專利名稱：與棕色棉纖維色澤主效qtl連鎖的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及棉花分子標記輔助選擇育種和分子生物學領域，尤其是一種與棕色棉長絨和短絨纖維色澤QTL緊密連鎖的SSR標記及其應用。
背景技術：
棉花是世界性的重要經濟作物，棉纖維不但是人類日常生活的必需品、紡織工業(yè)的重要原料，也是國際市場競爭的重要農產品。彩色棉作為專用棉的重要類型之一，其纖維具有天然的棕、綠等顏色。但是，目前已知天然彩色棉品種資源全部屬于棕色和綠色系列， 顏色單調、纖維品質差、色牢度及色飽和度不足成為限制天然彩色棉產業(yè)發(fā)展的技術瓶頸。 這為彩色棉育種和創(chuàng)新提出了十分緊迫的研究課題。但育種實踐證明，要解決這些問題是十分困難的，究其原因主要是對彩色棉的遺傳基礎了解不夠，不能采用更有效的育種措施。 因此，搞清楚彩色棉的遺傳規(guī)律和遺傳效應，對指導育種和創(chuàng)新工作非常重要。張秉賢Q000)以棕色纖維種質為父本所配制的兩個雜交組合，所有Fl棉株的纖維均呈灰白色，即為白色與棕色的中間色，將F:棉株按纖維有色(包括中間色和棕色)與白色分成兩類進行擴檢驗結果表明，有色植株與白色植株之比符合3 1，因而認為，主要受一對顯性基因控制，但表現為不完全顯性；周雁聲等(1998)用白色棉與棕色棉雜交，正反交Fl的纖維均為淺棕色，介于雙親之間，F2分離為棕色、淺棕色與白色，符合1 :2:1 的理論比例，這也說明棕色棉的纖維顏色由單基因控制，棕色表現為不完全顯性；李永山 (2002)、耿軍義等(1998)研究表明棕色棉的纖維顏色由單基因控制，棕色表現為不完全顯性，詹少華Q008)認為除一對主效基因外，還存在一些作用較小的“微效基因”。石玉真、杜雄明等000 研究認為棕色纖維由一對主效基因控制，表現為不完全顯性遺傳，棕色相對白色為顯性，同時，棕色纖維顯性性狀的表現還受控制短絨色澤的隱性基因的影響；李定國用(2004)Minoalt色差計，測定纖維的色澤，分析纖維色澤的遺傳規(guī)律，結果表明，棕色纖維是由不完全顯性單基因控制的質量性狀。孫東磊O008)以棕色棉為母本與三個白色棉雜交，其F2棉株按長纖維棕色(深棕、棕色)與白色(棕白、白色、淺棕)分成兩類，進行的 x2檢驗結果表明，在顯著水平白色植株與有色植株之比符合孟德爾9 7的分離規(guī)律，認為棕色陸地棉纖維色澤至少受4對基因控制，長纖維和短絨棕色的有無各由1對顯性基因控制，其纖維色澤類型至少還受2對微效基因控制，表現出淡棕、棕近白等不同類型。以上研究進展基本揭示了棕色棉纖維色澤的遺傳規(guī)律，為我們對該性狀的QTL定位打下了良好的基礎。棉花QTL定位研究開始于20世紀90年代初，Reinisch等1994年建立了第一個詳盡的異源四倍體棉花RFLP圖譜，由此揭開了棉花分子圖譜構建和QTL定位研究的序幕。 隨著分子標記技術的發(fā)展，遺傳圖譜的飽和程度越來越高，越來越多的QTL被定位到染色體或連鎖群上，為標記輔助選擇及圖位克隆奠定基礎，這些QTL包括皮棉產量及產量構成、 纖維品質、抗蟲、抗病、農藝性狀等。但國內外很少見有彩色棉的農藝經濟性狀的QTL定位。采用多環(huán)境下的重復試驗可以減少試驗誤差及環(huán)境誤差，采用多個環(huán)境多個重復的平均數據可以更加準確的進行QTLs的定位，環(huán)境越多，結果也就越可靠(沈新蓮，2004)。 為此，本本發(fā)明除了利用棕1 和庫車T94-4雜交組合的F2群體對棕色棉進行QTL定位和分析外，還利用棕1 和庫車T94-4雜交組合的RIL群體，在四種環(huán)境下進行了棕色棉進行 QTL定位，以便于找到與棕色棉纖維緊密相關的可靠性好、穩(wěn)定性高的QTL，用于分子標記輔助育種。

發(fā)明內容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種與棕色棉的長絨和短絨纖維色澤主效QTL緊密連鎖的分子標記及其應用。本發(fā)明的第一個目的在于提供擴增所述分子標記的引物，其序列如SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種與棕色棉的長絨和短絨纖維色澤主效QTL緊密連鎖的分子標記，其為用SEQ ID No. 1和SEQ IDNo. 2所示的引物擴增出的23^ρ和500bp 的擴增片段。本發(fā)明提供的分子標記，通過下述方法獲得1)以棕色棉材料棕128(母)和白色棉庫車T94-4(父)為親本，分別構建其F2分離群體和重組自交系F8,其中重組自交系種植于四個不同生態(tài)環(huán)境(2008年河南省安陽、 2009年河南安陽、2009年湖北省黃梅縣、2009年新疆石河子)。2)通過已知公布的7000對棉花SSR引物篩選親本間的多樣性，其方法是首先對材料DNA進行PCR擴增，然后通過聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后染色對條帶進行識別。將得到的113對多態(tài)性引物在兩個群體中進行PCR擴增檢測。其中在F2群體和重組自交系中均產生114個清晰可重復的多態(tài)性位點。3)通過J0inMap3. 0構建連鎖圖譜，F2群體83個位點共構建了 21個連鎖群，覆蓋 724. 86cM，每個連鎖群平均4個標記，標記間平均距離8. 73cM ；重組自交系(RIL)群體中， 87個位點構建了 27個連鎖群，共構建27個連鎖群，覆蓋481. 54cM,每個連鎖群平均3. 2個標記，標記間平均距離5. 53cM。4)利用掃描儀對棉纖維長絨和短絨掃描成像，利用Photoshopg. 0獲取纖維圖像的RGB(R 紅色；G 綠色；B 藍色)數據，通過公式計算顏色系數P = R/(G+B)，每個圖像隨機在不同的位置取10個P值，求得均值。5)利用 Windows QTL Cartographer 2. 5 軟件的復合區(qū)間作圖法(Composite Interval Mapping, CIM)，結合纖維顏色系數和連鎖圖譜對纖維色澤QTL進行檢測。本發(fā)明的另一個目的在于提供所述的引物或分子標記在棉花品種纖維色澤早期選擇或品種鑒定中的應用。具體而言，是用SEQ IDNo. 1和SEQ ID No. 2所示的引物對棉花品種或棉花雜交后代的幼苗的DNA進行擴增，若擴增出238bp和500bp的片段，表明其纖維色澤為棕色。通過利用棕色棉棕128與白色棉庫車T94-4的F2 (簡稱ZKF2)群體和重組自交系 (RIL)群體對棕色棉纖維的長絨和短絨色澤QTL進行多群體多環(huán)境定位分析發(fā)現，棕色棉長絨和短絨纖維色澤QTL均與SSR標記NAU1043緊密連鎖，而且在多環(huán)境下均能穩(wěn)定檢測到。可以用于棕色棉色澤的分子標記早期選擇和育種。
本發(fā)明提供的棕色棉特征標記NAU1043在深棕色、淺棕色和白色棉材料中的帶型具有明顯的差異，在不同纖維色澤品種或及其彩色棉后代選育中，在苗期就可以進行分子標記選擇深棕色或棕色植株類型。而且，沒有必要構建F2或重組自交系，進行QTL的再分析，大大提高了選擇效率和準確度。


圖1為本發(fā)明F2群體和重組自交系(RIL)群體部分分子標記連鎖圖譜以及QTL定位。圖中，ASF2群體部分分子標記連鎖圖譜以及QTL定位；B為重組自交系(RIL)群體部分分子標記連鎖圖譜以及QTL定位。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1以棕色棉材料棕128 (母)(來自中國農業(yè)科學院棉花研究所中期庫)和白色棉庫車T94-4 (父)(來自中國農業(yè)科學院棉花研究所中期庫)為親本，分別構建300個單株的 F2分離群體和沈0個家系的重組自交系F8,其中重組自交系種植于四個不同生態(tài)環(huán)境(2008 年河南省安陽、2009年河南安陽、2009年湖北省黃梅縣、2009年新疆石河子)。實施例2通過已知公布的7000對棉花SSR引物篩選親本間的多樣性，其方法是首先對棕 128和庫車T94-4兩個親本的DNA進行PCR擴增。PCR反應在PTC-100型PCR儀上進行， 反應體系 10 μ 1，包括 1 μ 110XPCR 緩沖液(含 15mmol/L Mg2+)，50ng 模板 DNA，0. 5mmol/ LdNTPs,0. 5U Taq酶，0. 5ymol/L 3'和5'引物。反應程序為95°C預變性3min ;94°C 45s， 55°C 45s, 72°C 45s, 30個循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保存。擴增產物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，凝膠電泳在DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀上進行，恒壓150V，電泳lh，銀染觀察并照相，篩選得到113對多態(tài)性豐富的引物。將得到的113對多態(tài)性引物在兩個群體中進行PCR擴增檢測(PCR體系同上)，其中在F2群體和重組自交系中均產生114個清晰可重復的多態(tài)性位點。實施例3通過J0inMap3. 0構建連鎖圖譜，F2群體83個位點共構建了 21個連鎖群，覆蓋 724. 86cM,每個連鎖群平均4個標記，標記間平均距離8. 73cM ；重組自交系(RIL)群體中， 87個位點構建了 27個連鎖群，共構建27個連鎖群，覆蓋481. 54cM,每個連鎖群平均3. 2個標記，標記間平均距離5. 53cM。實施例4利用掃描儀對棉纖維長絨和短絨掃描成像，利用Ph0t0sh0p9. 0獲取纖維圖像的 RGB(R 紅色；G 綠色；B 藍色)數據，通過公式計算顏色系數P = R/(G+B)，每個圖像隨機在不同的位置取10個P值，求得均值。利用Windows QTL Cartographer 2. 5 軟件的復合區(qū)間作圖法(Composite Interval Mapping, CIM)，結合纖維顏色系數和連鎖圖譜對纖維色澤QTL進行檢測。在棕128與庫車T94-4組合的F2群體中檢測到5個長絨色澤的QTL，4個短絨色澤的QTL，分別位于不同的連鎖群上，其中長絨色澤QTL qLCF2-7-l在標記NAU1043與GH302 之間，與標記NAU1043的遺傳距離為2.01，其加性效應為4.86%，顯性效應為-3.12%， 解釋表型變異的27. 37%。增效基因來自棕128，為長絨色澤的主效QTL。短絨色澤QTL qFCF2-7-l同樣位于標記NAU1043與GH302之間，與標記NAU1043的遺傳距離為2. 01，其加性效應為6. 450%，顯性效應為-2. 98%，解釋表型變異的47. 46% (表1)。增效基因來自棕128，為短絨色澤的主效QTL。表1復合區(qū)間作圖法定位ZKF2群體纖維色澤的QTL
權利要求
1.一種與棕色棉長絨和短絨纖維色澤主效QTL連鎖的分子標記的引物，其序列如SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
2.一種與棕色棉長絨和短絨纖維色澤主效QTL連鎖的分子標記，其特征在于，其為用權利要求1所述的引物擴增出的238bp和500bp的擴增片段。
3.權利要求1所述的引物或權利要求2所述的分子標記在棉花品種纖維色澤早期選擇或品種鑒定中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，用權利要求1所述的引物對棉花品種或棉花的雜交后代的幼苗的DNA進行擴增，若擴增出238bp和500bp的片段，表明其纖維色澤為棕色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與棕色棉長絨和短絨纖維色澤主效QTL連鎖的分子標記，其為用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物擴增出的238bp和500bp的擴增片段。該分子標記可應用于棕色棉花品種纖維色澤早期選擇或品種鑒定。本發(fā)明提供的分子標記與棕色棉長絨和短絨纖維色澤QTL均緊密連鎖，而且在多環(huán)境下均能被穩(wěn)定的檢測到。同時，本發(fā)明的分子標記能提供更高的分子標記輔助選擇的效率。
文檔編號C12Q1/68GK102321619SQ20111003112
公開日2012年1月18日 申請日期2011年1月28日 優(yōu)先權日2011年1月28日
發(fā)明者何守樸, 馮鴻杰, 周忠麗, 孫君靈, 孫杰, 杜雄明, 潘兆娥, 賈銀華 申請人:中國農業(yè)科學院棉花研究所