/ml。
實(shí)施例6IFN-THY融合蛋白的THY活性測(cè)定采用玫瑰花結(jié)法測(cè)定THY活性。胸腺肽能與T淋巴系統(tǒng)作用，調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。通過(guò)胸腺肽源激活新鮮的豬胸腺中的脫E胸腺細(xì)胞，使它與綿羊紅細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)。取出經(jīng)過(guò)與家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)后的含IFN-THY融合蛋白的淋巴血反應(yīng)的胸腺細(xì)胞用油鏡觀察進(jìn)行計(jì)數(shù)以視野中央淡藍(lán)色較大的細(xì)胞為淋巴細(xì)胞(即胸腺細(xì)胞)，每次數(shù)100個(gè)胸腺細(xì)胞，共數(shù)200個(gè)，統(tǒng)計(jì)其中的E玫瑰花結(jié)形成細(xì)胞數(shù)(結(jié)合4個(gè)以上綿羊紅細(xì)胞的胸腺細(xì)胞)，取其平均數(shù)，即為樣品或?qū)φ盏淖x數(shù)。按下列公式計(jì)算THY活力

測(cè)定結(jié)果如表1所示表1 IFN-THY融合蛋白的THY活性


以上結(jié)果表明，從48-110小時(shí)表達(dá)樣品均有明顯的THY活性。其活性條形示意圖見(jiàn)圖6。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ii)發(fā)明名稱新的干擾素-胸腺肽融合蛋白及其制法和用途(iii)序列數(shù)目6(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度604bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO1TGTGATCTGC CTCAAACCCA CAGCCTGGGT AGCAGGAGGA CCTTGATGCT CCTGGCACAG60ATGCGTAGAA TCTCTCTTTT CTCTTGCTTG AAGGACAGAC ATGACTTTGG ATTTCCCCAG120GAGGAGTTTG GCAACCAGTT CCAAAAGGCT CAAACCATCC CTGTCCTCCA TGAGATGATC180CAGCAGATCT TCAATCTCTT CAGCACAAAG GACTCATCTG CTGCTTGGGA TGAGACCCTC240CTAGACAAAT TCTACACTGA ACTCTACCAG CAGCTGAATG ACCTGGAAGC CTGTGTGATA300CAGGGGGTGG GGGTGACAGA GACTCCCCTG ATGAAGGAGG ACTCCATTCT GGCTGTGAGG360AAATACTTCC AAAGAATCAC TCTCTATCTG AAAGAGAAGA AATACAGCCC TTGTGCCTGG420GAGGTTGTCA GAGCAGAAAT CATGAGATCT TTTTCTTTGT CAACAAACTT GCAAGAAAGT480TTAAGAAGTA AGGAAGGCGG CGGATCCTCT GACGCTGCTG TGGACACCTC TTCTGAAATC540ACCACCAAGG ACCTGAAGGA AAAGAAGGAA GTGGTGGAAG AAGCTGAAAA CGGCTGAAGC600TTGC 604(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度198個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO2CDLPQTHSLG SRRTLMLLAQ MRRISLFSCL KDRHDFGFPQ EEFGNQFQKA 50QTIPVLHEMI QQIFNLFSTK DSSAAWDETL LDKFYTELYQ QLNDLEACVI 100QGVGVTETPL MKEDSILAVR KYFQRITLYL KEKKYSPCAW EVVRAEIMRS 150FSLSTNLQES LRSKEGGGSS DAAVDTSSEI TTKDLKEKKE VVEEAENG 198(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3GCCATATGTG CGATCTGCCT CAAACC 26(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4ATGGATCCAC CACCGCCTTC CTTACTTCTT AAACTTTC 38(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度73堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GGCGGATCCG GCTCTGACGC TGCTGTGGAC ACCTCTTCTG AAATCACCAC 50CAAGGACCTG AAGGAAAAGA AGG 73(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度58堿基(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6CCAAGGACCT GAAGGAAAAG AAGGAAGTGG TGGAAGAAGC TGAAAACGGC 50TGAAGCTT 58
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，它包括人α干擾素2b的氨基酸序列、人胸腺肽的氨基酸序列、以及位于人α干擾素2b氨基酸序列和人胸腺肽氨基酸序列之間的1-20個(gè)氨基酸的連接肽序列。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的接頭序列含4-10個(gè)氨基酸。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白包括SEQ IDNO2中所示的氨基酸序列。
4.一種分離的DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它包括SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的DNA分子。
7.如權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，它包括重組家蠶核型多角體病毒(Bobyx Mori Nuclear polyhedrosis virus)BacIT CGMCC No.0504。
8.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
9.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，它包括步驟在適合表達(dá)所述融合蛋白的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，或者培養(yǎng)含權(quán)利要求8所述宿主細(xì)胞的動(dòng)物，從而表達(dá)出所述的融合蛋白；和分離所述的融合蛋白。
10.一種藥物組合物，其特征在于，包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑或稀釋劑，以及有效量的權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了干擾素與胸腺肽的融合蛋白(IFN－THY融合蛋白),編碼該融合蛋白的DNA序列,含該DNA序列的載體,含該載體的宿主細(xì)胞,用基因工程制備該融合蛋白的方法,以及含該融合蛋白的藥物組合物。本發(fā)明的IFN－THY融合蛋白既具有IFN的活性,又具有THY的免疫刺激活性,可以用于如病毒性感染等疾病的治療和機(jī)體免疫機(jī)能增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1375500SQ0110570
公開(kāi)日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2001年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月21日
發(fā)明者吳祥甫, 楊冠珍, 何志勇, 吳峻 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所