專利名稱：：一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及應用生物信息學領域，具體是涉及一種挖掘UniGene數(shù)據庫中特異表達基因的方法。
背景技術：
：EST(表達序列標簽)測序是高通量檢測基因表達信息的方法之一，近些年來，由于EST序列長度較長，特異性較好，比基因芯片的噪音低，使得EST測序得到了廣泛的應用。但是，由于EST測序的成本較高，單個研究人員在建立EST序列信息時，對EST序列的挖掘工作，主要集中在EST序列信息的發(fā)現(xiàn)方面，例如，EST序列的拼接，拼接結果的注釋以及SSR和SNP的發(fā)現(xiàn)等方面，往往EST測序的EST序列數(shù)目較少，即對EST序列的定量方面的研究較少，只能基于EST序列信息定性分析生物體的性狀，無法通過EST序列定量分析基因和性狀間的關系。但是，隨著大規(guī)模EST測序計劃的進行，公共數(shù)據庫(EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫)中的EST序列積累越來越多，研究人員開始利用EST序列來定量分析基因和性狀間的關系，例如，Aouacheria.A.等人在2006年第7期的BMCGenomics上，發(fā)表了名為"BioinformaticscreeningofhumanESTsfordifferentiallyexpressedgenesinnormalandtumortissues(利用人類EST的生物信息學方法篩選正常組織和腫瘤組織中差異表達基因)"的文章，闡述了采用BLAST搜索的方法對EST表達量進行計數(shù)統(tǒng)計，定量分析了基因和癌癥的關系，挖掘出了人類癌癥響應基因。但是，由于旁系同源基因和一些高相似性的保守結構域序列的干擾，使得該方法計數(shù)會出現(xiàn)假陽性，導致EST表達量計數(shù)錯誤，從而使得后續(xù)的統(tǒng)計分析產生較大的誤差，無法正確挖掘與性狀相關的誘導基因。
發(fā)明內容為了克服現(xiàn)有的基因挖掘方法中EST表達量計數(shù)出現(xiàn)假陽性進而導致無法正確挖掘與性狀相關的誘導基因的問題，本發(fā)明提供一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法
技術領域：
：本發(fā)明的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法的具體過程為步驟A:下載EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫，并對所述的UniGene數(shù)據庫中的EST序列信息按照物種類型進行分類，接下來執(zhí)行步驟B;步驟B:對所述的EST文庫注釋信息進行信息檢索，進而對EST文庫注釋信息進行分類，接下來執(zhí)行步驟C;步驟C:根據EST文庫注釋信息的分類信息計算表達基因UniGene轉錄組的EST表達量，接下來執(zhí)行步驟D;步驟D:對所獲得的表達基因UniGene轉錄組的EST表達量進行超幾何分布檢驗，計算獲得表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue，接下來執(zhí)行步驟E;步驟E:采用FDR方法調整表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue，接下來執(zhí)行步驟F;步驟F:設置表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue閾值為O.01，篩選異常狀態(tài)響應基因，接下來執(zhí)行步驟G;步驟G:利用RT-PCR技術驗證所篩選出的異常狀態(tài)響應基因為與性狀相關的誘導基因。本發(fā)明綜合EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的數(shù)據，避免了拼接或是比對過程中人為引入的誤差；本發(fā)明還完成了對EST數(shù)據的定量分析，而不是簡單的定性的分析，從表達量水平上揭示了異常狀態(tài)所響應的基因本質；本發(fā)明還采用超幾何分布檢驗方法計算差異表達的超幾何分布檢驗值P-value,結合FDR方法調整所計算的超幾何分布檢驗值P-value,避免了多次檢驗引入的誤差，使得基因挖掘的結果更加精確。本發(fā)明可以應用于人類疾病發(fā)生、動植物生長發(fā)育調控、動植物疾病調控過程以及動植物逆境脅迫等性狀相關誘導基因的挖掘，本發(fā)明從公共數(shù)據庫(EST和UniGene)中挖掘得到了目的性狀的響應基因，高效、準確地解析了生物性狀，為生物重要過程的揭示奠定了重要的基礎。圖l是本發(fā)明的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法的工作流程圖，圖2是大豆逆境脅迫誘導基因的RT-PCR半定量分析結果示意圖。具體實施例方式具體實施方式一參見圖l，本具體實施方式所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法的具體過程為步驟A:下載EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫，并對所述的UniGene數(shù)據庫中的EST序列信息按照物種類型進行分類，接下來執(zhí)行步驟B;步驟B:對所述的EST文庫注釋信息進行信息檢索，進而對EST文庫注釋信息進行分類，接下來執(zhí)行步驟C;步驟C:根據EST文庫注釋信息的分類信息計算表達基因UniGene轉錄組的EST表達量，接下來執(zhí)行步驟D;10步驟D:對所獲得的表達基因UniGene轉錄組的EST表達量進行超幾何分布檢驗，計算獲得表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue，接下來執(zhí)行步驟E;步驟E:采用FDR方法調整表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue，接下來執(zhí)行步驟F;步驟F:設置表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue閾值為O.01，篩選異常狀態(tài)響應基因；步驟G:利用RT-PCR技術驗證所篩選出的異常狀態(tài)響應基因為與性狀相關的誘導基因。本具體實施方式中的EST數(shù)據庫含有EST序列，本具體實施方式中的UniGene數(shù)據庫是NCBI開發(fā)的，是通過蛋白質的相似性、基因表達信息、cDNA克隆和基因組位置等信息，將同一轉錄位點的一組轉錄序列拼接成的一致性序列。UniGene數(shù)據庫包含兩部分信息即EST序列信息及EST文庫注釋信息，所述信息具有較高可信度，是真實存在的轉錄本信息，適用于性狀相關誘導基因的挖掘。本具體實施方式中所述步驟B的具體過程為首先，收集生物體異常狀態(tài)的關鍵詞，將所收集的每一個生物體異常狀態(tài)的關鍵詞在所述的EST文庫注釋信息中進行信息檢索，篩選異常狀態(tài)EST文庫，并提取異常狀態(tài)EST文庫的ID，然后，收集生物體正常狀態(tài)的關鍵詞，將所收集的每一個生物體正常狀態(tài)的關鍵詞在所述的EST文庫注釋信息中進行信息檢索，篩選正常狀態(tài)EST文庫，并提取正常狀態(tài)EST文庫的ID，所述的在EST文庫注釋信息中進行信息檢索的檢索項包括主題TITLE、發(fā)育狀態(tài)DEVELOPMENTAL—STAGE和組織VERBAT頂—TISSUE三項。本具體實施方式中所述步驟C的具體過程為在步驟C中，根據EST文庫注釋信息的分類信息，從所述UniGene數(shù)據庫中的UniGene轉錄組文件中提取表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，同時對UniGene轉錄組文件中所有的UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和UniGene轉錄組文件中所有的UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，將上述所獲得的EST序列信息的所有計數(shù)信息轉化為EST表達量；如果某生物體的UniGene數(shù)據庫中已經對每個UniGene轉錄組按照EST文庫注釋信息建立完善的分類信息，則直接提取EST序列信息的所有計數(shù)信息，將所述計數(shù)信息轉化為相應的EST表達量。本具體實施方式中所述步驟D的具體過程為設表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST表達量為a，表達基因UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST表達量為b，且UniGene轉錄組文件中所有UniGene轉錄組的總的正常狀態(tài)EST表達量為c，所述UniGene轉錄組文件中所有UniGene轉錄組的總的異常狀態(tài)EST表達量為d，以a、b、c和d四個數(shù)構建超幾何分布檢驗，利用免費開源軟件R平臺的phyper完成超幾何分布檢驗，公式一Y。"'daJ利用公式一計算獲得表達基因UniGene轉錄組的超幾何分布檢驗值Pialue。本具體實施方式中步驟E的具體過程為將UniGene轉錄組文件中所有UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個超幾何分布檢驗值P-value,同時設所述UniGene轉錄組文件中所有UniGene轉錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調整后的第i個超幾何分布檢驗值Pialue為P-Value=p(i)*n/i，此等式中所述的P-value和p(i)是重新賦值關系。本具體實施方式中步驟F的具體過程為將調整后的超幾何分布檢驗值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗值Pialue所對應的表達基因UniGene轉錄組作為異常狀態(tài)的響應基因。在本具體實施方式中，以表達基因UniGene轉錄組的EST序列信息的條數(shù)作為表達基因UniGene轉錄組的EST表達量，依據表達基因UniGene轉錄組的EST文庫描述信息，對所述EST文庫進行分類，通過對比正常狀態(tài)EST表達量和異常狀態(tài)EST表達量構建超幾何分布檢驗，進行統(tǒng)計分析，采用FDR方法進行基因差異表達的誤差控制，篩選異常狀態(tài)的響應基因。本具體實施方式適用于生物異常過程差異表達基因的挖掘，如人類疾病發(fā)生、動植物生長發(fā)育調控、動植物疾病調控過程以及動植物逆境脅迫等過程。具體實施方式二本實施方式所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，與具體實施方式一的不同之處在于它是對人類癌癥響應基因的挖掘在步驟A中，下載人類EST數(shù)據庫和人類UniGene數(shù)據庫；在步驟B中，直接提取人類EST文庫注釋信息，首先，提取人類異常狀態(tài)EST文庫，并提取所述的人類異常狀態(tài)EST文庫的ID，然后，提取人類正常狀態(tài)EST文庫，并提取所述的人類正常狀態(tài)EST文庫的ID;在步驟C中，根據人類EST文庫注釋信息的分類信息，從所述人類UniGene數(shù)據庫中的人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中提取人類表達基因UniGene轉錄組的健康狀態(tài)HealthState下孚L房月中瘤breasttumor，白血病leukemia，卵巢月中瘤ovariantumor，中樞神經系統(tǒng)CNS的原始神經夕卜胚層月中瘤primitiveneuroectodermaltumor，前歹[J腺癌prostatecancer和正常狀態(tài)normal的人類EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，同時對人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有的UniGene轉錄組的正常狀態(tài)人類EST序列信息的條數(shù)和人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有的UniGene轉錄組的異常狀態(tài)人類EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，將上述所獲得的人類EST序列信息的所有計數(shù)信息轉化為人類表達基因UniGene轉錄組的EST表達量；在步驟D中，對所獲得的人類表達基因UniGene轉錄組的EST表達量進行超幾何分布檢驗，其中，以人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中正常狀態(tài)normal下的數(shù)據作為人類UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST表達量，以人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中其它癌癥病變狀態(tài)作為異常狀態(tài)，并將所述異常狀態(tài)下的數(shù)據作為人類表達基因UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST表達量，利用所獲得的人類表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST表達量、人類表達基因UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST表達量、人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉錄組的總的正常狀態(tài)EST表達量和人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉錄組的總的異常狀態(tài)EST表達量構建超幾何分布檢驗，利用免費開源軟件R平臺的phyper完成超幾何分布檢驗，計算獲得人類表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue;在步驟E中，采用FDR方法調整人類表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue，該調整過程為將人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個超幾何分布檢驗值Pialue，同時設人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調整后的第i個超幾何分布檢驗值P-value為P-value=p(i)*n/i，此等式中所述的P-value和p(i)是重新賦值關系；在步驟F中，設置人類癌癥所響應的表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue閾值為O.Ol，篩選人類癌癥響應基因，在此篩選過程中，將調整后的超幾何分布檢驗值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗值Pialue所對應的表達基因UniGene轉錄組作為人類癌癥的響應基因；在步驟G中，利用RT-PCR技術驗證所篩選出的人類癌癥響應基因為與人類癌癥相關的誘導基因。本實施方式提供了一種對人類癌癥響應基因的挖掘方法，本實施方式中所述的人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles內容為>2IHealthStateadrenaltumor□/12841breast(mammsrytumoi:cervicaltumor0/chondros&rc0/colorectaltumor□esophagealtumoi:□gei:mcelltumor0/glioma□/107493hesd&ndnecktuinor3458182865/114863/173552647250/13740Sinsulinoma□/30305kidneytumor□/69383leukeniis0/956271ivertumor1/96641lungtumor□/103480lymphoma0/72064norL-neoplasis□/97513noi:脆l(xiāng)16/3374366ovariantumoi:□/77210pancreaticcsncei:□/74633primitiveneuroectodermaltumoi:oftheCNS□prostatecancer0/103951retinolnlastoina0/46517skintumoi:□/124881sins11intestineadenocsrcinorna□/12684125405本實施方式中提取的Hs.profiles中健康狀態(tài)HealthState下乳房腫瘤breasttumor，白血病leukemia，卵巢腫瘤ovariantumor，中樞神經系統(tǒng)CNS的原始神經外胚層腫瘤primitiveneuroectodermaltumor，前列腺癌prostatecancer禾口正常狀態(tài)normal的EST序列信息的計數(shù)信息為Hs.2163374366Hs.46343374366Hs.ll113374366Hs.127337436601633743668337436603873374366Hs.6688337436612033743"18033743662Hs.1021593374366133374366Hs.109463374366Hs.Ill233374366Hs.120403374366Hs.129233743"□2053374366□94573□95627077210□126405□103951394573□077210□126405□103951□945731196627□772100126405010395194573196627□7721001264050103951094573095627094573249562701294573696627□945731956270194573209662729457349562743945733966270945730966271945733094573□96627094573□9662794573□0772100126405010395177210□126405□103951□77210491264051010395177210□126405□1039512772100126405010395177210131264051103951□772102126405010395127721001264050103951□772100126405o103951□772100126405o103951□772100126405110395177210□126405□1039511264057103951從人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中提取人類EST序列信息計數(shù)信息的方法可采用下述程序實現(xiàn)open(human—file,〃〈$ARGV〃)；while(defined($in—liiie=〈humaii—file>))14chomp$in—line;if($in—line=/"〉/&&$in—line=/HealthState/)$ugid=(split(/\s+/，$in—line))[1];$ugid=(split(AI/，$ugid));$ugid="Hs.$ugid";if($in—line=/breast\(mammarygland\)tumor/)錢temp二split(/\s+/，$in—line);@br=@temp[$frtemp—2，$frtemp];if($in—line=廠leukemia/)錢temp二split(/\s+/，$in—line);@leu=@temp[$frtemp—2，$frtemp];if($in—line=廠normal/)錢temp二split(/\s+/，$in—line);@nm=@temp[$frtemp—2，$frtemp];if($in—line=/ovariantumor/)錢temp二split(/\s+/，$in—line);@ov=@temp[$frtemp—2，$frtemp];if($in—line=/primitiveneuroectodermaltumoroftheCNS/)錢temp二split(/\s+/，$in—line);@cns=@temp[$frtemp-2，$frtemp];if($in—line=/prostatecancer/)@temp=split(/\s+/，$in—line);@pr=@temp[$frtemp-2，$frtemp];if($in—line=/BodySites/)print〃$ugid\t$nm\t$nm[l]\t$br\t$br[1]\t$leu\t$leu[l]\tprint〃$ov\t$ov[1]\t$cns\t$cns[1]\t$pr\t$pr[1]\t〃；close(human—file);本實施方式中對人類表達基因UniGene轉錄組差異表達的EST表達量進行超幾何分布檢驗，計算獲得的人類表達基因UniGene轉錄組在各種癌癥狀態(tài)下與在正常狀態(tài)(normal)下差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue，所述超幾何分布檢驗值Pialue具體為UGID朋LEovPR0s-2..11111Bs-41111Bs.111t13E—12111Bs-12111.1Bs-3611111Bs-4113_細—31111OL40594401OL9^304031p1i17E—120-74^512125Bs-6611110l9647277740lGOO4S31111Bs-960l65^43390-206558605Ol119573633u07.E—050.91*364717Bs_10^.pL3314743021p_"11333491Bs.10411OL04331600911Bs.I*OL727236779OL15571853711111111111Bs.12011110.7117GS821Bs.129111110l1331908276l35E~05Ol506409974&"E—05Ol44326299上述獲得超幾何分布檢驗值Pialue可通過下述程序實現(xiàn)data—all=read.table("human—est.txt〃，header=F，sep=〃\t〃)data=data—all[(data—all[，1]%in%microarray.pvalue[，l])，];16鼎鼎BR鼎鼎鼎鼎鼎est二cbind(data[，4]-1，data[，5]，data[，3]，data[，2]+data[，4]);row.names(est)=data[，1];pvalue二l:nrow(est);for(iin1:nrow(est))pvalue[i]二phyper(est[i，l]，est[i，2]，est[i，3]，est[i，4]，lower.tail二F);BR=pvalue;鼎鼎LE鼎鼎鼎鼎鼎est二cbind(data[，6]-1，data[，7]，data[，3]，data[，2]+data[，6]);row.names(est)=data[，1];pvalue二l:nrow(est);for(iin1:nrow(est))pvalue[i]二phyper(est[i，l]，est[i，2]，est[i，3]，est[i，4]，lower.tail二F);LE=pralue;鼎鼎OV鼎鼎鼎鼎鼎est二cbind(data[，8]-1，data[，9]，data[，3]，data[，2]+data[，8]);row.names(est)=data[，1];pvalue二l:nrow(est);for(iin1:nrow(est))pvalue[i]二phyper(est[i，l]，est[i，2]，est[i，3]，est[i，4]，lower.tail二F);0V=pralue;鼎鼎CNS鼎鼎鼎鼎鼎est二cbind(data[，IO]-I，data[，ll]，data[，3]，data[，2]+data[，10]);row.names(est)=data[，1];pvalue二l:nrow(est);for(iin1:nrow(est))pvalue[i]二phyper(est[i，l]，est[i，2]，est[i，3]，est[i，4]，lower.tail二F);CNS=pvalue;鼎鼎PR鼎鼎鼎鼎鼎est二cbind(data[，12]-1，data[，13]，data[，3]，data[，2]+data[，12]);row.names(est)=data[，1];pvalue二l:nrow(est);for(iin1:nrow(est))pvalue[i]二phyper(est[i，l]，est[i，2]，est[i，3]，est[i，4]，lower.tail二F);PR=pvalue;UGID=data[，1];est.pvalue=data.frame(UGID，BR，LE，0V，CNS，PR);write,table(est.pvalue，〃Hs—est—pvalue.txt〃，col.names=T，row.names=F，sep=〃\tquote二F);他.off=0.05;temp二sort(est.pvalue[，〃BR〃]);for(iin1:length(temp))if(temp[i]氺length(temp)/i〉=fdr.off){fdr.off二temp[i];break;};unigene.est二as.character(est.pvalue[est.pvalue[，〃BR〃]〈=fdr.off，1]);他.off=0.05;temp二sort(est.pvalue[，〃LE〃]);for(iin1:length(temp))if(temp[i]氺length(temp)/i〉=fdr.off){fdr.off二temp[i];break;};unigene.est二as.character(est.pvalue[est.pvalue[，〃LE〃]〈=fdr.off，1]);他.off=0.05;temp二sort(est.pvalue[，〃0V〃]);for(iin1:length(temp))if(temp[i]氺length(temp)/i〉=fdr.off){fdr.off二temp[i];break;};unigene.est二as.character(est.pvalue[est.pvalue[，〃0V〃]〈=fdr.off，1]);他.off=0.05;temp二sort(est.pvalue[，〃CNS〃]);for(iin1:length(temp))if(temp[i]氺length(temp)/i〉=fdr.off){fdr.off二temp[i];break;};unigene.est二as.character(est.pvalue[est.pvalue[，〃CNS〃]〈=fdr.off，1]);他.off=0.05;temp二sort(est.pvalue[，〃PR〃]);for(iin1:length(temp))if(temp[i]氺length(temp)/i〉=fdr.off){fdr.off二temp[i];break;};unigene.est二as.character(est.pvalue[est.pvalue[，〃PR〃]〈=fdr.off，1]);具體實施方式三本實施方式所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，與具體實施方式一的不同之處在于它是對大豆逆境脅迫響應基因的挖掘在步驟A中，下載大豆EST數(shù)據庫和大豆UniGene數(shù)據庫；在步驟B中，以"cold"，"salt"和"drought"作為與大豆逆境脅迫相關的異常狀態(tài)的關鍵詞，將所述關鍵詞在大豆EST文庫注釋信息文件Gma.lib.info中進行信息檢索，篩選大豆異常狀態(tài)EST文庫，并提取大豆異常狀態(tài)EST文庫的ID，然后，將大豆EST文庫中的其他EST文庫作為大豆正常狀態(tài)EST文庫，并提取大豆正常狀態(tài)EST文庫的ID，所述的在大豆EST文庫注釋信息文件Gma.lib.info中進行信息檢索的檢索項包括主題TITLE、發(fā)育狀態(tài)DEVELOPMENTAL—STAGE和組織VERBAT頂—TISSUE三項；在步驟C中，根據大豆EST文庫注釋信息的分類信息，從所述大豆UniGene數(shù)據庫中的大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中提取大豆表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，同時對大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有的UniGene轉錄組的正常狀態(tài)大豆EST序列信息的條數(shù)和大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有的UniGene轉錄組的異常狀態(tài)大豆EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，將上述所獲得的大豆EST序列信息的所有計數(shù)信息轉化為大豆表達基因UniGene轉錄組的EST表達量；在步驟D中，對所獲得的大豆表達基因UniGene轉錄組差異表達的EST表達量進行超幾何分布檢驗，其中，以大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中正常狀態(tài)normal下的數(shù)據作為大豆表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST表達量，以大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中異常狀態(tài)下的數(shù)據作為大豆表達基因UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST表達量，利用所獲得的大豆表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST表達量、大豆表達基因UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST表達量、大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有UniGene轉錄20組的總的正常狀態(tài)EST表達量和大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—1id中所有UniGene轉錄組的總的異常狀態(tài)EST表達量構建超幾何分布檢驗，利用免費開源軟件R平臺的phyper完成超幾何分布檢驗，計算獲得大豆表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值P-value;在步驟E中，采用FDR方法調整大豆表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue，該調整過程為將大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個超幾何分布檢驗值Pialue，同時設大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有UniGene轉錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調整后的第i個超幾何分布檢驗值P-value為P-value=p(i)*n/i，此等式中所述的P-value和p(i)是重新賦值關系；在步驟F中，設置大豆逆境脅迫所響應的表達基因UniGene轉錄組的超幾何分布檢驗值Pialue閾值為O.Ol，篩選大豆逆境脅迫響應基因，在此篩選過程中，將調整后的超幾何分布檢驗值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗值Pialue所對應的表達基因UniGene轉錄組作為大豆逆境脅迫的響應基因。在步驟G中，利用RT-PCR技術驗證所篩選出的大豆逆境脅迫響應基因為與大豆逆境脅迫相關的誘導基因，具體驗證過程為第一挑選步驟F中所述的大豆逆境脅迫響應基因進行RT-PCR驗證具體挑選過程為將步驟F中篩選出的大豆逆境脅迫的響應基因按照超幾何分布檢驗值Pialue從小到大的順序排列，挑選出最小的8個超幾何分布檢驗值Pialue所對應的大豆逆境脅迫的響應基因，所述8個超幾何分布檢驗值Pialue所對應的大豆逆境脅迫的響應基因分別為Gma.2044、Gma.33428、Gma.32516、Gma.34982、Gma.8518、Gma.38、Gma.3774和Gma.22054;第二大豆總RNA提取以正常培養(yǎng)的大豆21日齡幼苗進行4。C低溫cold、200mmolL—1NaCl鹽salt和lOOmmolL—工甘露醇干旱drought脅迫處理l小時后的大豆21日齡幼苗葉片為材料，采用TRIZOL試劑法提取大豆總RNA，所述采用TRIZOL試劑法提取總RNA的方法參照試劑盒說明書進行，具體為i.稱取100mg所述幼苗葉片樣品放入高溫高壓消毒研缽，迅速在液氮中研磨成粉末，然后加入lmlTRIZOL研磨成勻漿組織；ii.將所述勻漿組織作為標本轉移到1.5ml的離心管中，在153(TC環(huán)境下放置5min，21以徹底分離核蛋白復合體；iii.向所述離心管中加入0.2ml的氯仿，加蓋好后用手劇烈搖晃15s，在1530。C環(huán)境下放置23min，然后離心12000rmin—、15min，28。C，離心后離心管內物質分成三層，下層為紅色的酚，中間層為氯仿相，上層為無色的水相，RNA只存在于水相中，水相占總TRIZOL的60o/o;iv.將上層水相轉移到另一個干凈的離心管中，加入0.5ml異丙醇，在153(TC環(huán)境下靜置IOmin，然后離心12000rmin—、10min，28。C;v.去步驟iv中所述離心管中上清，加入lml75。/。乙醇洗滌RNA沉淀，采用振蕩器混勻，然后離心7500r.min—、5min，28°C;vi.繼續(xù)去步驟v中離心管中上清，并將去上清后的離心管置于真空或空氣中510min，干燥RNA沉淀，加DEPC處理的無菌水15yl，并將加入無菌水的離心管置于-2(TC環(huán)境下保存?zhèn)溆?，提取總RNA完成；第三cDNA的合成以所提取的總RNA為模板，在下游引物的引導下，合成cDNA第一鏈，反應體系如下在O.2mlPCR管中依次加入總RNA2X)卩1下游引物0O卩mol/L)1.0卩1dNTPs(10mmol/L)2.0卩1Supe「HI(反婦酶)1.0卩1RNaseInhibito「〔RNA酶抑制劑)1.O卩l(xiāng)5xRTBuffe「(5xRT緩沖液)4.0卩1滅菌重蒸水_9.0MlTotalVolume〔總體枳)20.0pl所述反應體系混合均勻后稍稍離心，將管壁上的液滴收集到管底，將所述反應體系按如下程序運行65°C，5min;4°C，lmin;55°C，60min;7CTC，15min;瞬時離心，放入PCR儀中進行擴增，進行樣品cDNA的合成；第四RT-PCR半定量分析合成大豆逆境脅迫誘導基因Gma.2044、Gma.33428、Gma.32516、Gma.34982、Gma.8518、Gma.38、Gma.3774、Gma.22054和內參基因Actin的引物，引物如表l:表l大豆逆境脅迫誘導基因RT-PCR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>PCR反應總體積為25yl，其中O.2ymolL—^勺前向引物和反向引物，800ymolL—MnTP，1.5mmolL—1MgCl2，1UrTaq聚合酶和2.5y1的10XPCRbuffer,其余體積的物質用去離子水補齊，輕彈離心管底部使所加各試劑充分混勻，稍稍離心將管壁液滴收集到離心管底部，并將所述液滴放置于PCR自動擴增儀進行擴增；取8.0y1PC財廣增產物，用2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，在10Vcm—、恒壓條件下電泳30min后，在凝膠成像儀下觀察并照相，對基因表達進行RT-PCR半定量分析，所述凝膠成像儀為紫外燈；從圖2中可以看出，內參基因Actin在4種大豆材料中表達水平相同，說明基因表達的內參基因Actin(表達量參照基因)已經調平，所述4種大豆材料分別為正常培養(yǎng)下大豆，低溫、鹽和干旱逆境脅迫下大豆，由于在低溫，鹽和干旱逆境脅迫下的基因表達量與正常培養(yǎng)下的基因表達量相比上升，故所挑選出的大豆逆境脅迫響應基因為與大豆逆境脅迫相關的誘導基因。本實施方式提供了一種對大豆逆境脅迫響應基因的挖掘方法，本實施方式中所述的R平臺來源于http:〃www.r-project.org/，本實施方式中所述的大豆轉錄組文件Gma.gb—cid—lid內容為本實施方式中提取的大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—1id中大豆逆境脅迫狀態(tài)下和大豆正常狀態(tài)下EST序列信息的計數(shù)信息為.1000339753351551Qua.10001339753351552Qna.1000433397533515521&na.100060339753351554Qna.10010339753351554Qna.1001373397533515531Qua.1001533397533515512(^na.63397533515524Qna.10020339753351559Qua.100240339753351552從大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中提取大豆EST序列信息計數(shù)信息可利用下述程序實現(xiàn)open(lib—file,〃〈$ARGV〃)；while(defined($in—line=〈lib—file》)chomp$in—line;$library{$in—line}++;close(libfile);■08678墜^卿亟涵i17241，Z.〖涵JL涵雄^i涵,io5S2:2:2iCN-:2;2;oio:o:oio一o;o！o;o:OIojo;lili1:li1;1.i1:2i24open(cid—file,〃〈$ARGV[1]〃)；while(defined($in—line=〈cid—file》)chomp$in—line;if($in—line!八-/)@data=split(/\s+/，line);$gb=$data;$ug="Gma.$data[l]";$library=$data[2];$all—contig{$ug}++;if(!exists($ist—contig{$ug})){$ist—contig{$ug}=0;};{$ist—contig{$ug}++;};close(cid—file);foreach(sort(keys%all—contig))$all—num+=$all—contig{$—};$ist—num+=$ist—contig{$—};foreach(sort(keys%all—contig))print"$—\t$ist—contig{$—}\t$all—num\t$ist—num\t$all—contig{$—}\n差異表達的EST表達量進行超幾何分布檢驗計算，獲得的大豆表達基因UniGene轉錄組在逆境脅迫狀態(tài)下與在正常狀態(tài)下差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue，所述超幾何分布檢驗值Pialue具體為Gna.20441223515530459^1314.01E—110Gna.33428106351563045981207.19E~90Gna.3251659351563045961056.50E—32Gna.349622035156304596224.04E—20Gna.85182935155304596497.02E—18Gna.381935156304596232.56E—17Gna.37742435155304596383.2犯—1642351553045961312.81E—12Gna.175171435155304596214.90E—11pna一15941235155304596166.43E—11Gna.78SO2235155304596498.艦—11G^ia.508281351553045963801.15E—10Gna.195311035155304596139.29E—10Gna.215841135155304598161.83E~09G叫.268^71635155045984.03E""Q9Gna.142722435155304598674.88E""09Gna.3006120304^98506.81E~09Gna.166441335155304598241.15E""08Gna.220588351553Q4598101.Gna.3507173515530459881.31E""08上述數(shù)據的獲得方法可以采用實施方式二中的獲得人類超幾何分布檢驗值Pialue的方法。具體實施方式四本實施方式所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，與具體實施方式三的不同之處在于步驟G中所述內參基因Actin的調平通過調節(jié)RT-PCR模板cDNA的上樣量完成，具體為如果PCR儀中擴增產物條帶過亮，則按比例減少模板cDNA，如果PCR儀中擴增產物條帶較暗，則增加模板cDNA，直到內參基因Actin在4種大豆材料下的擴增條帶亮度相同為止，此時內參基因Actin已經調平。權利要求1.一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，其特征在于它的挖掘過程為步驟A下載EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫，并對所述的UniGene數(shù)據庫中的EST序列信息按照物種類型進行分類，接下來執(zhí)行步驟B；步驟B對所述的EST文庫注釋信息進行信息檢索，進而對EST文庫注釋信息進行分類，接下來執(zhí)行步驟C；步驟C根據EST文庫注釋信息的分類信息計算表達基因UniGene轉錄組的EST表達量，接下來執(zhí)行步驟D；步驟D對所獲得的表達基因UniGene轉錄組的EST表達量進行超幾何分布檢驗，計算獲得表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值P-value，接下來執(zhí)行步驟E；步驟E采用FDR方法調整表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值P-value，接下來執(zhí)行步驟F；步驟F設置表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值P-value閾值為0.01，篩選異常狀態(tài)響應基因，接下來執(zhí)行步驟G；步驟G利用RT-PCR技術驗證所篩選出的異常狀態(tài)響應基因為與性狀相關的誘導基因。2.根據權利要求l所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟B的具體過程為首先，收集生物體異常狀態(tài)的關鍵詞，用所收集的每一個生物體異常狀態(tài)的關鍵詞在EST文庫注釋信息中進行信息檢索，篩選異常狀態(tài)EST文庫，并提取異常狀態(tài)EST文庫的ID，然后，收集生物體正常狀態(tài)的關鍵詞，用所收集的每一個生物體正常狀態(tài)的關鍵詞在所述的EST文庫注釋信息中進行信息檢索，篩選正常狀態(tài)EST文庫，并提取正常狀態(tài)EST文庫的ID，所述的在EST文庫注釋信息中進行信息檢索的檢索項包括主題TITLE、發(fā)育狀態(tài)DEVELOPMENTAL—STAGE和組織VERBAT頂—TISSUE三項。3.根據權利要求l所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟C的具體過程為根據EST文庫注釋信息的分類信息，從所述UniGene數(shù)據庫中的UniGene轉錄組文件中提取表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，同時對所述UniGene轉錄組文件中的所有的UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和所述UniGene轉錄組文件中的所有的UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，將上述所獲得的EST序列信息的所有計數(shù)信息轉化為EST表達量。4.根據權利要求l所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟C的具體過程為根據UniGene數(shù)據庫中按照EST文庫注釋信息的分類信息對UniGene轉錄組文件中所有的UniGene轉錄組所完善建立的EST序列信息，直接提取EST序列信息的所有計數(shù)信息，將所述計數(shù)信息轉化為相應的EST表達量。5.根據權利要求l所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟D的具體過程為設表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST表達量為a，表達基因UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST表達量為b，且UniGene轉錄組文件中所有UniGene轉錄組的總的正常狀態(tài)EST表達量為c，所述UniGene轉錄組文件中所有UniGene轉錄組的總的異常狀態(tài)EST表達量為d，以a、b、c和d四個數(shù)構建超幾何分布檢驗，利用免費開源軟件R平臺的phyper完成超幾何分布檢驗，公式一<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>利用公式一計算獲得表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue。6.根據權利要求l所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟E的具體調整過程為將UniGene轉錄組文件中所有UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個超幾何分布檢驗值Pialue，同時設所述UniGene轉錄組文件中所有UniGene轉錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調整后的第i個超幾何分布檢驗值P-value為P-value=p(i)*n/i，此等式中所述的P-value和p(i)是重新賦值關系。7.根據權利要求l所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，其特征在于所述步驟F的具體篩選過程為將調整后的超幾何分布檢驗值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗值Pialue所對應的表達基因UniGene轉錄組作為異常狀態(tài)的響應基因。8.根據權利要求l所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，其特征在于所述挖掘方法是對人類癌癥響應基因的挖掘在步驟A中，下載人類EST數(shù)據庫和人類UniGene數(shù)據庫；在步驟B中，直接提取人類EST文庫注釋信息，首先，提取人類異常狀態(tài)EST文庫，并提取所述的人類異常狀態(tài)EST文庫的ID，然后，提取人類正常狀態(tài)EST文庫，并提取所述的人類正常狀態(tài)EST文庫的ID;在步驟C中，根據人類EST文庫注釋信息的分類信息，從所述人類UniGene數(shù)據庫中的人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中提取人類表達基因UniGene轉錄組的健康狀態(tài)HealthState下乳房月中瘤breasttumor，白血病leukemia，卵巢月中瘤ovariantumor，中樞神經系統(tǒng)CNS的原始神經夕卜胚層月中瘤primitiveneuroectodermaltumor,前歹[J腺癌prostatecancer和正常狀態(tài)normal的人類EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，同時對人類UniGene轉錄組文件Hs.profi1es中所有的UniGene轉錄組的正常狀態(tài)人類EST序列信息的條數(shù)和人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有的UniGene轉錄組的異常狀態(tài)人類EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，將上述所獲得的人類EST序列信息的所有計數(shù)信息轉化為人類表達基因UniGene轉錄組的EST表達量；在步驟D中，對所獲得的人類表達基因UniGene轉錄組的EST表達量進行超幾何分布檢驗，其中，以人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中正常狀態(tài)normal下的數(shù)據作為人類表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST表達量，以人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中其它癌癥病變狀態(tài)作為異常狀態(tài)，并將所述異常狀態(tài)下的數(shù)據作為人類表達基因UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST表達量，利用所獲得的人類表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST表達量、人類表達基因UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST表達量、人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉錄組的總的正常狀態(tài)EST表達量和人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉錄組的總的異常狀態(tài)EST表達量構建超幾何分布檢驗，利用免費開源軟件R平臺的phyper完成超幾何分布檢驗，計算獲得人類表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue;在步驟E中，采用FDR方法調整人類表達基因UniGene轉錄組的超幾何分布檢驗值Pialue，該具體調整過程為將人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個超幾何分布檢驗值Pialue，同時設人類UniGene轉錄組文件Hs.profiles中所有UniGene轉錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調整后的第i個超幾何分布檢驗值P-value為P-value=p(i)*n/i，此等式中所述的P-value和p(i)是重新賦值關系；在步驟F中，設置人類癌癥所響應的表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue閾值為O.Ol，篩選人類癌癥響應基因，在此篩選過程中，將調整后的超幾何分布檢驗值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗值Pialue所對應的表達基因UniGene轉錄組作為人類癌癥的響應基因；在步驟G中，利用RT-PCR技術驗證所篩選出的人類癌癥響應基因為與人類癌癥相關的誘導基因。9.根據權利要求l所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，其特征在于它是對大豆逆境脅迫響應基因的挖掘在步驟A中，下載大豆EST數(shù)據庫和大豆UniGene數(shù)據庫；在步驟B中，以"cold"，"salt"和"drought"作為與大豆逆境脅迫相關的異常狀態(tài)的關鍵詞，將所述關鍵詞在大豆EST文庫注釋信息文件Gma.lib.info中進行信息檢索，篩選大豆異常狀態(tài)EST文庫，并提取大豆異常狀態(tài)EST文庫的ID，然后，將大豆EST文庫中的其他EST文庫作為大豆正常狀態(tài)EST文庫，并提取大豆正常狀態(tài)EST文庫的ID，所述的在大豆EST文庫注釋信息文件Gma.lib.info中進行信息的檢索，檢索項包括所述EST文庫注釋信息文件Gma.lib.info中的主題TITLE、發(fā)育狀態(tài)DEVELOPMENTAL—STAGE和組織VERBAT頂—TISSUE三項；在步驟C中，根據大豆EST文庫注釋信息的分類信息，從所述大豆UniGene數(shù)據庫中的大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中提取大豆表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)和異常狀態(tài)EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，同時對大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有的UniGene轉錄組的正常狀態(tài)大豆EST序列信息的條數(shù)和大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有的UniGene轉錄組的異常狀態(tài)大豆EST序列信息的條數(shù)進行計數(shù)，將上述所獲得的大豆EST序列信息的所有計數(shù)信息轉化為大豆表達基因UniGene轉錄組的EST表達量；在步驟D中，對所獲得的大豆表達基因UniGene轉錄組的EST表達量進行超幾何分布檢驗，其中，以大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中正常狀態(tài)normal下的數(shù)據作為大豆表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST表達量，以大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中異常狀態(tài)下的數(shù)據作為大豆表達基因UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST表達量，利用所獲得的大豆表達基因UniGene轉錄組的正常狀態(tài)EST表達量、大豆表達基因UniGene轉錄組的異常狀態(tài)EST表達量、大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—1id中所有UniGene轉錄組的總的正常狀態(tài)EST表達量和大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有UniGene轉錄組的總的異常狀態(tài)EST表達量構建超幾何分布檢驗，利用免費開源軟件R平臺的phyper完成超幾何分布檢驗，計算獲得大豆表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue;在步驟E中，采用FDR方法調整大豆表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue，該調整過程為將大豆UniGene轉錄組文件Gma.gb—cid—lid中所有UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue按照從小到大的順序依次排列，將p(i)定義為排列后的第i個超幾何分布檢驗值Pialue，同時設大豆所有UniGene轉錄組的總數(shù)為n，所述的i和n均為自然數(shù)，且i《n，則調整后的第i個超幾何分布檢驗值Pialue為Pialue=p(i)*n/i，此等式中所述的Pialue和p(i)是重新賦值關系；在步驟F中，設置大豆逆境脅迫所響應的表達基因UniGene轉錄組差異表達的超幾何分布檢驗值Pialue閾值為O.Ol，篩選大豆逆境脅迫響應基因，在此篩選過程中，將調整后的超幾何分布檢驗值Pialue閾值以下的超幾何分布檢驗值Pialue所對應的表達基因UniGene轉錄組作為大豆逆境脅迫的響應基因；在步驟G中，利用RT-PCR技術驗證所篩選出的大豆逆境脅迫響應基因為與大豆逆境脅迫相關的誘導基因，具體驗證過程為第一挑選步驟F中所述的大豆逆境脅迫響應基因進行RT-PCR驗證具體挑選過程為將步驟F中篩選出的大豆逆境脅迫的響應基因按照超幾何分布檢驗值Pialue從小到大的順序排列，挑選出最小的8個超幾何分布檢驗值Pialue所對應的大豆逆境脅迫的響應基因，所述8個超幾何分布檢驗值Pialue所對應的大豆逆境脅迫的響應基因分別為Gma.2044、Gma.33428、Gma.32516、Gma.34982、Gma.8518、Gma.38、Gma.3774和Gma.22054;第二大豆總RNA提取以正常培養(yǎng)的大豆21日齡幼苗進行4。C低溫cold、200mmolL-1NaCl鹽salt和100mmolL-l甘露醇干旱drought脅迫處理l小時后的大豆21日齡幼苗葉片為材料，采用TRIZOL試劑法提取大豆總RNA，所述采用TRIZOL試劑法提取總RNA的方法參照試劑盒說明書進行，具體為i.稱取100mg所述幼苗葉片樣品放入高溫高壓消毒研缽，迅速在液氮中研磨成粉末，然后加入lmlTRIZOL研磨成勻漿組織；ii.將所述勻漿組織作為標本轉移到1.5ml的離心管中，在153(TC環(huán)境下放置5min，以徹底分離核蛋白復合體；iii.向所述離心管中加入0.2ml的氯仿，加蓋好后用手劇烈搖晃15s，在1530。C環(huán)境下放置23min，然后離心12000rmin-1，15min，28。C，離心后離心管內物質分成三層，下層為紅色的酚，中間層為氯仿相，上層為無色的水相，RNA只存在于水相中，水相占總TRIZOL的60o/o;iv.將上層水相轉移到另一個干凈的離心管中，加入0.5ml異丙醇，在153(TC環(huán)境下靜置IOmin，然后離心12000rmin-1，10min，28。C;v.去步驟iv中所述離心管中上清，加入lml75。/。乙醇洗滌RNA沉淀，采用振蕩器混勻，然后離心7500r*min-1，5min，28°C;vi.繼續(xù)去步驟v中離心管中上清，并將去上清后的離心管置于真空或空氣中510min，干燥RNA沉淀，加DEPC處理的無菌水15y1，并將加入無菌水的離心管置于-2(TC環(huán)境下保存?zhèn)溆茫崛】俁NA完成；第三cDNA的合成以所提取的總RNA為模板，在下游引物的引導下，合成cDNA第一鏈，反應體系如下在O.2mlPCR管中依次加入總RNA2X)卩1下游引物0O卩mol/L)1.0卩1dNTPs(10mmol/L)2.0卩1Supe「HI(反婦酶)1.0卩1RNaseInhibito「〔RNA酶抑制劑)1.O卩l(xiāng)5xRTBuffe「(5xRT緩沖液)4.0卩1滅菌重蒸水_9.0MlTotalVolume〔總體枳)20.0pl所述反應體系混合均勻后稍稍離心，將管壁上的液滴收集到管底，將所述反應體系按如下程序運行65°C，5min;4°C，lmin;55°C，60min;7CTC，15min;瞬時離心，放入PCR儀中進行擴增，進行樣品cDNA的合成；第四RT-PCR半定量分析合成大豆逆境脅迫誘導基因Gma.2044、Gma.33428、Gma.32516、Gma.34982、Gma.8518、Gma.38、Gma.3774、Gma.22054和內參基因Actin的引物，引物如表l:表lt豆.細辦迫i紹細RT-PCR引物_站E"I時向引物反向3f物Gma-2044MACTTTGACTGGCAAfiACCATTATCTGAACTCTO:ACCTCCAAGG恥GAAGTGAAC下CAGACMGACCCfflXAAGCTGAGAGAGGAAACcOTCTGcrGAAAGAGA肌虹ACCACTACCTTCACAACGma.33ACATGCCTTCTACAACACCOTCKTGC(TCAtCCCT(TATAnTG亂3774CTGGTTCTATGCCACCrTCTT匚TCTCCTCTGTATTTTCTCCTCGGTG亂22054ActknCKAGCACTG恥TCATCACAACTACTGCTKAGCAGTGKAAATGTPCR反應總體積為25y1，其中0.2ymo1L-l的前向引物和反向引物，800ymolL-ldNTP，1.5mmolL-lMgC12，1UrTaq聚合酶和2.5y1的10XPCRbuffer，其余體積的物質用去離子水補齊，輕彈離心管底部使所加各試劑充分混勻，稍稍離心將管壁液滴收集到離心管底部，并將所述液滴放置于PCR自動擴增儀進行擴增；取8.0y1PC財廣增產物，用2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，在10Vcm-l恒壓條件下電泳30min后，在凝膠成像儀下觀察并照相，對基因表達進行RT-PCR半定量分析，所述凝膠成像儀為紫外燈；內參基因Actin在4種大豆材料中表達水平相同，說明基因表達的內參基因Actin已經調平，所述4種大豆材料分別為正常培養(yǎng)下大豆，低溫、鹽和干旱逆境脅迫下大豆，由于在低溫，鹽和干旱逆境脅迫下的基因表達量與正常培養(yǎng)下的基因表達量相比上升，故所挑選出的大豆逆境脅迫響應基因為與大豆逆境脅迫相關的誘導基因。10根據權利要求9所述的一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，其特征在于步驟G中所述內參基因Actin的調平通過調節(jié)RT-PCR模板cDNA的上樣量完成，具體為如果PCR儀中擴增產物條帶過亮，則按比例減少模板cDNA，如果PCR儀中擴增產物條帶較暗，則增加模板cDNA，直到內參基因Actin在4種大豆材料下的擴增條帶亮度相同為止，此時內參基因Actin已經調平。全文摘要一種基于EST數(shù)據庫和UniGene數(shù)據庫的基因挖掘方法，它涉及應用生物信息學領域。它克服了現(xiàn)有的基因挖掘方法中無法正確挖掘與性狀相關的誘導基因的問題。本發(fā)明的方法利用EST數(shù)據庫中的EST序列將UniGene數(shù)據庫中的表達基因UniGene轉錄組的EST表達量數(shù)字化，構建超幾何分布檢驗，并結合FDR方法調整表達基因UniGene轉錄組的差異表達的超幾何分布檢驗值P-value，篩選異常狀態(tài)響應基因，最后利用RT-PCR技術驗證所述響應基因為與性狀相關的誘導基因。本方法可以用于人類疾病發(fā)生、動植物生長發(fā)育調控、動植物疾病調控過程以及動植物逆境脅迫等性狀相關誘導基因的挖掘。文檔編號G06F19/00GK101661536SQ20091030848公開日2010年3月3日申請日期2009年10月20日優(yōu)先權日2009年10月20日發(fā)明者季佐軍,華才,朱延明,勇李,束永俊,錫柏,巍紀申請人:東北農業(yè)大學