專利名稱：用于分選精子的微流控芯片結(jié)構(gòu)及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于分選精子的結(jié)構(gòu)及方法，更具體地說，本發(fā)明涉及 一種用于分選精子的微流控芯片結(jié)構(gòu)及方法。
背景技術(shù)：
不孕不育一直是世界關(guān)注的研究課題之一。有報(bào)道指出，全球育齡夫婦
中約有10%存在不孕不育問題，其中約有一半原因是由男性因素引起的。而
在成年男性中，精子質(zhì)量是影響受孕的關(guān)鍵因素之一。隨著輔助生殖技術(shù)的 普遍開展，越來越多的男性少、弱精子癥患者求助于這一技術(shù)，使以前無法 治療的男性不育患者得以解決生育問題。
然而，在輔助生殖技術(shù)中重要的一步是精子的分選，而精子體外分選的 方法也越來越多，傳統(tǒng)的精子分離技術(shù)包括上游法、密度梯度離心法、泳動(dòng) 沉淀法、玻璃纖維過濾法、王氏管法、流式細(xì)胞術(shù)等。
上游法是常用的一項(xiàng)精液處理技術(shù)。利用精子的泳動(dòng)能力，讓活動(dòng)力良 好的精子通過向上泳動(dòng)進(jìn)入培養(yǎng)液層中，而死精子、細(xì)胞殘片等則滯留在下 層，收集上層培養(yǎng)液則可獲得高活率的精子，從而達(dá)到優(yōu)選精子的目的。該 方法操作容易，獲得精子的活率高，應(yīng)用廣泛。但處理過程中丟失精子量較 多，主要用于精液質(zhì)量較好和"相對(duì)正常"的精液。
密度梯度離心法可用于質(zhì)量相對(duì)較差的精液。利用正常精子與畸形精子、 不活動(dòng)精子及其他細(xì)胞成分在浮力、密度方面存在的差異，通過梯度離心技 術(shù)分離到正常的精子。此方法丟失精子少，適用于少精、弱精的分離，但死 精子稍多、異物多。泳動(dòng)沉淀法是一項(xiàng)較為復(fù)雜的精液分離技術(shù)，使用內(nèi)含一錐形體的特制 玻璃或塑料管,使精子在l小時(shí)內(nèi)直接從液化精液中上游到上層液中，隨后再 沉淀到內(nèi)部的錐形管里，即上游法加一個(gè)沉淀的步驟。由于需要特殊的設(shè)備， 該法很少在臨床應(yīng)用。
玻璃纖維過濾法是利用精子的自身運(yùn)動(dòng)和玻璃纖維的過濾作用，使活動(dòng) 精子與不動(dòng)精子分離，可產(chǎn)生高比例的頂體完整的精子。精液處理效果與選
用的玻璃纖維種類、規(guī)格等直接相關(guān)；對(duì)精子的破壞及過濾過程中玻璃纖維 破碎的潛在危險(xiǎn)，則主要取決于所用玻璃纖維的種類和過濾時(shí)沖洗的強(qiáng)度。 王氏管法采用了王氏管系統(tǒng)，王氏管系統(tǒng)為一平置性抗重力型長(zhǎng)距離， 多方向多角度和濃集型的精子競(jìng)爭(zhēng)性分離純化系統(tǒng)。其操作容易，不需添加 任何抗生素即可獲得足夠數(shù)量的完全無菌的優(yōu)質(zhì)精子，但費(fèi)用昂貴，較難在 臨床推廣應(yīng)用。
流式細(xì)胞術(shù)是近年發(fā)展起來的一種分選精子的新方法。流式細(xì)胞儀進(jìn)行 精子分離前，需用含有可與DNA結(jié)合的熒光素染料(Hoechst 33342)的稀釋液 對(duì)精液進(jìn)行稀釋和培養(yǎng)。分離時(shí)，在該系統(tǒng)中，稀釋精液首先以極高的速度 噴出，形成一個(gè)個(gè)極微小的液滴。存在于微滴中的單個(gè)精子繼而受到激光照 射，產(chǎn)生出相應(yīng)的光散射信號(hào)和某種顏色的熒光信號(hào)，后者是由與DNA鏈定量 結(jié)合的染料受到某種波長(zhǎng)的光的激發(fā)而發(fā)射出來的。光散射信號(hào)的強(qiáng)弱反映 精子細(xì)胞的大小、形態(tài)等；而熒光信號(hào)的強(qiáng)度測(cè)出該精子的DNA含量。帶負(fù)電 荷的X精子和帶正電荷Y精子在電場(chǎng)中向前運(yùn)行時(shí)發(fā)生定向偏轉(zhuǎn)。X精子移向電 場(chǎng)的正極，Y精子偏向負(fù)極。這樣，X精子和Y精子就可被分別收集到不同的容 器中而予以分離,不含精子的微滴以及類型不能被識(shí)別的模糊精子會(huì)被儀器 棄掉。現(xiàn)已證實(shí)，分離過程會(huì)損傷精子細(xì)胞膜，從而影響精子質(zhì)量。精液在分離過程中的高倍稀釋，分離和分離前洗脫精漿都會(huì)降低精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性而 導(dǎo)致提前獲能。由此我們可以看出流式細(xì)胞儀分析是目前為止最為有效的分 選方法，但其安全性有待于對(duì)出生嬰兒的發(fā)育情況的隨訪，另外其費(fèi)用相對(duì) 昂貴，因此在臨床較難推廣。
綜上所述，上述各種分選精子的方法都存在各種不足，如在精液處理過 程中需要離心處理，過多的離心步驟可能會(huì)造成精子的機(jī)械性損傷和氧自由 基增加，導(dǎo)致精子過氧化損傷，引起精子質(zhì)量降低而影響精卵結(jié)合，又如在 處理少精癥病人精液處理過程中大量正常形態(tài)的活動(dòng)精子被丟失，以及費(fèi)用 昂貴等。如何解決上述問題，成為亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一種操作容易，不需要離心處理， 能夠減少對(duì)精子的損傷，并且精液標(biāo)本可重復(fù)利用的用于分選精子的微流控 芯片結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明所要解決的再一個(gè)技術(shù)問題是提供一種實(shí)現(xiàn)上述結(jié)構(gòu)的方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案
一種用于分選精子的微流控芯片結(jié)構(gòu)，包括本體；在本體表面左側(cè)設(shè)有
樣本加樣池和處理液加樣池，在本體表面右側(cè)設(shè)有樣本收集池和處理液收集
池；在本體內(nèi)設(shè)有與樣本加樣池分別相連的兩條樣本傳輸通道，在本體內(nèi)設(shè) 有與樣本收集池分別相連的兩條樣本收集通道，在本體內(nèi)還設(shè)有處理液傳輸
通道、公共傳輸通道和處理液收集通道；所述樣本加樣池經(jīng)樣本傳輸通道連 通公共傳輸通道，處理液加樣池經(jīng)處理液傳輸通道連通公共傳輸通道，所述 公共傳輸通道經(jīng)樣本收集通道連通樣本收集池，公共傳輸通道經(jīng)處理液收集 通道連通處理液收集池；所述樣本傳輸通道、處理液傳輸通道、樣本收集通道及處理液收集通道的高度都為10 100微米，樣本傳輸通道、處理液傳輸 通道、樣本收集通道及處理液收集通道的寬度都為50 500微米，公共傳輸 通道的高度為10 100微米及寬度為100 900微米。
所述樣本傳輸通道、處理液傳輸通道、樣本收集通道、處理液收集通道 以及公共傳輸通道的高度都為50微米，樣本傳輸通道和樣本收集通道的寬度 都為100微米，處理液傳輸通道和處理液收集通道的寬度都為300微米，公 共傳輸通道的寬度為500微米。
所述本體由聚合物平板和封接平板疊合組成并在本體內(nèi)形成封閉通道， 該封閉通道由所述樣本傳輸通道、處理液傳輸通道、公共傳輸通道、樣本收 集通道以及處理液收集通道形成；所述樣本加樣池、處理液加樣池、樣本收 集池以及處理液收集池設(shè)置在聚合物平板的表面。
在所述聚合物平板上設(shè)置有用于作為檢測(cè)區(qū)的凹槽。
本技術(shù)方案還設(shè)有與凹槽相連接的正負(fù)壓裝置。
所述聚合物平板由聚二甲基硅氧烷材料制成，封接平板由石英或玻璃或 聚二甲基硅氧烷材料制成。
一種用于分選精子的方法，其包括以下步驟步驟1用磷酸鹽緩沖液 沖洗權(quán)利要求1所述的樣本傳輸通道、處理液傳輸通道、公共傳輸通道、處 理液收集通道以及樣本收集通道，再用含量為0. 5% 1. 5%的小牛血清潤(rùn)洗上 述通道，吸盡權(quán)利要求1所述的樣本加樣池、處理液加樣池和處理液收集池、 樣本收集池中的液體，然后用精子處理液充滿上述通道水化3 8分鐘；步驟 2在所述樣本加樣池、處理液加樣池中各加入60 100微升液化后的新鮮精 液和精子處理液，在35。C 4(TC的條件下恒溫25 35分鐘后，吸取處理液 收集池中的收集液，對(duì)收集液中的精子進(jìn)行活力分析、形態(tài)分析及功能評(píng)價(jià)即可。
在本技術(shù)方案的步驟1中，用pH7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗所述的樣本傳 輸通道、處理液傳輸通道、公共傳輸通道、處理液收集通道以及樣本收集通 道，再用含量為1%的小牛血清潤(rùn)洗上述通道兩次，吸盡樣本加樣池、處理液 加樣池和處理液收集池、樣本收集池中的液體，然后用精子處理液充滿上述 通道水化5分鐘；在步驟2中，在所述樣本加樣池、處理液加樣池中各加入 80微升液化后的新鮮精液和精子處理液，在37'C的條件下恒溫30分鐘后， 吸取處理液收集池中的收集液，對(duì)收集液中的精子進(jìn)行活力分析、形態(tài)分析 及功能評(píng)價(jià)即可。
通過采用本發(fā)明的結(jié)構(gòu)及方法，從樣本加樣池加入待處理的精液標(biāo)本， 從處理液加樣池加入精液處理液，從樣本收集池回收含有活動(dòng)力差的精子和 圓細(xì)胞的精液，從處理液收集池回收含有活動(dòng)力好的精子的處理液。其中， 本發(fā)明是利用平行薄層流體在微小通道里的物理現(xiàn)象，即不同的液流在微小 的通道中，在一定條件下互不相溶而形成層流，在表面張力和粘滯力的作用 下使活動(dòng)能力大于一定值的精子從原液中游到另一個(gè)液流中，不活動(dòng)的精子 和圓細(xì)胞及精液中的其它雜質(zhì)被保留在原液中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)精子活動(dòng)能力的 篩選，以達(dá)到收集活動(dòng)力好的精子同時(shí)減少精液中的圓細(xì)胞以及其它雜質(zhì)的 目的，然后把分離出來的活力好的優(yōu)質(zhì)精子用于輔助生殖技術(shù)。故本發(fā)明操 作簡(jiǎn)單，能直接在顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察精子的分離效果，獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì) 精子，將顯著提高體外授精(IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)的成功 率。本發(fā)明不需要離心處理，減少了對(duì)精子的損傷，并且能消除不活動(dòng)精子， 碎片和白細(xì)胞等產(chǎn)生的氧化物的影響。本發(fā)明分選時(shí)間短、精液標(biāo)本可以重 復(fù)利用；其特別適合于輔助生殖技術(shù)中的IVF、 ICSI，在精子優(yōu)選中具有良好的應(yīng)用前景。
在結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的實(shí)施方式的詳細(xì)描述后，本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將 變得更加清楚。


圖l是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)的實(shí)施例一的示意圖；以及 圖2是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)的實(shí)施例一的截面示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面以具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但應(yīng)當(dāng)說明，本發(fā) 明的保護(hù)范圍不僅僅限于此。 實(shí)施例一
參閱圖2。 一種用于分選精子的微流控芯片結(jié)構(gòu)，其包括本體l，本體l 由聚合物平板(未圖示)和封接平板(未圖示)疊合組成。其中，聚合物平 板由聚二甲基硅氧烷材料制成，封接平板由石英材料制成，當(dāng)然，封接平板 也可由玻璃或聚二甲基硅氧垸等制成而不影響本發(fā)明的保護(hù)范圍。在聚合物 平板和封接平板組成的本體1內(nèi)形成封閉通道，該封閉通道由兩條樣本傳輸
通道12、 一條處理液傳輸通道14、 一條公共傳輸通道15、 一條處理液收集 通道16以及兩條樣本收集通道18形成；樣本加樣池ll、處理液加樣池13、 樣本收集池19以及處理液收集池17設(shè)置在本體1的聚合物平板的表面，見 圖l。在聚合物平板上設(shè)置有用于作為檢測(cè)區(qū)的凹槽(未圖示)； 一正負(fù)壓裝 置與凹槽相連接。樣本加樣池11通過樣本傳輸通道12與公共傳輸通道15連 通，處理液加樣池13通過處理液傳輸通道14與公共傳輸通道15連通，公共 傳輸通道15通過樣本收集通道18與樣本收集池19連通，公共傳輸通道15 通過處理液收集通道16與處理液收集池17連通。兩個(gè)樣本傳輸通道12、處理液傳輸通道14、兩個(gè)樣本收集通道18、處理液收集通道16以及公共傳輸 通道15的高度為50微米；兩個(gè)樣本傳輸通道12和兩個(gè)樣本收集通道18的 寬度都為100微米，處理液傳輸通道14和處理液收集通道16的寬度都為300 微米；公共傳輸通道15的寬度為500微米。當(dāng)然，樣本傳輸通道12、處理 液加樣傳輸通道14、樣本收集通道18、處理液收集通道16以及公共傳輸通 道15的高度和寬度還可以為其它數(shù)值，而不影響本發(fā)明的保護(hù)范圍。如兩條 樣本傳輸通道12、處理液傳輸通道14、兩條樣本收集通道18、處理液收集 通道16以及公共傳輸通道15的高度都為70微米；兩條樣本傳輸通道12以 及兩條樣本收集通道18的寬度都為150微米，處理液傳輸通道14、處理液 收集通道16的寬度都為250微米；公共傳輸通道15的寬度為400微米。
本實(shí)施方式使用時(shí)，從樣本加樣池ll加入待處理的精液標(biāo)本，從處理液 加樣池13加入精液處理液。利用平行薄層流體在微小通道里的物理現(xiàn)象，即 不同的液流在微小的通道中，即在兩個(gè)樣本傳輸通道12、處理液加樣傳輸通 道14、公共傳輸通道15、處理液收集通道16以及兩個(gè)樣本收集通道18中， 在一定條件下互不相溶而形成層流，在表面張力和粘滯力的作用下使活動(dòng)能 力大于一定值的精子從原液中游到另一個(gè)液流中，不活動(dòng)的精子和圓細(xì)胞及 精液中的其它雜質(zhì)被保留在原液中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)精子活動(dòng)能力的篩選。最終， 從樣本收集池19回收含有活動(dòng)力差的精子和圓細(xì)胞的精液，從處理液收集池 17回收含有活動(dòng)力好的精子的處理液。
一種用于分選精子的方法，其包括以下步驟步驟1,用PH7.4的磷酸 鹽緩沖液沖洗所述的樣本傳輸通道、處理液傳輸通道、公共傳輸通道、處理 液收集通道以及樣本收集通道，再用含量為1%的小牛血清潤(rùn)洗上述樣本傳輸 通道、處理液傳輸通道、公共傳輸通道、處理液收集通道以及樣本收集通道兩次，吸盡樣本加樣池、處理液加樣池和處理液收集池、樣本收集池中的液 體，然后用精子處理液充滿上述通道水化5分鐘；步驟2，在所述樣本加樣
池、處理液加樣池中各加入80微升液化后的新鮮精液和精子處理液，在37°C 的條件下恒溫30分鐘后，吸取處理液收集池中的收集液，對(duì)收集液中的精子 進(jìn)行活力分析、形態(tài)分析及功能評(píng)價(jià)即可。
雖然結(jié)合附圖描述了本發(fā)明的實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在 所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)作出各種變形或修改，只要不超過本發(fā)明的權(quán)利要 求所描述的保護(hù)范圍，都應(yīng)當(dāng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1、一種用于分選精子的微流控芯片結(jié)構(gòu)，包括本體；其特征在于在本體表面左側(cè)設(shè)有樣本加樣池和處理液加樣池，在本體表面右側(cè)設(shè)有樣本收集池和處理液收集池；在本體內(nèi)設(shè)有與樣本加樣池分別相連的兩條樣本傳輸通道，在本體內(nèi)設(shè)有與樣本收集池分別相連的兩條樣本收集通道，在本體內(nèi)還設(shè)有處理液傳輸通道、公共傳輸通道和處理液收集通道；所述樣本加樣池經(jīng)樣本傳輸通道連通公共傳輸通道，處理液加樣池經(jīng)處理液傳輸通道連通公共傳輸通道，所述公共傳輸通道經(jīng)樣本收集通道連通樣本收集池，公共傳輸通道經(jīng)處理液收集通道連通處理液收集池；所述樣本傳輸通道、處理液傳輸通道、樣本收集通道及處理液收集通道的高度都為10～100微米，樣本傳輸通道、處理液傳輸通道、樣本收集通道及處理液收集通道的寬度都為50～500微米，公共傳輸通道的高度為10～100微米及寬度為100～900微米。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的微流控芯片結(jié)構(gòu)，其特征在于所述樣本傳輸 通道、處理液傳輸通道、樣本收集通道、處理液收集通道以及公共傳輸通道 的高度都為50微米，樣本傳輸通道和樣本收集通道的寬度都為100微米，處 理液傳輸通道和處理液收集通道的寬度都為300微米，公共傳輸通道的寬度 為500微米。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流控芯片結(jié)構(gòu)，其特征在于所述本體由聚 合物平板和封接平板疊合組成并在本體內(nèi)形成封閉通道，該封閉通道由所述 樣本傳輸通道、處理液傳輸通道、公共傳輸通道、樣本收集通道以及處理液 收集通道形成；所述樣本加樣池、處理液加樣池、樣本收集池以及處理液收 集池設(shè)置在聚合物平板的表面。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流控芯片結(jié)構(gòu)，其特征在于在所述聚合物 平板上設(shè)置有用于作為檢測(cè)區(qū)的凹槽。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的微流控芯片結(jié)構(gòu)，其特征在于還設(shè)有與凹槽 相連接的正負(fù)壓裝置。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的微流控芯片結(jié)構(gòu)，其特征在于所述聚合物平 板由聚二甲基硅氧垸材料制成，封接平板由石英或玻璃或聚二甲基硅氧烷材 料制成。
7、 一種用于分選精子的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1用磷酸鹽緩沖液沖洗權(quán)利要求1所述的樣本傳輸通道、處理液 傳輸通道、公共傳輸通道、處理液收集通道以及樣本收集通道，再用含量為 0.5% 1.5%的小牛血清潤(rùn)洗上述通道，吸盡權(quán)利要求1所述的樣本加樣池、處理液加樣池和處理液收集池、樣本收集池中的液體，然后用精子處理液充滿上述通道水化3 8分鐘；步驟2在所述樣本加樣池、處理液加樣池中各加入60 100微升液化 后的新鮮精液和精子處理液，在35'C 4(TC的條件下恒溫25 35分鐘后， 吸取處理液收集池中的收集液，對(duì)收集液中的精子進(jìn)行活力分析、形態(tài)分析 及功能評(píng)價(jià)即可。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于在步驟1中，用pH7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗所述的樣本傳輸通道、處理 液傳輸通道、公共傳輸通道、處理液收集通道以及樣本收集通道，再用含量 為1%的小牛血清潤(rùn)洗上述通道兩次，吸盡樣本加樣池、處理液加樣池和處理 液收集池、樣本收集池中的液體，然后用精子處理液充滿上述通道水化5分 鐘；在步驟2中，在所述樣本加樣池、處理液加樣池中各加入80微升液化后 的新鮮精液和精子處理液，在37t:的條件下，溫30分鐘后，吸取處理液收集池中的收集液，對(duì)收集液中的精子進(jìn)行活力分析、形態(tài)分析及功能評(píng)價(jià)即 可。
全文摘要
一種用于分選精子的微流控芯片結(jié)構(gòu)及方法，結(jié)構(gòu)包括本體；本體表面有四個(gè)池，本體內(nèi)有兩條樣本傳輸通道、處理液傳輸通道、公共傳輸通道、處理液收集通道、兩條樣本收集通道；公共傳輸通道的高度為10～100微米及寬度為100～900微米，除公共傳輸通道外，其它通道的高度都為10～100微米及寬度都為50～500微米。方法包括步驟用磷酸鹽緩沖液沖洗各通道，用小牛血清潤(rùn)洗通道，吸盡各池中的液體，用精子處理液充滿各通道水化；加相應(yīng)的新鮮精液和精子處理液，在預(yù)定溫度下恒溫一定時(shí)間，吸取池中的收集液，對(duì)其中的精子進(jìn)行活力、形態(tài)分析及功能評(píng)價(jià)。本發(fā)明操作容易，能減少對(duì)精子的損傷，及分選時(shí)間短、精液標(biāo)本可重復(fù)利用。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101446583SQ200810220530
公開日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2008年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月29日
發(fā)明者周小棉, 維 王 申請(qǐng)人:廣州市第一人民醫(yī)院