專利名稱：靶向pitpnm2抗登革熱病毒寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領(lǐng)域，具體地說是一種靶向PITPW2 (PITPW2， phosphatidyl inositol transfer protein, membrane-associated 2)治療登革熱病毒 (DV，Dengue Virus)胃I白勺胃—Sl (AS0DN,antisense oligodexynucleotide)白勺;^ 列、結(jié)構(gòu)及其治療藥物。
背景技術(shù)：
登革熱是世界上分布最廣，發(fā)病率最高，危害最大的蟲媒病毒傳染病之一。近年 來，隨著全球氣候的變暖和國際旅游交往的增加，DF的流行范圍逐漸擴大(目前已存在100 多個國家和地區(qū)有DF的流行)，同時發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升的趨勢。每年全球約發(fā) 生1億例DF，50萬例DHF，其中25000人死亡。我國自1978年在廣東，海南，福建，臺灣等省 份也多次發(fā)生DF的暴發(fā)流行。DF已給全球人類的生命安全帶來極大的威脅。登革疫苗研 究已有40多年的歷史，但由于登革病毒有4個血清型，當(dāng)人感染了一個血清型后，再感染其 它血清型容易引起DHF和DSS，至今對其發(fā)病機理尚不清楚，因此疫苗的研究難度很大，目 前仍無可用于人體的疫苗及有效的治療藥物。由于登革熱病毒主要通過蚊子傳播致病，同 時病毒耐氣溶膠化，能形成高度穩(wěn)定且感染力強的氣溶膠，常被用為失能性的生物戰(zhàn)劑。因 此，采用現(xiàn)代的分子生物學(xué)技術(shù)加強DF的疫苗及抗病毒的研究不僅具有社會意義，也具有 重要的軍事意義。核酸藥物是一類全新的基因靶向創(chuàng)新藥物，長期以來一直是國際研究的熱點，特 別是近幾年小核酸的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步將核酸藥物的研究推向一個前所未有的發(fā)展高潮。目前幾 乎所有大的國際制藥公司均投入巨資進(jìn)行核酸藥物的研發(fā)，如諾華和輝瑞公司分別與ISIS 和Eyetech公司共同開發(fā)的核酸藥物Vitravene和Macugen已批準(zhǔn)上市，另有幾十個正在 進(jìn)行臨床研究。反義寡核苷酸是一類經(jīng)過人工合成的寡核苷酸片段，長度多為15 30個核苷酸。 通過堿基互補的原理，干擾相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，或者整個基因組的復(fù)制，其優(yōu)點在于其 理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于反義寡 核苷酸作用的高度特異性，因此被認(rèn)為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國外已有一些 著名制藥企業(yè)已將反義藥物作為其新藥研究開發(fā)的重點方向之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗登革熱病毒藥物設(shè)計的宿主靶標(biāo)PITP匪2，以及一 種靶向PITP匪2阻斷登革熱病毒復(fù)制、抑制登革熱病毒致病的寡核苷酸序列、結(jié)構(gòu)及其藥 物。本發(fā)明的主要內(nèi)容是利用軟件篩選與登革熱病毒相互作用蛋白，根據(jù)已公開的蛋 白mRNA序列，對其進(jìn)行RNA 二級結(jié)構(gòu)的計算機模擬，靶向每個基因設(shè)計了 5條反義寡核 苷酸，總共針對17個基因設(shè)計了 85條反義核酸，初步篩選結(jié)果顯示DERL2-2抑制病毒所致細(xì)胞病變作用最佳，平均抑制率為67. 65%, HSPA8-1和PITP匪2_3次之，平均抑制率為 63. 46%和63. 27%，三個序列劑量依賴抑制登革熱病毒引起的細(xì)胞病變PITPNM2-3效果最 好，IC50 為 2. 03 μ M0 表1反義寡核苷酸的分子設(shè)計

TTTCTCACACCCTCACACTT GTTTCTCACACCCTCACACT TTCTCACACCCTCACACTT GCCTACCCAACCGACACCTA CTGATCCATGACTGCCTACCC GCCATCCCACTCCTCATCCA CCCTCCCTTCCACCTCTAA TTGCTGCCATCCCACTCCT CCCGCCACTTTCCTCTCCAA TGCCATCCCACTCCTCATCC CTCCAGTCCTTGTCCTCCTCT CCTCCAGTCCTTGTCCTCCT TCCTCCATGCTTTCCTCTCCT TCCAGTCCTTGTCCTCCTCTA TTCCTCCATGCTTTCCTCTC GTGGTTGTCTCTTGGCTGGT CTCCCTCTTCAAGTAGCATCC ACCTATGGCTCCCTCTCCTT ACCTATGGCTCCCTCTCCTTT GTGTGGTTGTCTCTTGGCTG GGAGGTGTCGGTCTTCTGCT GTCGGAGGTGTCGGTCTTCT GACTCCACTTTCTCCCGAT GGATTGGGTGTGTGGGTTG AGGTGTCGGTCTTCTGCTC GTCTCCCATTCCCTCTCCGT CTCCCATTCCCTCTCCGTT GTCATCCCTCCCTTTCCCTC TCATCCCTCCCTTTCCCTC ACTCCTTCTCTATCTTCTCCC CCTTGTCCCTCTGCTTCTC TCCCGTACTCTTGTCCACAGC GTCCCTCTGCTTCTCATCTTC TTTCCCGTACTCTTGTCCAC TCCCTCTGCTTCTCATCTTCA ACAGCAGCCAGGTCCCACTT GCCAGGTCCCACTTGAGCTT GGTCCCACTTGAGCTTCCCT GCTCCTCACATACCTCCTCG GCTTGCCTCCCTCTCTAGAC CATTGCCTCCCTTACCTCTTC TTGCCTCCCTTACCTCTTCA CATTGCCTCCCTTACCTCTT CCCGTCGTGTTTCTGCTTCTC GCCCGTCGTGTTTCTGCTTCT TTCCCTGCTCTCTGTCGGCT
31SEC61G-132SEC61G-233SEC61G-334SEC61G-435SEC61G-536TGFBRl-I37TGFBRI-238TGFBR1-339TGFBRl-440TGFBR1-541UBE2I-142UBE2I-243UBE2I-344UBE2I-445UBE2I-546UBE2J1-147UBE2J1-248UBE2J1-349UBE2J1-450UBE2J1-551YWHAQ-I52YWHAQ-253YWHAQ-354YWHAQ-455YWHAQ-556YWHAG-I57YWHAG-258YWHAG-359YWHAG-460YWHAG-561HSPA8-162HSPA8-263HSPA8-364HSPA8-465HSPA8-566CCND3-167CCND3-268CCND3-369CCND3-470CCND3-571PRKAAl-I72PRKAAl-273PRKAA1-374PRKAA1-475PRKAA1-576HSPAlA-I
義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義義 反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反反
總之，根據(jù)本發(fā)明，與PITP匪2基因的mRNA互補結(jié)合的寡核苷酸均能有效的抑制 登革熱病毒和保護(hù)細(xì)胞使其免于登革熱病毒所致細(xì)胞病變，是一種特異性高、毒副作用小 的新型抗登革熱病毒的潛在藥物。根據(jù)本發(fā)明，針對PITP匪2mRNA的反義寡核苷酸能特異性抑制登革熱病毒的致細(xì) 胞病變和復(fù)制，有可能成為治療及預(yù)防登革熱相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸的長度與其細(xì)胞通透性，與靶序列結(jié)合親和性及作用 特異性等因素相關(guān)，PITPW2的長度根據(jù)實驗確定，本發(fā)明包含了與PITPW2-3具有60%及 其以上連續(xù)相同序列的任何長度寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，為增強反義寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及組織靶向性等，本 發(fā)明包含了 PITP匪2-3硫代修飾、甲基修飾或金剛乙胺修飾。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物可按本領(lǐng)域已知方法配成非腸道給藥 的制劑。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物治療組成可應(yīng)用單獨的有效成分或組 合物形式包括聯(lián)合其他反義寡核苷酸及其衍生物形式，還可以含有治療上可以接受的載體 材料，如脂質(zhì)體、融合肽或病毒載體等。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動力學(xué)、藥代動 力學(xué)、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時限 等，以適宜的劑量給藥。本發(fā)明的實施對嚴(yán)重危害人類健康的登革熱病毒感染的治療具有重要的社會效 益和經(jīng)濟效益。


圖1 1 20號硫代反義寡核苷酸序列2 μ M濃度用藥抑制登革熱病毒所致細(xì)胞病 變圖2 21 40號硫代反義寡核苷酸序列2 μ M濃度用藥抑制登革熱病毒所致細(xì)胞 病變圖3 41 60號硫代反義寡核苷酸序列2 μ M濃度用藥抑制登革熱病毒所致細(xì)胞 病變圖4 61 85號硫代反義寡核苷酸序列2 μ M濃度用藥抑制登革熱病毒所致細(xì)胞 病變圖5 DERL2-2、PITP匪2_3、HSPA8-1劑量依賴抑制登革熱病毒致細(xì)胞病變作用
具體實施例方式實施例一本實施例主要說明靶向人PITP匪2-基因抗登革熱病毒反義寡核苷酸的設(shè)計、合 成和初篩選。材料與方法1.反義寡核苷酸的設(shè)計和合成檢索GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的基因的mRNA參考序列，對 其進(jìn)行RNA 二級結(jié)構(gòu)的計算機模擬，選擇了 5個不穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為反義寡核苷酸的作 用靶點。通過與GeneBank聯(lián)機blast序列比對，所選擇的靶序列均具有很好的特異性，不 會干擾人類其它正?；虻谋磉_(dá)(見表1)。所有寡核苷酸均采用8909型自動DNA合成儀 合成全硫代修飾的反義寡核苷酸。合成完畢濃氨水55°C切割并脫保護(hù)15小時后，經(jīng)Micro Pure II反相純化柱(Oligo Prep 0P120, SAVANT)純化，紫外定量后真空干燥，-20°C保存2. Hela細(xì)胞和病毒病毒在10日齡SPF雞胚傳代，收集尿囊液，測定其血凝(Hemagglutination，HA) 效價，取HA價>1 26者，混勻、分裝、保存于-70°C備用。使用的病毒毒株為XXXXXX。HELA 細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清(Gibco)的1640培養(yǎng)液，病毒感染和細(xì)胞病變測定時使用含
胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的維持液。3.反義寡核苷酸的篩選HELA細(xì)胞在含10%胎牛血清(Gibco)的1640培養(yǎng)基中，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以8000 10000個細(xì)胞/孔將細(xì) 胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，次日60 80%長滿。用含胎牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋 各個反義核酸序列至2 μ M。用PBS (ρΗ7. 5)沖洗細(xì)胞一次，將2 μ M的反義核酸序列1 85 以100 μ 1/孔的量加入各孔。同時設(shè)立病毒感染陽性對照組(V+)和HELA細(xì)胞陰性對照組 (NC)，作用60min。用PBS (pH7. 5)沖洗細(xì)胞一次，每孔加入100TCID50/0. Iml的登革熱病毒 稀釋液50 μ 1，37°C感染作用60min，用PBS (pH7. 5)沖洗細(xì)胞，將2 μ M的各個反義核酸序列 以 100 μ 1/孔的量加入各孔。37°C培養(yǎng) 2d。利用 CellTiter96Aqueous One Solution 試劑 盒(Promega產(chǎn)品)測定細(xì)胞病變程度(以0D490表示)，并以如下公式計算藥物的病毒抑 制率[(0D試驗-OD病毒)/ (0D細(xì)胞-OD病毒)]X 100。重復(fù)試驗二次，計算平均值以篩選 出最佳的反義寡核苷酸以進(jìn)一步評價。結(jié)果1.不同基因反義序列抑制登革熱病毒所致細(xì)胞病變效果的初篩選從針對每條基因所設(shè)計的5條反義寡核苷酸中進(jìn)行初步篩選，以選出效果最佳的 反義寡核苷酸，以便于進(jìn)一步的評價。結(jié)果顯示在濃度為2μ M時以DERL2-2抑制病毒所 致細(xì)胞病變作用最佳，平均抑制率為67. 65%, HSPA8-1和PITP匪2_3次之，平均抑制率為 63. 46%和 63. 27% (見圖 1、圖 2、圖 3、圖 4)。結(jié)論DERL2-2、HSPA8-1和PITP匪2_3對登革熱病毒所致細(xì)胞病變抑制率較高，DERL2、HSPA8和PITP匪2可以作為抗登革熱病毒作用宿主靶標(biāo)。實施例二 本實施例主要說明反義寡核苷酸DERL2-2、PITP匪2_3、HSPA8-1抑制登革熱病毒 致細(xì)胞病變劑量依賴作用1. DERL2-2、PITP匪2_3、HSPA8-1抑制登革熱病毒致細(xì)胞病變劑量依賴作用參照實施例一將HELA細(xì)胞鋪板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，次日60 80%長滿。用含1 % FBS 的 1640 稀釋 DERL2-2,PITPNM2-3,HSPA8-1 至 0. 5、1. 0、2. 0、4. 0、8. 0 μ M。以 PBS (ρΗ7· 5) 沖洗細(xì)胞一次，將稀釋后的DERL2-2、PITP匪2-3、HSPA8-l以100 μ 1/孔的量加入各孔。同時 設(shè)立病毒感染陽性對照組(V+)和HELA細(xì)胞陰性對照組(NC)，作用60min。用PBS (pH7. 5)沖 洗細(xì)胞一次，每孔加入100TCID50/0. Iml的登革熱病毒稀釋液50 μ 1，37°C感染作用60min， 用PBS (pH7. 5)沖洗細(xì)胞，再將DERL2-2、PITPNM2-3、HSPA8-1以100 μ 1/孔的量加入各孔。 37°C培養(yǎng) 2d。利用 CellTiter96Aqueous One Solution 試劑盒(Promega 產(chǎn)品)測定細(xì)胞 病變程度(以0D490表示)，計算藥物的細(xì)胞病變抑制率和IC5Q。結(jié)果1. DERL2-2、PITP匪2-3、HSPA8-l抑制登革熱病毒致細(xì)胞病變作用的劑量依賴作用不同濃度DERL2-2、PITP匪2_3、HSPA8-1抑制登革熱病毒致細(xì)胞病變抑制率見圖 2。三種反義序列都能較好地抑制登革熱病毒致細(xì)胞病變，并且抑制存在劑量依賴 性。三種反義核酸DERL2-2、PITP匪2-3和HSPA8-1抑制登革熱病毒致細(xì)胞病變作用IC5tl分 別為2. 22 μ Μ、2· 03 μ M 和 2. 07 μ Μ。三種反義序列均能較好地抑制登革熱病毒所致細(xì)胞病變，結(jié)論DERL2_2、PITP匪2-3和HSPA8-1三種反義序列都能較好地抑制登革熱病毒致細(xì)胞 病變，并且抑制存在劑量依賴性，DERL2-2抑制作用最好，可以作為潛在抗登革熱病毒藥物， DERL2基因可以作為抗登革熱病毒作用宿主靶標(biāo)。
權(quán)利要求
與PITPNM2mRNA互補的寡核苷酸，分布在5’非編碼區(qū)、編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)，其長度是10 30個堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述寡核苷酸，其特征是所述的選自序列表1 85所示反義寡核苷 酸序列結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的反義寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)選自下列 之一Dgtatcaccgagtccttcccag ；2)tccaagactcctccaccacc；3)ccttgtccctctgcttctc。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的寡核苷酸，其特征是所述的反義寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)選自下列 之一1)tccaagactcctccaccacc；2)ccttgtccctctgcttctc。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的寡核苷酸，其特征是所述的反義寡核苷酸序列結(jié)構(gòu)為以下序列tccaagactcctccaccacc。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的寡核苷酸，其特征為所述的反義寡核苷酸包含了與 tccaagactcctccaccacc具有60%及其以上連續(xù)相同序列的任何長度寡核苷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述寡核苷酸，其特征是該反義寡核苷酸經(jīng)過不同化學(xué)修飾。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述寡核苷酸，其化學(xué)修飾為硫代修飾、甲基修飾或金剛乙胺修飾。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述寡核苷酸，其特征為活性成分選自權(quán)利要求1-8所述任一寡核 苷酸或其組合。
10.權(quán)利要求1-9中所述的任一寡核苷酸或其組合在制備治療和預(yù)防流感病毒感染的 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種反義寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)和用途。具體說是發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白，膜關(guān)聯(lián)2(PITPNM2)可以作為抗病毒的宿主靶標(biāo)，靶向PITPNM2抗登革熱病毒(DV)反義寡核苷酸的結(jié)構(gòu)和用途。本實驗室通過篩選和驗證發(fā)現(xiàn)病毒感染相互作用宿主蛋白PITPNM2，于是設(shè)計合成了靶向PITPNM2的反義寡核苷酸。在病毒感染的Hela細(xì)胞上對反義寡核苷酸序列進(jìn)行了活性篩選及評價，首次發(fā)現(xiàn)互補于PITPNM2 mRNA特定功能區(qū)域的寡核苷酸PITPNM2-3在培養(yǎng)的Hela細(xì)胞中能有效地抑制DV所致的細(xì)胞病變，具有很好的特異性和可藥性。因此，本發(fā)明涉及到靶向PITPNM2 mRNA抗IV感染的反義寡核苷酸的序列與結(jié)構(gòu)及其成為治療DV病毒相關(guān)性疾病，減小DV相關(guān)性疾病危害性的新型藥物。
文檔編號C12N15/113GK101899440SQ201010187139
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者丁曉然, 伯曉晨, 曾婷, 楊靜, 王升啟, 趙海豹, 魯?shù)さ?申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所