一種抑制FABP4基因表達的siRNA及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術領域，具體地說，是一種抑制FABP4基因表達的SiRNA及 其在制備減肥、降脂或降糖的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘 發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是生物體在進化過程中抵御外界病毒等感染和維 持基因組穩(wěn)定性的一種保護型機制。當病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機 整合到宿主細胞基因組內，并利用宿主細胞進行轉錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細胞對這 些dsRNA迅疾產(chǎn)生反應，其胞質中RNaselll核酶家族的Dicer將dsRNA切割成多個具有特 定長度和結構的小片段RNA(即siRNA)。siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義和 反義鏈，而反義siRNA再與體內一些酶（包括內切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘 導的沉默復合物（RISC)。RISC與外源性基因表達mRNA的同源區(qū)進行特異性結合，RISC具 有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。 被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。siRNA不僅 能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA依賴的RNA聚合 酶作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從 而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。RNAi技術具有高度的特異性，與傳 統(tǒng)的反義RNA技術相比，RNAi技術的沉默效率更高、效果更好，而慢性病毒載體介導的RNAi 技術則可以提供長期的基因表達抑制，RNAi作為一種嶄新的技術手段，為基因功能、基因表 達調控、基因治療等方面的研宄提供了一個全新的方法及其理論基礎。
[0003] 使用RNAi治療疾病的思路是根據(jù)病原體的致病基因序列以及生物體內與疾病發(fā) 生相關的基因序列，設計和制備與這些基因序列具有同源性的小干擾RNA(siRNA)，然后通 過某種方式將siRNA轉移到動物體內使有關疾病基因發(fā)生沉默，從而達到治療目的。直接 轉染合成的siRNA能特異性抑制動物細胞內同源基因的表達，但是細胞內siRNA很容易降 解，因此這種方法不能實現(xiàn)穩(wěn)定的RNA干擾。而慢病毒載體在動物細胞內感染效率高，免 疫原型低，既能干擾分裂期的細胞又能感染非分裂期的細胞。由于病毒載體的這些特性， 慢病毒介導RNA干擾能在各類動物細胞內長期穩(wěn)定地表達siRNA，抑制相關基因表達，因此 該方法具有高效、穩(wěn)定、特異性強、適用范圍廣的特點。在siRNA設計的過程中，不同位點的 siRNA對基因的抑制作用不同，siRNA的抑制效率與基因的設計位點密切相關。因此，尋找 最合適的siRNA對于RNA干擾的應用至關重要。
[0004] 脂肪酸結合蛋白（Fattyacidbindingproteins，F(xiàn)ABPs)是一系列脂質伴侶蛋 白，其蛋白中央空腔可以結合長鏈脂肪酸及其它一些疏水性配體。脂肪細胞型脂肪酸結合 蛋白（FABP4)是細胞內FABPs家族成員之一。早期研宄發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4的基本功能包括以非共 價方式和可逆性結合飽和及不飽和長鏈脂肪酸，促進脂肪酸的代謝和轉運；FABP4能夠可 逆性結合飽和及不飽和長鏈脂肪酸，促進脂肪酸代謝和轉運；脂肪細胞分化過程中FABP4 的表達及活性顯著增強，是脂肪細胞分化的標志物之一。此外，F(xiàn)ABP4在其他生物學過程 中尤其是代謝綜合征的許多方面具有重要作用。FABP4基因敲除小鼠可以抑制由高脂肪飲 食誘導的動脈粥樣硬化發(fā)展，在巨噬細胞中誘導FABP4高表達會促進泡沫細胞形成，表明 FABP4在動脈粥樣硬化的發(fā)展中也具有重要作用。
[0005] 中國專利文獻201010127886. 8,公開了一組能有效下調PRDM1 0表達的 siRNA分子及其應用，所述的siRNA能有效下調淋巴瘤細胞中PRDM10。中國專利文獻 201410541314. 2公開了一種抑制S100A8基因表達的siRNA，所述的siRNS能降低S100A8基 因的表達。中國專利文獻CN201410474752. 1公開了一種抑制奶牛EEF1D基因表達的siRNA， 該siRNA能有效降低奶牛EEF1D基因的表達量。中國專利文獻CN201110107036. 6公開了 一種抑制caspase-3基因表達的siRNA，將所述的siRNA進入到神經(jīng)細胞時，可以顯著提高 神經(jīng)細胞的活力，明顯減少神經(jīng)細胞凋亡相關基因caspase-3基因的表達。但是關于能有 效抑制FABP4基因表達的siRNA，目前還未見報道。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種能有效抑制FABP4基因表達的 siRNA〇
[0007] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種DNA分子。
[0008] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種重組慢病毒表達載體。
[0009] 本發(fā)明的第四個目的是，提供一種慢病毒。
[0010] 本發(fā)明的第五個目的是，提供上述SiRNA、DNA分子、重組慢病毒表達載體、慢病毒 的用途。
[0011] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0012] 一種抑制FABP4基因表達的SiRNA，其特征在于，所述的SiRNA序列為：
[0013]正義鏈：5' -CGACCACAAUAAAGAGAAA-3'
[0014]反義鏈：5 ' -UUUCUCUUUAUUGUGGUCG-3 '。
[0015] 所述的抑制FABP4基因表達的siRNA序列3'端垂懸有dTdT。
[0016] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0017] -種DNA分子，其特征在于，所述DNA分子序列為：
[0018]正義鏈：5 '-GATCCGCGACCACAATAAAGAGAAATTCAAGAGATTTCTCTTTATTGTGGTCGCTTTTT TG-3,
[0019]反義鏈：5 '-AATTCAAAAAAGCGACCACAATAAAGAGAAATCTCTTGAATTTCTCTTTATTGTGGTCG CG-3'。
[0020] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0021] 包含如上所述DNA分子的重組慢病毒表達載體。
[0022] 所述重組慢病毒表達載體是將權利要求3所述的DNA分子插入載體質粒的BamHI 和EcoRI位點間得到。
[0023] 所述的載體質粒為LV3穿梭質粒。
[0024] 為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0025] -種慢病毒，由如上所述的重組慢病毒表達載體和病毒包裝系統(tǒng)共轉染病毒包裝 細胞得到。
[0026]所述病毒包裝系統(tǒng)含有pGag/Pol，pRev和pVSV-G。
[0027]所述病毒包裝細胞為293T細胞。
[0028] 為實現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術方案是：
[0029] 如上所述的siRNA、DNA分子、重組表達載體、慢病毒在制備減肥藥物中的應用。
[0030] 如上所述的siRNA、DNA分子、重組表達載體、慢病毒在制備抑制糖化血紅蛋白和/ 或總膽固醇水平的藥物中的應用。
[0031] 一種抑制小鼠FABP4基因表達的方法，是將本發(fā)明提供的siRNA、DNA分子（即實 施例的shDNA模板序列）、慢病毒轉染表達FABP4基因的細胞。所述的細胞為3T3-L1前脂 肪細胞。
[0032] 本發(fā)明所提供的siRNA還用于制備與FABP4基因相關的疾病的治療藥物，即通過 本發(fā)明提供的siRNA、DNA分子（即實施例的shDNA模板序列）、慢病毒的使用達到降低受 體的FABP4基因表達后，對相關疾病的治療有一定/顯著效果的產(chǎn)品、方法或用途都在本發(fā) 明的保護范圍以內。
[0033] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0034] 本發(fā)明針對FABP4基因，設計了三對siRNA序列，通過細胞轉染實驗篩選出一條可 以有效下調目的基因表達的siRNA。根據(jù)所篩選的siRNA-368序列，構建了相應的慢病毒表 達載體，通過高脂肥胖小鼠轉染及抑制小鼠內臟脂肪組織FABP4基因表達實驗，證實本發(fā) 明所篩選的siRNA、構建的慢病毒能有效抑制小鼠FABP4基因表達，降低高脂肥胖小鼠的體 重、糖化血紅蛋白、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇的水平。
【附圖說明】
[0035] 附圖1為siRNA轉染脂肪細胞的熒光顯微攝片。
[0036] 附圖2為siRNA慢病毒載體測序結果