一種馬鈴薯卷葉病毒rt-lamp檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP 檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯是全世界最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，既可以作為人類(lèi)的消費(fèi)品、動(dòng)物飼料，也 可以作為釀酒和提取淀粉的原料。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，目前馬鈴薯是世界上僅次于小 麥、水稻和玉米的第四種主要農(nóng)作物。我國(guó)馬鈴薯的種植面積和產(chǎn)量居世界第一位。長(zhǎng)期以 來(lái)，馬鈴薯多種病毒及類(lèi)病毒對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)造成了極大地威脅，是引起馬鈴薯品種退化的 主要原因，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量。其中馬鈴薯Y病毒和馬鈴薯卷葉病毒是危害最嚴(yán) 重的病毒。
[0003] 馬鈴薯卷葉病毒(potato leafroll virus，PLRV)是馬鈴薯卷葉病毒屬成員，以前 將其劃為黃癥病毒屬(Lureovirus)成員，分布于世界各馬鈴薯種植區(qū)。病毒粒體球狀，等軸 對(duì)稱(chēng)，直徑24nm，基因組為正鏈RNA，基因組全長(zhǎng)5882bp，其有6個(gè)ORFs。該病毒可通過(guò)種薯傳 播，在田間病毒嚴(yán)格蟲(chóng)傳。病毒在寄主體內(nèi)含量低，主要集中于寄主維管束中，因此難于大 量提純，致使對(duì)該病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢。
[0004] 大規(guī)模組織培養(yǎng)無(wú)病毒種薯生產(chǎn)是控制馬鈴薯病毒病的主要方法，而優(yōu)良種薯生 產(chǎn)要求建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的病毒檢測(cè)技術(shù)。傳統(tǒng)的馬鈴薯病毒檢測(cè)鑒定方法為指示植物 法，即通過(guò)具有特征性的感染癥狀從而判斷是否存在病毒，而目前大多采用的診斷方法主 要是酶聯(lián)免疫檢測(cè)。雖然酶聯(lián)免疫檢測(cè)法比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法靈敏度提高了許多，但仍然存 在不易檢測(cè)交叉感染的病毒和不能檢測(cè)休眠種薯中的病毒等方面的缺陷。因此分子生物學(xué) 技術(shù)成為馬鈴薯病毒檢測(cè)的發(fā)展方向。開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確、高效的PLRV分子生物學(xué)檢測(cè)方法， 能夠監(jiān)控馬鈴薯種薯的質(zhì)量，快速鑒定田間植株病害，及時(shí)監(jiān)控發(fā)病情況，符合產(chǎn)業(yè)需求。
[0005] 環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 近些年發(fā)展起來(lái)的一種新型的核酸擴(kuò)增方法(見(jiàn)Notomi T等，Nucleic Acids Res.2000Jun 15;28(12):E63)，而逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)基于LAMP建立，其在反應(yīng)體系 中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶，使RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的LAMP擴(kuò)增在同一試管中一步完成。此外，RT-LAMP還具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn):該技術(shù)依賴(lài)于能夠識(shí)別靶序列上6個(gè) 特異性區(qū)域的引物和具有解旋功能且呈瀑布式擴(kuò)增的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下可以 高效、快速和特異性地?cái)U(kuò)增靶序列。與RT-PCR相比，RT-LAMP的靈敏度顯著較高，優(yōu)勢(shì)明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。 [0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其包括4條特異性引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：
[0008]外引物F3:AGGCGCGCTAACAGAGTT(SEQ ID N0:1)
[0009] 外引物B3:CCCGAAGGTGAAACTTCCTT(SEQ ID N0:2)
[0010] 內(nèi)引物FIP:GGCGATTGCCTCCTCTTCTACG-GCCAGTGGTTATGGTCACG(SEQ ID N0:3)
[0011] 內(nèi)引物BIP:AAGAACTGGAGTTCCCCGAGGA-GCCCATGAGGTTGTCCTTTG(SEQ ID N0:4)。
[0012] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還包括反應(yīng)緩沖液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚合酶和核 酸染料，其中所述反應(yīng)緩沖液由2mM dNTP、10 X ThermoPo 1反應(yīng)緩沖液、0.6mM甜菜堿和6mM Mg2+組成。
[0013]在本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選外引物F3和外引物B3的濃度均為0.2μπι〇1/μ1，內(nèi)引物 FIP和內(nèi)引物ΒΙΡ的濃度均為1.2μπιο1/μ1。
[0014] 在本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選核酸染料為SYBR Green I。
[0015] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒還可以包括RNA提取試劑以及陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0016] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的試劑盒對(duì)馬鈴薯卷葉病毒進(jìn)行檢 測(cè)的方法。
[0017] 本發(fā)明的馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法針對(duì)PLRV的包膜蛋白編 碼基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)特異性和靈敏度高的4條引物，且一步完成逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增步驟，假陽(yáng) 性率低、快速、高效，且通過(guò)肉眼觀察顏色變化即可判定結(jié)果，無(wú)需電泳和紫外觀察等步驟， 無(wú)需使用熱循環(huán)儀等儀器，成本低、操作簡(jiǎn)單、鑒定簡(jiǎn)便，適于進(jìn)行PLRV的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室和田 間檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0019] 實(shí)施例1馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒的制備
[0020] 1.1試劑
[0021]引物由天根生化科技(北京)有限公司合成;Bst DNA聚合酶和lOXThermoPol反應(yīng) 緩沖液購(gòu)自NEB;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；SYBR Green I和TRIZ0L Reagent購(gòu)自 Invitrogen;其余PCR所需試劑購(gòu)自Sigma。
[0022] 1.2試劑盒的制備：
[0023] 反應(yīng)緩沖液，按照以下配方配制：2mM dNTP、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、0.6mM甜 菜喊和6mM Mg2+;
[0024] 4條特異性引物：外引物F3,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；外引物B3,其核苷 酸序列如SEQ ID N0:2所示；內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，內(nèi)引物BIP，其 核苷酸序列如SEQ ID如:4所示。其中外引物？3和外引物83的濃度為0.2以111〇1/^1，內(nèi)引物 FIP和內(nèi)引物BIP的濃度為1.2μπιο1/μ1。
[0025] 2U的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；
[0026] 8U的Bst DNA聚合酶；
[0027] 核酸染料：1000 X SYBR Green I;
[0028] 陽(yáng)性對(duì)照：馬鈴薯卷葉病毒基因組DNA;
[0029] 陰性對(duì)照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
[0030] 實(shí)施例2馬鈴薯卷葉病毒特異性檢測(cè)
[0031] 2 · 1RT-LAMP 特異性檢測(cè)
[0032] 待測(cè)樣品為采自河北永年蔬菜基地的馬鈴薯葉片，包括經(jīng)ELISA法鑒定已感染 PLRV的6份樣品以及已感染馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒和黃瓜花葉病毒的各2 份樣品。
[0033] 使用實(shí)施例1制備的試劑盒按照以下步驟對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測(cè)：
[0034] 1.利用TRIZOL Reagent提取待測(cè)樣品RNA，具體方法如下：
[0035] (1)剪下適量葉片，充分研磨，再加 lml Trizol Reagent充分研磨，室溫放置5min;
[0036] (2)加入氯仿200μ1，充分振蕩15sec，室溫放置2-3min后，12000 Xg，4°C離心 lOmin；
[0037] (3)取上層水相至新管中，加入等體積異丙醇，室溫放置30min，12000 X g，4°C離心 lOmin，棄上清液；
[0038] (4)沉淀用DEPC水配置的75 %乙醇洗滌，7500 X g，4°C離心5min，棄上清液；
[0039] (5)真空干燥RNA沉淀，加入DEPC水40μ1溶解RNA。
[0040] 2.在PCR管中制備25μ1的RT-LAMP反應(yīng)體系，其包括外引物F3 ΙμL、外引物Β3 ΙμL、 內(nèi)引物FIP ΙμL、內(nèi)引物ΒΙΡ ΙμL、反應(yīng)緩沖液2.5yl、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶lyl、Bst DNA聚合酶ΙμL、 模板2μ1，加水補(bǔ)充至25μ1，并以馬鈴薯卷葉病毒基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以100mM Tris-HC1 pH 8.0和50mM EDTA作為陰性對(duì)照；
[0041 ] 3. LAMP反應(yīng):將步驟2的PCR管于63°C恒溫反應(yīng)80min，隨后80°C 5min失活；
[0042] 4.結(jié)果判讀:在步驟3的所得反應(yīng)產(chǎn)物中加入ΙμL SYBR Green I，如反應(yīng)液顏色為 橙色，表示結(jié)果為陰性，樣品中不含PLRV;如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽(yáng)性，樣品中含 有PLRV〇
[0043] 2.2檢測(cè)結(jié)果
[0044] 6份PLRV樣品的PCR管中均呈現(xiàn)綠色，而馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、馬鈴薯A病毒 和黃瓜花葉病毒的PCR顯色結(jié)果均為陰性，表明所設(shè)計(jì)的4條特異性引物能夠準(zhǔn)確地將PLRV 與其余常見(jiàn)的感染馬鈴薯的病毒區(qū)分開(kāi)來(lái)，具有很強(qiáng)的特異性。
[0045] 實(shí)施例3馬鈴薯卷葉病毒靈敏度檢測(cè)
[0046] 3 · 1RT-LAMP 靈敏度檢測(cè)
[0047] 取實(shí)施例2中鑒定結(jié)果為馬鈴薯卷葉病毒陽(yáng)性的RNA樣品，并以10倍濃度系列稀釋 法稀釋成l〇〇fg-l〇〇ng共7個(gè)梯度。
[0048] RT-LAMP反應(yīng)及結(jié)果判讀步驟同實(shí)施例2的步驟2-4。
[0049] 3.2檢測(cè)結(jié)果
[0050] 除了 DNA濃度為100fg的PCR管顯示橙色之外，其余濃度的PCR管中均呈現(xiàn)綠色，表 明本發(fā)明的檢測(cè)方法的最低檢測(cè)極限達(dá)到lpg DNA，靈敏度很高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，包括4條特異性引物，所述引物的核苷酸 序列為： 外引物F3:AGGCGCGCTAACAGAGTT(SEQ ID N0:1) 外引物B3:CCCGAAGGTGAAACTTCCTT(SEQ ID NO:2) 內(nèi)引物FIP:GGCGATTGCCTCCTCTTCTACG-GCCAGTGGT TATGGTCACG(SEQ ID N0:3) 內(nèi)引物BIP:AAGAACTGGAGTTCCCCGAGGA-GCCCATGA GGTTGTCCTTTG(SEQ ID N0:4)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括反應(yīng)緩沖液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst DNA聚 合酶和核酸染料。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述反應(yīng)緩沖液由2mM dNTP、10 X ThermoPol反 應(yīng)緩沖液、〇. 6mM甜菜堿和6mM Mg2+組成。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述核酸染料為SYBR Green I。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括RNA提取試劑以及陽(yáng)性對(duì)照和 陰性對(duì)照。6. 使用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑盒對(duì)馬鈴薯卷葉病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其包括4條特異性引物、反應(yīng)緩沖液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Bst？DNA聚合酶和核酸染料。本發(fā)明還涉及馬鈴薯卷葉病毒RT-LAMP檢測(cè)方法。使用本發(fā)明的試劑盒及檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確地將馬鈴薯卷葉病毒和易侵染馬鈴薯的其他植物病毒區(qū)分開(kāi)來(lái)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/70, C12Q1/68, C12R1/94
【公開(kāi)號(hào)】CN105567876
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610130521
【發(fā)明人】劉杰
【申請(qǐng)人】劉杰
【公開(kāi)日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年3月7日