專利名稱：蝴蝶蘭成花相關(guān)基因<i>PRP39</i>的編碼序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程及植物生理學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的成花相關(guān)基因的克隆，包括此基因序列的分析，基因表達(dá)模式的分析，目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建，植物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植株的獲得以及相應(yīng)的生理特性的鑒定。
背景技術(shù)：
蝴蝶蘭作為一種具有較好經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值的花卉深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛， 但其成花需要電力降溫或高山催花，這就大大提高了其生產(chǎn)成本。因此，很多學(xué)者就嘗試通過(guò)基因工程手段調(diào)控蝴蝶蘭花期，以降低生產(chǎn)成本。韓穎穎等(2004、2005)在蝴蝶蘭花瓣中得到了查爾酮合酶CDNA(^As)，并成功轉(zhuǎn)化煙草證明其參與花的形態(tài)建成。^iang等 (2010) Phalaenopsis hybrida (cv. wedding promenade)中成功分離得到
LEAFY (FL0/LFY)的同源基因/^？漢/^，通過(guò)半定量RT-PCR得出/^^Z/T是蝴蝶蘭成花的關(guān)鍵基因。轉(zhuǎn)基因方面的研究也取得了一定的進(jìn)展，Belarmino等(2000)首先成功報(bào)道了用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法開展蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因；Mishits等Q005)用未成熟的圓球莖與農(nóng)桿菌(包含gus和潮霉素抗性基因)共培養(yǎng)，在篩選培養(yǎng)基上(含20mg/L的潮霉素)PLB再生獲得蝴蝶蘭抗潮霉素的抗性植株；Qin等(2010)用葉片誘導(dǎo)出的愈傷組織與含有抗冷基因ZTP的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，得到了大量的抗冷蝴蝶蘭轉(zhuǎn)基因植株。但是，有關(guān)蝴蝶蘭基因的研究還尚未見報(bào)道。本發(fā)明研究了一種從蝴蝶蘭中克隆出來(lái)的與成花相關(guān)的基因，轉(zhuǎn)入擬南芥后引起花期推遲。而在本發(fā)明公布之前尚未有公開或報(bào)道過(guò)本發(fā)明申請(qǐng)中提及的蝴蝶蘭 PRP39基因的核苷酸序列及其在轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從蝴蝶蘭中克隆出來(lái)的與成花相關(guān)的基因，以及利用該基因在調(diào)控植物花期上的應(yīng)用。本發(fā)明一方面提供了一個(gè)新的蝴蝶蘭基因該基因與蝴蝶蘭的成花有關(guān)。 編碼區(qū)全長(zhǎng)^45bp，包含一個(gè)M72bp的開放閱讀框，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明的另一方面提供了上述基因編碼的蛋白質(zhì)分子，該蛋白質(zhì)分子具有 SEQ ID NO. 2所示的氨基酸編碼序列。本發(fā)明還提供了用于調(diào)取獲得蝴蝶蘭樣品中PRP39基因的核苷酸弓I物序列，根據(jù)基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了一系列的RACE引物和RT-PCR引物，具體引物序列如SEQ ID NO. 3所示。本發(fā)明還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蝴蝶蘭基因的核苷酸編碼序列SEQ IDN0. 1轉(zhuǎn)入擬南芥以改變開花時(shí)間的方法，具體步驟如下
(1)將蝴蝶蘭基因的開放閱讀框連接入植物表達(dá)載體，形成含有蝴蝶蘭PRP39基因的植物表達(dá)載體；
(2 )將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，用含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液浸泡擬南芥花序30s，黑暗培養(yǎng)過(guò)夜，第二天正常培養(yǎng)，約2周后收集轉(zhuǎn)基因種子；
(3)通過(guò)對(duì)擬南芥種子抗生素篩選，PCR鑒定，獲得再生轉(zhuǎn)基因植株，開花時(shí)間比野生型擬南芥推遲。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)樣品中是否存在蝴蝶蘭PRP39基因的核苷酸序列 SEQ ID NO. 1的方法，使用SEQ ID NO. 4的核苷酸序列對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 然后電泳檢測(cè)目的片段的有無(wú)。附圖內(nèi)容


圖1為以蝴蝶蘭的花梗為材料提取的總RNA，含有較多雜質(zhì)。圖2為用DNase I消化后的結(jié)果，RNA的純度明顯提高。圖3為3’ RACE擴(kuò)增結(jié)果，由于基因本身局部有很多A，擴(kuò)增出多條條帶，割取最上面的那條回收，約1500bp，連接轉(zhuǎn)化，克隆測(cè)序可得到正確的序列。圖4為5’ RACE擴(kuò)增結(jié)果，長(zhǎng)約1200bp。圖5為基因最大的開放閱讀框，長(zhǎng)約2500bp。圖6為轉(zhuǎn)基因植株P(guān)RP39基因是否表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件， 如Sambrook. J.等主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1
蝴蝶蘭PRP39基因的克隆
1.以蝴蝶蘭itoritemoAsh ‘Tinny Tender’為實(shí)驗(yàn)材料，植物材料在光照培養(yǎng)箱內(nèi)正常生長(zhǎng)(L/D :16h/8h,25°C /19°C)。2.總 RNA 提取
(1)取蝴蝶蘭的花梗IOOmg左右，液氮充分研磨。(2)將粉末移入裝有Iml Trizol Reagent (購(gòu)自hvitrogen公司)的離心管，渦旋混勻，室溫靜置5min。(3)加入0. 2ml氯仿，劇烈振蕩lmin，然后繼續(xù)用力振蕩lOmin，4°C，12000rpm離心 IOmin0(4)取上清，加等體積飽和酚(pH4. 5)，混勻，室溫靜置5min，4°C，12000rpm離心 IOmin0(5)取上清，加等體積氯仿異戊醇(對(duì)1)，混勻，室溫靜置5min,4°C,12000rpm 離心IOmin0(6)取上清，加等體積異丙醇，混勻，_70°C靜置20min，4°C，12000rpm離心lOmin。(7)棄上清，加約Iml 75%酒精，溫和震蕩離心管，懸浮沉淀，4°C，7500rpm離心 5min。
(8)棄上清，將沉淀風(fēng)干，加入50 μ 1 DEPC H2O溶解總RNA，測(cè)濃度，電泳檢測(cè)。3. DNA 消化
用DNase I (購(gòu)自TaKaRa公司)去除總RNA中的基因組DNA，方法參照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。4.反轉(zhuǎn)錄
采用MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自Clontech公司)逆轉(zhuǎn)錄mRNA成cDNA第一鏈，方法按照實(shí)際說(shuō)明書進(jìn)行。5.基因克隆 (1)3，RACE
根據(jù)建立的cDNA文庫(kù)中的已知片段設(shè)計(jì)上游特異性引物，以AP為引物反轉(zhuǎn)錄出的 cDNA為模板，依次使用3GSP1/AUAP和3GSP2/AUAP進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增出的目的片段割膠回收，連接轉(zhuǎn)化，克隆，測(cè)序。具體引物序列見SEQ ID NO. 3。(2) 5，RACE
根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄特異性引物和下游引物，使用5GSP1/AAP進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，使用5GSP2/AUAP進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增出的目的片段割膠回收，連接轉(zhuǎn)化，克隆，測(cè)序。具體引物序列見SEQ ID NO. 3。(3)序列拼接
根據(jù)得到的3’序列和5’序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，得到基因的序列全長(zhǎng)。實(shí)施例2
蝴蝶蘭基因表達(dá)載體的構(gòu)建
1.根據(jù)所得的基因全長(zhǎng)，利用DNAMar軟件查找基因的開放閱讀框，以最大的開放閱讀框作為目的片段構(gòu)建表達(dá)載體。2.根據(jù)查找到的開放閱讀框設(shè)計(jì)特異性引物，利用高保真酶I^rimeSTAR HS DNA Polymerase (購(gòu)自TaKaRa公司)進(jìn)行擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增出的目的片段割膠回收，連接入 PMD20-T載體，轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆，送3個(gè)樣測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果直至3個(gè)序列完全一致。3.提取目的基因質(zhì)粒，選用Xba I和Kpn I雙酶切pMD20_目的基因重組質(zhì)粒， pCAMBIA-1301質(zhì)粒也采用相同的內(nèi)切酶雙酶切，使用T4DNA連接酶(購(gòu)自NEB公司)將目的基因與pCAMBIA-1301連接，得到表達(dá)載體pCAMBIA-1301-目的基因，將其轉(zhuǎn)化至DH5 α，挑選單克隆，搖菌提取質(zhì)粒，用相同的內(nèi)切酶鑒定該重組質(zhì)粒。4.將檢測(cè)正確的重組質(zhì)粒pCAMBIA-1301-目的基因電轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆，搖菌提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化至DH5 〃中，再重新提取質(zhì)粒，酶切檢測(cè)。挑選檢測(cè)正確的菌液加甘油保存至70°C冰箱，以備轉(zhuǎn)化擬南芥。實(shí)施例3 浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥
1.種植擬南芥。培養(yǎng)條件為溫度，濕度60%-80%，光照強(qiáng)度7000-9000LX，光照16h， 黑暗8h。2.轉(zhuǎn)化菌液的培養(yǎng)。將轉(zhuǎn)化了表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌種劃線活化，28°C培養(yǎng)2天， 挑選單克隆振蕩培養(yǎng)1-2天，離心收集菌體，倒掉上清，加入70-80mL的轉(zhuǎn)化介質(zhì)，懸浮農(nóng)桿菌。
3.轉(zhuǎn)化擬南芥。選取開花初期的擬南芥，將擬南芥所有的花序都浸入含有農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化介質(zhì)中30s，將植株放在黑暗中過(guò)夜，第二天轉(zhuǎn)移至正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)約2周后種子成熟，收集轉(zhuǎn)基因種子。實(shí)施例4
轉(zhuǎn)基因種子的篩選、種植及檢測(cè)
1.配制含有終濃度為50mg/L潮霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)基因種子均勻的灑在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿加蓋。同時(shí)，將野生型擬南芥種子撒播在另一個(gè)不含潮霉素培養(yǎng)皿中，作為對(duì)照。2.將兩種培養(yǎng)皿用錫紙包好，4°C避光保存3天。3. 3天后拆掉撒有野生型擬南芥的培養(yǎng)皿錫紙，并將其放置在培養(yǎng)室正常培養(yǎng)，而撒有轉(zhuǎn)基因種子的培養(yǎng)皿不拆掉錫紙，也放置在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時(shí)后將錫紙去掉， 恢復(fù)正常培養(yǎng)。4.待擬南芥長(zhǎng)出真葉后，用鑷子小心的將其移植到基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)。5.野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥以相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，觀察野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)及開花情況。6.待兩組擬南芥開花后取適量葉片，提取組織DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)目的基因是否正常表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種蝴蝶蘭成花相關(guān)的基因，其特征在于為具有特定序列的DNA分子，長(zhǎng) 2945bp，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.一種如權(quán)利要求1所述的基因編碼的蛋白質(zhì)分子，其特征在于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸編碼序列。
3.用于調(diào)取獲得蝴蝶蘭樣品中基因的核苷酸引物序列，其特征在于如權(quán)利要求 1所述的基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的一系列的RACE引物和RT-PCR引物，具體引物序列如SEQ ID NO. 3 所示。
4.一種如權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭基因的核苷酸編碼序列SEQ ID NO. 1轉(zhuǎn)入擬南芥以改變開花時(shí)間的方法，其特征在于(1)將蝴蝶蘭基因的開放閱讀框連接入植物表達(dá)載體，形成含有蝴蝶蘭基因的植物表達(dá)載體；(2)將(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，用含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液浸泡擬南芥花序， 收集轉(zhuǎn)基因種子；(3)通過(guò)對(duì)擬南芥種子抗生素篩選，PCR鑒定，獲得再生轉(zhuǎn)基因植株，開花時(shí)間比野生型擬南芥推遲。
5.一種用于檢測(cè)樣品中是否存在如權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭基因的核苷酸序列 SEQ ID NO. 1的方法，其特征在于使用SEQ ID NO. 4的核苷酸序列對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，然后電泳檢測(cè)目的片段的有無(wú)。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的花發(fā)育相關(guān)基因PRP39的編碼序列及其在調(diào)控植物花期上的應(yīng)用。本發(fā)明涉及包含上述基因的重組植物表達(dá)載體及應(yīng)用此載體轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植物。應(yīng)用本發(fā)明涉及基因在植物中轉(zhuǎn)化表達(dá)，可對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的開花時(shí)間起到一定的推遲作用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102174528SQ201110030959
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者周明兵, 孫小明, 崔永一, 張遲, 秦巧平 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)林大學(xué)