專利名稱：不能在蚊子中復(fù)制的減毒重組甲病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲病毒的分子生物學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明提供不 能感染蚊子的減毒重組甲病毒，并公開了產(chǎn)生這類甲病毒的方法及這些減毒甲病毒在免疫 原性組合物中的用途。相關(guān)技術(shù)說明披膜病毒科(Togaviridae)的甲病毒屬(Alphavirus)包含大量重要的人類和動(dòng) 物病原體。除了南極地區(qū)，這些病毒廣泛分布于所有的大陸上，并代表了重要的公共健康威 脅(18，39)。在自然條件下，大多數(shù)甲病毒通過蚊子傳播，其中它們引起對載體的生物功能 具有較小影響的持久、終生的感染。在蚊子吸食血液期間被蚊子感染的脊椎動(dòng)物中，甲病毒 引起特征為高滴度病毒血癥(high-titer viremia)的急性感染，其是新蚊子感染及其在自 然界中傳播的前提條件。委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)是甲病毒屬中最重的致病成員之一。其在南美洲、中 美洲和北美洲持續(xù)傳播并引起涉及人類、馬和其它家畜的散發(fā)性流行病和家畜流行病。在 委內(nèi)瑞拉和哥倫比亞(1995)，在最近涉及亞型IC VEEV的大爆發(fā)期間，出現(xiàn)約100，000人類 病例，估計(jì)超過300起致命腦炎案例(37)。在VEEV家畜流行病期間，歸因于腦炎的馬的死 亡率能夠達(dá)到83%，并且，雖然人類的總死亡率較低(< 1%)，但能夠在高達(dá)14%的感染 個(gè)體，特別是兒童中檢測到包括定向障礙、共濟(jì)失調(diào)、精神萎靡和驚厥在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病 (21)。由VEEV引起的人類疾病的特征在于伴有寒戰(zhàn)、嚴(yán)重頭痛、肌痛、嗜眠和咽炎的發(fā)熱疾 病。年輕和年長的個(gè)體發(fā)展為伴有嚴(yán)重淋巴缺失的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織感染以及隨后的腦炎。CNS 感染的結(jié)果是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的急性腦膜腦炎(9)。神經(jīng)系統(tǒng)癥狀在疾病發(fā)作的4-10天 內(nèi)出現(xiàn)并且包括突然發(fā)作、輕癱、行為變化和昏迷。盡管VEEV疫病持續(xù)地威脅，仍未設(shè)計(jì)出用于該病毒的安全有效的疫苗。40多年 前，已經(jīng)通過在豚鼠心臟細(xì)胞中對VEEV的高毒性特立尼達(dá)島猴(Trinidad donkey, TRD)菌 株進(jìn)行連續(xù)傳代來開發(fā)VEEV減毒TC-83菌株(4)。目前，TC-83仍是實(shí)驗(yàn)室人員和軍方服 役人員唯一可用的疫苗。超過8，000的人群已接種(2，8，34)，并且累積的數(shù)據(jù)清楚地表明， 幾乎40%的所有受接種者出現(xiàn)伴有通常為天然VEE的某些癥狀的疾病，包括發(fā)熱、全身疾 病和其它副作用O)。該TC-83菌株在皮內(nèi)注射和皮下注射接種后普遍地殺死新生但未成 年小鼠(31)，并因此是用于進(jìn)一步衰減和研究突變對病毒發(fā)病機(jī)制影響的良好原材料。VEEV基因組為模擬細(xì)胞mRNA結(jié)構(gòu)的近12_k的正極性單鏈RNA分子?；蚪MRNA包含5’甲基鳥苷酸帽和3’多聚腺苷酸尾04)，即基因組RNA從核殼體中釋放后直接允許通 過宿主細(xì)胞機(jī)制翻譯病毒蛋白的特征。將5’三分之二的基因組翻譯為非結(jié)構(gòu)蛋白(nsP)， 其包含病毒基因組復(fù)制和亞基因組RNA轉(zhuǎn)錄所需要的復(fù)制酶復(fù)合物(implicative enzyme complex)的病毒組分。亞基因組RNA對應(yīng)于3’三分之一的基因組，其由亞基因組啟動(dòng)子合 成并被翻譯為病毒結(jié)構(gòu)蛋白。VEEV菌株TC-83的減毒表型為該菌株TRD基因組中兩個(gè)突 變的結(jié)果其中一個(gè)突變?nèi)〈鶨2糖蛋白位置120處的氨基酸，以及另一突變改變5’ UTR的 nt 3(11,23,24,43).因此，如果諸如體內(nèi)病毒傳代的適當(dāng)選擇性條件出現(xiàn)，由于甲病毒非 常高的突變率，則TC-83回復(fù)突變?yōu)橹虏”硇腿匀皇且恢饕膽n慮。此外，VEEV TC-83能 夠在蚊子細(xì)胞中復(fù)制，并且在接種后感染蚊子(3 ；由此，其仍然可能通過蚊子傳播。理想的是，活蟲媒病毒疫苗菌株不應(yīng)當(dāng)通過節(jié)肢動(dòng)物載體傳播，因?yàn)樵趦?chǔ)存宿主 之間的傳播能夠?qū)е掳ǘ玖υ黾拥臒o法預(yù)料的變化。對于依靠易于回復(fù)突變的少量減毒 突變的野生型病毒所產(chǎn)生的減毒菌株，或者對于經(jīng)受了載體來源的傳播而以不可預(yù)知方式 進(jìn)化的遺傳修飾的菌株，這尤其是正確。通過1971期間在路易斯安那州收集的蚊子中檢測 到VEEV TC-83疫苗菌株，強(qiáng)調(diào)了前者的風(fēng)險(xiǎn)(32)，路易斯安那州是限于德克薩斯州的家畜 流行病/流行病之外的區(qū)域。甲病毒感染性cDNA的開發(fā)，為通過廣泛修飾病毒基因組來探索它們的減毒提供 了機(jī)遇，即將向wt致病表型的回復(fù)突變最小化或排除的方法。此外，這類甲病毒的基因組 能夠改造為含有僅在脊椎動(dòng)物來源而不是昆蟲來源的細(xì)胞中起作用的RNA元件。由此，這 樣廣泛的突變能夠防止基因修飾的病毒通過蚊子載體傳播。不管其作為新興的人類和動(dòng)物病原體的重要性，其作為生物武器的潛力和對于減 毒甲病毒應(yīng)用的憂慮，現(xiàn)有技術(shù)仍然缺乏產(chǎn)生僅能夠在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的甲病毒減毒 菌株的方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了本領(lǐng)域長期存在的需求和期望。發(fā)明概述在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生減毒重組甲病毒的方法。這類方法包括在 甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4(nsP4)編碼序列的末端和亞基因組RNA編碼序列的起始AUG之間克隆 腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(EMCV IREQ，代替亞基因組RNA的天然5’UTR。在本 發(fā)明另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，提供了由以上討論的方法產(chǎn)生的減毒重組甲病毒。在本發(fā)明另一相關(guān)實(shí)施方案中，提供了包含編碼減毒重組甲病毒的核苷酸序列的 載體和包含并表達(dá)該載體的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明另一相關(guān)實(shí)施方案中，提供了藥物組合物。 該組合物包含以上討論的減毒重組甲病毒和藥用可接受載體。在本發(fā)明相關(guān)實(shí)施方案中， 提供了免疫原性組合物。該免疫原性組合物包含本文所述的毒重組甲病毒。在本發(fā)明另一相關(guān)實(shí)施方案中，提供了保護(hù)個(gè)體不受暴露于甲病毒而導(dǎo)致的感染 危害的方法。這類方法包括給予免疫有效量的包含本文所述減毒重組甲病毒的免疫原性組 合物，由此保護(hù)個(gè)體而不受暴露于甲病毒而導(dǎo)致的感染的危害。附圖簡述

圖1A-1D表示重組EMCV IRES-編碼的、VEEV TC-83-衍生的病毒在BHK-21細(xì)胞中 的復(fù)制。圖IA為設(shè)計(jì)的病毒基因組的示意圖，在感染性中心試驗(yàn)中體外合成的RNA的感染 性，Img體外合成的RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞后24h的病毒滴度，以及轉(zhuǎn)染后48h BHK-21細(xì) 胞中由所示病毒形成的噬斑的大小。箭頭表示功能性亞基因組啟動(dòng)子。填充的框(filledbox)表示EMCV IRES。圖IB表示含有亞基因組啟動(dòng)子的VEEV TC-83基因組片段和相應(yīng) 的VEEV/mutSG/IRES片段的比對。開放框(open box)表示啟動(dòng)子的位置。VEEV TC-83基 因組中亞基因組RNA的開始(start)和EMCV IRES的起點(diǎn)(beginning)以箭頭表示。引入 VEEV/mutSG/IRES基因組中的突變以小寫字母表示。圖IC表示轉(zhuǎn)染后24h收獲的在BHK-21 細(xì)胞中由病毒形成的噬斑。圖ID表示將Img體外合成的RNA轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞后病毒的 復(fù)制。圖2A-2C表示在噬斑純化的VEEV/mutSG/IRES變體中發(fā)現(xiàn)的突變，這表明了在 BHK-21細(xì)胞中更有效的復(fù)制和限定的適應(yīng)性突變對VEEV TC-83和VEEV/mutSG/IRES復(fù)制 的影響。圖2A表示與公開的VEEV TC-83的序列相比，在噬斑分離物的基因組中發(fā)現(xiàn)的突 變列表04)。圖2B為具有一個(gè)或兩個(gè)確認(rèn)的突變的VEEV TC-83和VEEV/mutSG/IRES基因 組和在感染性中心試驗(yàn)中體外合成的病毒RNA的侵染性的示意圖。功能性亞基因組啟動(dòng)予 以箭頭表示，且EMCV IRES以填充的框表示。圖2C表示在轉(zhuǎn)染Img體外合成的病毒基因組 后，設(shè)計(jì)的病毒在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制。圖3A-;3B表示在表現(xiàn)出大噬斑表型的VEEV/mutSG/IRES變體的nsP2蛋白中確認(rèn) 的突變。圖3A表示在體外合成的RNA轉(zhuǎn)染后24h收獲的來自病毒儲(chǔ)存液的噬斑純化的分 離物(原始的)基因組中，和在Vero細(xì)胞中另外傳代三次的儲(chǔ)存液分離物(傳代的)的基 因組中確認(rèn)的突變的列表。圖3B表示限定的突變在VEEV nsP2中的定位。示出了目前已 知的功能性結(jié)構(gòu)域在甲病毒nsP2中的位置(38，39)。圖4A-4B表示在用體外合成的重組病毒轉(zhuǎn)染的RNA BHK-21細(xì)胞中，蛋白和RNA合 成的分析。將細(xì)胞用細(xì)g所示的RNA進(jìn)行電穿孔并植入35-mm培養(yǎng)皿中。在圖4A中，在轉(zhuǎn) 染后4. 5h，將孔中的培養(yǎng)基用Iml補(bǔ)充了 10% FBS、ActD(lmg/ml)和[3H]尿苷(20mCi/ml) 的aMEM替換。當(dāng)在37°C下孵育4h后，將RNA分離并通過瓊脂糖凝膠電泳分析。病毒基因 組和亞基因組RNA的位置分別以G和SG表示。相比其它產(chǎn)生亞基因組RNA的病毒，VEEV/ IRES-特異性亞基因組RNA形成更擴(kuò)散的帶，因?yàn)樵谀z中，其與核糖體^S RNA共遷移。 在圖4B中，轉(zhuǎn)染后12h，將蛋白用[35S]甲硫氨酸代謝標(biāo)記并在十二烷基硫酸鈉-10%聚丙 烯酰胺凝膠上分析。將分子量標(biāo)記物(kDa)的位置在凝膠左側(cè)示出。將病毒結(jié)構(gòu)蛋白C、E1 和p62 (E2的前體)的位置在凝膠右側(cè)示出。星號(hào)表示IRES編碼病毒復(fù)制所誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋 白(熱休克蛋白)的位置。圖5A-5C表示在C7IO細(xì)胞中包含EMCV IRES的重組VEEV變體的傳代。圖5A為病 毒基因組的示意圖。箭頭示出功能性亞基因組啟動(dòng)子的位置。填充的框表示EMCV IRES的 位置。圖5B表示在C7IO細(xì)胞中傳代后重組病毒的滴度。將35-mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞用400ml 的病毒樣品感染，所述病毒樣品在用體外合成的RNA(Pl)轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后24h收獲或者 感染C7IO細(xì)胞后4 收獲。虛線表示檢測極限。圖5C表示在噬斑純化的VEEV/IRES變體 中確認(rèn)的含有IRES的序列的缺失，這表明在C7IO細(xì)胞中的有效復(fù)制。殘留的EMCVIRES-特 異性序列以小寫字母表示。圖 6 表示 VEEV/mutSG/IRES/1 和 VEEV TC-83 在NIH 3T3 細(xì)胞中的復(fù)制。以 10PFU/ 細(xì)胞的MOI感染細(xì)胞。在所示時(shí)間點(diǎn)替換培養(yǎng)基，并在BHK-21細(xì)胞上通過噬斑試驗(yàn)測量病 毒滴度。用相同的樣品測量生物學(xué)試驗(yàn)中IFN-a/b的釋放。釋放的IFN-a/b的濃度以國際 單位(IU)/ml表示。
圖7表示用VEEV TC-83和VEEV/mutSG/IRES/1病毒感染的小鼠的存活。將六日 齡的NIH瑞士小鼠用濃度為約IO6PFU的所示病毒皮內(nèi)注射接種。將動(dòng)物監(jiān)測2月。在感 染9天后，在這些試驗(yàn)中的任何實(shí)驗(yàn)中均未出現(xiàn)死亡。圖8表示成年小鼠接種及激發(fā)后的存活。將5-6周齡的雌性NIH瑞士小鼠用約 為IO6PFU劑量的VEEV菌株TC-83或重組病毒皮下注射免疫，免疫后三周，將小鼠用約為 IO4PFU的VEEV菌株3908皮下注射激發(fā)，并記錄死亡率。圖9表示產(chǎn)生不能感染蚊子的減毒重組甲病毒的示意方法。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及開發(fā)甲病毒減毒菌株的新策略。這些減毒甲病毒僅能夠在脊椎動(dòng)物細(xì) 胞中復(fù)制。通過使病毒結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯并最終病毒的復(fù)制依賴于腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖 體進(jìn)入位點(diǎn)(EMCV IRES)實(shí)現(xiàn)這種表型。這類重組病毒是有生存力的并在新生小鼠中表現(xiàn) 出高度的減毒表型，但仍然誘導(dǎo)針對VEEV感染的保護(hù)性免疫。此外，福爾馬林失活的疫苗 價(jià)格昂貴并且效率較低。除此以外，這些疫苗還需要多次重復(fù)接種。此外，對VEEV感染唯一 有效的活減毒疫苗是完全反應(yīng)原性的，并且在蚊子吸食接種的馬的血液期間感染蚊子。由 于減毒表型是不可逆的，相比目前可用的疫苗，本文所討論的減毒甲病毒提供了顯著的優(yōu) 勢。此外，基因工程甲病毒不能在蚊子細(xì)胞中復(fù)制，從而提出了用于產(chǎn)生不能在蚊子中復(fù)制 并由此不能在自然界傳播的新的活重組病毒的新方法。辛德畢斯(Sindbis)和其它甲病毒感染性cDNA克隆的開發(fā)(12，25，36)不僅為旨 在研究病毒生物學(xué)和致病機(jī)理不同方面的反向遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)帶來了的機(jī)會(huì)，而且還為新重組 疫苗的開發(fā)帶來了機(jī)會(huì)。通過在組織培養(yǎng)或雞胚胎中傳代，病毒的衰減09)通常由結(jié)構(gòu)和 非結(jié)構(gòu)基因中以及病毒基因組順式作用元件中少量點(diǎn)突變的累積造成。例如，VEEVTC-83疫 苗菌株的衰減僅依靠2個(gè)點(diǎn)突變，并且高度的反應(yīng)原性(34)可能反映該衰減機(jī)理的不穩(wěn)定 性。這引起了有關(guān)病毒在接種的個(gè)體中在復(fù)制期間可能回復(fù)突變?yōu)閣t致病表型的憂慮。能 夠通過化學(xué)誘變使突變的數(shù)目額外增加( )，但該過程也不使引入的變化不可逆。用RNA+ 病毒感染性cDNA克隆進(jìn)行的基因操作，為病毒基因組的更強(qiáng)修飾帶來了更大的可能性，并 且為引入使其不能回復(fù)突變?yōu)閣t基因組序列的廣泛缺失(5，6，10，19)或可能增強(qiáng)的變體 免疫原性的其他基因材料提供了機(jī)會(huì)。主要的憂慮還在于，可能將基因改變的蟲媒病毒引入通過蚊子載體介導(dǎo)的自然循 環(huán)中，并且長期復(fù)制過程中在蚊子中或病毒血癥發(fā)展期間在脊椎動(dòng)物宿主中表現(xiàn)出進(jìn)一步 進(jìn)化。實(shí)例為VEEV TC-83的用途，VEEV TC-83能夠在馬科動(dòng)物中產(chǎn)生足以感染蚊子的病 毒血癥水平。在1971的德克薩斯州流行病期間，從在路易斯安那州收集的天然感染的蚊子 中分離到TC-83 (32)，強(qiáng)調(diào)了減毒甲病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在設(shè)計(jì)新一代活疫苗菌株時(shí)，應(yīng) 當(dāng)謹(jǐn)慎地使蟲媒病毒不僅高度衰減而且僅能夠在脊椎動(dòng)物來源的細(xì)胞中復(fù)制。這可通過將 細(xì)胞-特異性RNA元件克隆至病毒基因組中來實(shí)現(xiàn)。相對于蟋蟀麻痹病毒IRES (20)，預(yù)料 EMCV-特異性元件在節(jié)肢動(dòng)物細(xì)胞中的作用完全無效。在本發(fā)明中，將EMCV IRES克隆至VEEV TC-83基因組中，使病毒結(jié)構(gòu)基因的翻譯 為IRES依賴性的。基因組之一在亞基因組RNA的5’ UTR中含有功能性亞基因組啟動(dòng)子和 IRES。該病毒是有生存力的，但其產(chǎn)生亞基因組RNA的能力促使進(jìn)一步的進(jìn)化，這導(dǎo)致IRES 缺失和很可能回復(fù)突變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)的帽依賴性翻譯。后者的缺失使其能夠在蚊子細(xì)
6胞中復(fù)制。根據(jù)其不能回復(fù)突變?yōu)槊币蕾囆苑g，在亞基因組啟動(dòng)子中具有多重突變的第 二變體是穩(wěn)定的。因?yàn)檫@類回復(fù)突變不僅需要IRES缺失，而且還需要亞基因組啟動(dòng)子的修 復(fù)，我們通過13個(gè)突變使所述亞基因組啟動(dòng)子的修復(fù)失活，這些多重突變的直接回復(fù)突變 可能代表了微不足道的風(fēng)險(xiǎn)。然而，通過在nsP2基因中累積其他的適應(yīng)性突變，該變體為 進(jìn)化為更有效的復(fù)制表型發(fā)展了令人感興趣的途徑。這些突變未顯著地改變病毒RNA復(fù)制 水平、病毒結(jié)構(gòu)蛋白的合成或它們在細(xì)胞中的區(qū)域化。檢測的突變也未產(chǎn)生能夠增加基因 組包裝效率的其他跡象。因此，它們作用的機(jī)制仍待確定。然而，累積的公布數(shù)據(jù)表明RNA+ 病毒基因組的包裝由復(fù)制復(fù)合物強(qiáng)力決定，并且該基因組需要通過功能性nsP呈遞為用于 粒子形成的結(jié)構(gòu)蛋白02，30)。本文的科學(xué)工作假說(working hypothesis)在于，nsP2的 解旋酶結(jié)構(gòu)域可能參與用于將病毒基因組包裝成核殼體的病毒基因組的呈遞，并因此確認(rèn) 的突變可能對該過程的效率具有積極的效果。應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明的目的是開發(fā)不能在節(jié)肢動(dòng)物載體中復(fù)制并表現(xiàn)出穩(wěn)定的、更 減毒表型的VEEV變體。設(shè)計(jì)的VEEV/mutSG/IRES/1變體在IFN- α/β感受態(tài)細(xì)胞和IFN-信 號(hào)缺失ΒΗΚ-21細(xì)胞中的緩慢生長，其在組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)較高水平IFN-α/β的能力，其顯 著降低的甚至在皮內(nèi)注射接種后殺死新生小鼠的能力，以及其不在蚊子細(xì)胞中復(fù)制的能力 表明，該變體可能滿足這些需要。在不同的動(dòng)物模型中將進(jìn)一步研究其免疫原性。此外，據(jù) 信，通過使用類似的基于EMCV IRES的策略能夠使其它致腦炎甲病毒衰減，所述策略能夠與 最近幾年開發(fā)的其他方法聯(lián)合使用(1，13-15，31)?？傊?，本發(fā)明的目的是減毒甲病毒的開發(fā)和其作為抗致腦炎甲病毒的新型疫苗的 應(yīng)用，所述致腦炎甲病毒包括VEEV、EEEV和TOEV和其它在人類和家畜中引起疾病的諸如基 孔肯雅病毒(Chikungunya virus)的其它甲病毒。這類甲病毒的復(fù)制將依賴于EMCV IRES, 所述EMCV IRES使它們不能在蚊子細(xì)胞或蚊子載體中復(fù)制。更重要的是，因?yàn)橐氩《净?因組中的廣泛修飾，所以該表型是不可逆的。因此，這些新的變體能夠用于接種，而不用擔(dān) 心它們通過天然蚊子載體傳播的可能性。本發(fā)明涉及產(chǎn)生減毒重組甲病毒，包括以下步驟在甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4(nsP4) 編碼序列的末端和亞基因組RNA編碼序列的起始AUG之間克隆腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體 進(jìn)入位點(diǎn)(EMCV IREQ，代替天然5’UTR。該方法還可以包括通過在亞基因組RNA中成簇的 點(diǎn)突變和天然5’ UTR的缺失使甲病毒亞基因組啟動(dòng)子失活。此外，亞基因組啟動(dòng)子的失活 可以不修飾非結(jié)構(gòu)蛋白4的羧基端。另外，該方法還可以在非結(jié)構(gòu)蛋白2(nsP2)中引入有 效增加病毒復(fù)制、釋放和病毒滴度的適應(yīng)性突變。非結(jié)構(gòu)蛋白2中適應(yīng)性突變的實(shí)例可以 包括但不限于Y37tl — C、K371 — Q、P349 — T、D418 — A、K423 — T或其組合。此外，甲病毒的實(shí) 例可以包括但不限于委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東部馬腦炎病毒(EEEV)、西部馬腦炎病 毒(WEEV)或基孔肯雅病毒。本發(fā)明還涉及通過以上討論的方法所產(chǎn)生的減毒重組甲病毒。這類甲病毒不能在 蚊子中復(fù)制，不能通過蚊子載體傳播，能夠誘導(dǎo)高水平IFN α/β JgIFN α/β細(xì)胞中的緩 慢生長，能在IFN信號(hào)缺失ΒΗΚ-21細(xì)胞中緩慢生長，或其組合。本發(fā)明還涉及包含編碼以上討論的減毒重組甲病毒的核苷酸序列的載體和包含 并表達(dá)該載體的宿主細(xì)胞。構(gòu)建載體并在細(xì)胞中表達(dá)它們是本領(lǐng)域眾所周知且標(biāo)準(zhǔn)的技 術(shù)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于本領(lǐng)域可以使用的常規(guī)試驗(yàn)和知識(shí)來構(gòu)建這類載體。
本發(fā)明還涉及包含以上討論的減毒重組甲病毒和藥用可接受載體的藥物組合物。 本發(fā)明還涉及包含本文的減毒重組甲病毒的免疫原性組合物。本發(fā)明還涉及保護(hù)個(gè)體不受暴露于甲病毒而導(dǎo)致的感染危害的方法，所述方法包 括以下步驟給予免疫有效量的以上討論的免疫原性組合物，由此保護(hù)個(gè)體不受暴露于甲 病毒而導(dǎo)致的感染的危害。受益于所述方法的個(gè)體可以為人類或家畜。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生不能感染蚊子的減毒重組甲病毒的方法，所述方法包括以下步 驟將腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)和病毒殼體基因克隆至包膜糖蛋白基因下游， 且所述病毒殼體基因位于亞基因組區(qū)3’末端，恰好在3’ UTR的上游，其中病毒殼體以帽非 依賴性方式表達(dá)且包膜蛋白基因以帽依賴性方式翻譯，但病毒殼體蛋白以IRES依賴性方 式翻譯。如本文所使用的，術(shù)語“a(—個(gè))”或“an(—個(gè))”可以表示一個(gè)或多個(gè)。如本文 在權(quán)利要求中所用的，當(dāng)其與詞語“包含”結(jié)合使用時(shí)，詞語“a”或“an”可以表示一個(gè)或多 于一個(gè)。如本文所用的“另一個(gè)”或“其它”可以表示至少另一個(gè)或多個(gè)相同或不同的主張 的要素或其組分。通過諸如皮下、靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、皮層內(nèi)、肌肉內(nèi)、局部或鼻部的本領(lǐng)域任 何方法標(biāo)準(zhǔn)能夠單獨(dú)地或者全身地或局部地給予本文所述的組合物。本文所述組合物的劑 量制劑可以包含適合給藥方法的常規(guī)非毒性生理的或藥用可接受載體或介質(zhì)，并且為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知。本文所述組合物可以單獨(dú)地給藥一次或多次，以實(shí)現(xiàn)、保持或改善治療效果。本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知如何確定劑量或者該組合物的適當(dāng)劑量是否包含單次給藥劑量或多次給 藥劑量。適當(dāng)?shù)膭┝咳Q于個(gè)體的健康、甲病毒所引起的感染的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)和/或預(yù) 防，給藥途徑和所用的制劑。給出的以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明的各種實(shí)施方案，并非以任何方式限制本發(fā) 明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易地理解本發(fā)明非常適合實(shí)現(xiàn)這些目的并達(dá)到提及的目標(biāo)和優(yōu) 勢，以及本文固有的那些目的、目標(biāo)和優(yōu)勢。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)想到其中的變化和其他用 途，所述變化和用途包括于權(quán)利要求的范圍所限定的本發(fā)明的精神中。實(shí)施例1細(xì)胞培養(yǎng)物BHK-21 細(xì)胞由 Paul Olivo (Washington University，St. Louis，Mo)提供，并且 Vero 細(xì)胞由 Charles Rice (Rockefeller University, NY, NY)提供。NIH 3T3 細(xì)胞由美國 禾中(American Type Tissue Culture Collection) (Manassas, VA)3 ^ 細(xì)胞系于37°C下維持于補(bǔ)充了 10%胎牛血清(FBS)和維生素的α極限必需培養(yǎng)基(aMEM) 中。蚊子 C7IO 細(xì)胞由 Henry Huang (Washington Univ. ,St. Louis, MO)獲得，并且使之在補(bǔ) 充了 10%熱失活的FBS和10%磷酸胰蛋白肉湯(TPB)的DMEM中繁殖。實(shí)施例2質(zhì)粒構(gòu)建將標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)用于所有的質(zhì)粒構(gòu)建。圖譜和序列根據(jù)要求從作者獲得。在 其它地方描述了具有在SP6 RNA聚合酶啟動(dòng)子的控制下的VEEV TC-83基因組的原始質(zhì)粒 ρVEEV TC-83 (33) pVEEV/IRES含有帶有EMCV多聚蛋白的最初4個(gè)密碼子的EMCVIRES。將該序列克隆至5’ UTR末端和起始AUG之間的VEEV亞基因組RNA編碼序列中。pVEEV/ mutSG/IRES編碼VEEV TC-83基因組，其中亞基因組啟動(dòng)子通過成簇的點(diǎn)突變失活，所述成 簇的點(diǎn)突變未修飾nsP4羧基端的氨基酸序列(圖IA和1B)。該病毒基因組缺失亞基因組 RNA的5’ UTR0因此，預(yù)料VEEV TC-83非結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)蛋白由相同的基因組RNA來合成。通 過所選變體目的片段的PCR擴(kuò)增，隨后通過原始基因組中相應(yīng)片段的替換，將適應(yīng)性突變 引入pVEEV/mutSG/IRES編碼的nsP2中。使用基于PCR的相同的技術(shù)于將不同的片段合成 克隆至VEEV/mutSG/IRES基因組3，UTR的SphI位點(diǎn)。在用拯救的病毒進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)前，將 所有克隆的片段測序。實(shí)施例3RNA 轉(zhuǎn)錄將質(zhì)粒通過CsCl梯度離心純化，并通過MluI消化來線性化。在帽類似物的存在 下，通過SP6 RNA聚合酶(Ambion)合成RNA(New England Biolabs)。轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)量和完整 性在非變性條件下通過凝膠電泳來分析。在FluorChem成像器(Alpha Innotech)上測定 RNA濃度，將轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用于電穿孔，而無需額外純化。實(shí)施例4RNA 轉(zhuǎn)染使BHK-21細(xì)胞的電穿孔在前述條件下進(jìn)行、2 )。為了拯救病毒，將Ig體外合成 的病毒基因組RNA電穿孔至細(xì)胞中(27)，隨后將它們植入100-mm培養(yǎng)皿中，并孵育至觀察 到細(xì)胞病變效應(yīng)為止。使用標(biāo)準(zhǔn)噬斑實(shí)驗(yàn)在BHK-21細(xì)胞上測定病毒滴度06)。為了評估RNA感染性，將電穿孔的BHK-21細(xì)胞的十倍稀釋液植入包含分流的原初 細(xì)胞的6孔Costar平板中。在含5% CO2的孵育箱中于37°C下孵育Ih后，將細(xì)胞用補(bǔ)充有 3% FBS的含有0.5%超純瓊脂糖的aiil MEM覆蓋。于37°C培養(yǎng)兩天后，將噬斑用結(jié)晶紫染 色，并以每g轉(zhuǎn)染的RNA的空斑形成單位(PFU) /mg來測定侵染性。實(shí)施例5病毒基因組測序在病毒儲(chǔ)存液滴定期間，隨機(jī)選擇大噬斑(不用中性紅染色)。將病毒從瓊脂糖 膠塊中提取至MEM中，并將后者的培養(yǎng)基的等分試樣用于感染35-mm培養(yǎng)皿中的BHK-21 細(xì)胞。當(dāng)深度CPE發(fā)展后，收獲病毒儲(chǔ)存液，用于進(jìn)一步表征，并根據(jù)制造商(Invitrogen) 的說明書通過TRizol試劑，從感染的細(xì)胞中分離RNA。使用標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR技術(shù)，合成長 度為約IOOOnt的重疊片段，通過瓊脂糖凝膠電泳純化并測序。通過使用其它地方所述的 FirstChoice RLM-RACE 試劑盒(Ambion)，進(jìn)行 5，UTR 的測序(16)。實(shí)施例6病毒復(fù)制分析將五分之一電穿孔的細(xì)胞植入35-mm培養(yǎng)皿中。在圖中所示的時(shí)間點(diǎn)，將培養(yǎng)基 替換并在BHK-21細(xì)胞中通過噬斑試驗(yàn)來測定病毒滴度06)。或者，將BHK-21、NIH3T3或 C7IO細(xì)胞植入35-mm培養(yǎng)皿中，并在圖中示出的MOI處感染。用新鮮的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基， 并在BHK-21細(xì)胞中通過噬斑試驗(yàn)測定收獲的樣品中病毒滴度。實(shí)施例7蛋白合成分析
將BHK-21細(xì)胞用^ig所示的RNA進(jìn)行電穿孔，并將五分之一電穿孔的細(xì)胞植入六 孔Costar平板中。轉(zhuǎn)染后12h，通過在0. 8ml缺乏甲硫氨酸的DMEM培養(yǎng)基中孵育30min， 對蛋白進(jìn)行代謝標(biāo)記，將所述DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充了 0. 1% FBS和20Ci/ml的[35S]甲硫氨酸。 該孵育后，將它們刮入培養(yǎng)基中，通過離心沉淀，并溶解于100μ 1標(biāo)準(zhǔn)蛋白上樣緩沖液中。 將等量蛋白上樣至十二烷基硫酸鈉(SDS)-10%聚丙烯酰胺凝膠上。電泳后，將凝膠干燥并 放射自顯影。實(shí)施例8RNA 分析為了分析病毒-特異性RNA的合成，將細(xì)胞用^ig體外合成的病毒RNA進(jìn)行電穿 孔，并將五分之一的細(xì)胞植入35-mm培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染后4.證，將孔中的培養(yǎng)基用Iml補(bǔ)充 有 10% FBS、ActDd μ g/ml)和[3H]尿苷(20Ci/ml)的 aMEM 替換。于 37°C孵育 4h 后，根 據(jù)制造實(shí)驗(yàn)方案，通過Trizol (Invitrogen)，分離總細(xì)胞RNA，隨后在二甲亞砜中用乙二醛 變性并通過使用上述條件的瓊脂糖凝膠電泳來分析(7)。將凝膠用2，5-二苯基噁唑(PPO) 浸漬，干燥并放射自顯影。實(shí)施例9IFN- α /β 試驗(yàn)通過前述生物學(xué)試驗(yàn)，測量培養(yǎng)基中IFN- α / β的濃度。簡言之，在96_孔 平板中將細(xì)胞以5X IO4細(xì)胞/孔的濃度植入IOOml完全培養(yǎng)基中，并在37°C下孵育 他。將從感染的NIH 3T3細(xì)胞收獲的培養(yǎng)基樣品用UV光處理lh，并直接在具有細(xì)胞 的孔中以二倍步驟連續(xù)稀釋。于37°C孵育24h后，將另外IOOml具有2X IO5PFU皰疹性口 炎病毒(VSV)的培養(yǎng)基添加至孔中，并繼續(xù)孵育36h-40h。隨后將細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，并將 終點(diǎn)測定為保護(hù)50%的細(xì)胞免于VSV-誘導(dǎo)的CPE的危害所需的IFN-α/β的濃度。用于 結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化的IFN- α/β標(biāo)準(zhǔn)品從ATCC購買，且在ΒΗΚ-21細(xì)胞中通過噬斑試驗(yàn)測定釋放 的病毒的滴度。實(shí)施例10蚊子中病毒復(fù)制的評估為了評價(jià)在蚊子體內(nèi)的復(fù)制能力，使用IyL體積中約IO5PFU,胸廓內(nèi)接種埃及斑 蚊(Aedes aegypti)(源自德克薩斯州加爾維斯敦(Galveston, Texas)的群體)。之所以 選擇胸廓內(nèi)接種而不是口服暴露，是因?yàn)閹缀跞魏螏煳靡子谕ㄟ^任何甲病毒胸廓內(nèi)感染， 而口服易感性是高度可變的并且較不敏感0幻。使用玻璃移液管接種后，將蚊子于27C下 孵育10天，隨后在ImL補(bǔ)充有20% FBS和兩性霉素B的MEM中單獨(dú)滴定。隨后將100 μ L 體積的每一滴定的蚊子添加至M孔板上的Vero細(xì)胞單層并觀察細(xì)胞病變效應(yīng)5天以檢測 感染。試驗(yàn)對照包括TC-83親本病毒和IRES突變體。實(shí)施例11用毒性VEEV免疫和激發(fā)以20 μ 1 PBS總體積中約IO6PFU的劑量，用VEEV TC-83菌株或設(shè)計(jì)的突變體大腦 內(nèi)(皮內(nèi)注射)接種六日齡NIH瑞士小鼠。感染后，將每一組8只至10只動(dòng)物，維持兩個(gè) 月而不進(jìn)行任何處理。持續(xù)21天，每日觀察小鼠的疾病(翹毛(ruffled fur)、精神萎靡、 食欲減退和/或麻痹)和/或死亡癥狀。
使用VEEV TC-83或重組病毒以約IO6PFU/小鼠的劑量接種8周齡雌性NIH瑞士小 鼠，隨后用約IO4PFU的高毒性VEEV菌株3908皮下激發(fā)4周。持續(xù)21天，小鼠的疾病(翹 毛、精神萎靡、食欲減退和/或麻痹)和/或死亡癥狀每日觀察兩次。實(shí)施例12基于重組VEEV TC-83的病毒本研究的理論基礎(chǔ)是開發(fā)能夠在脊椎動(dòng)物細(xì)胞但不能在蚊子來源的細(xì)胞中有效 復(fù)制的甲病毒。因此，這類病毒的復(fù)制必須依賴于僅在脊椎動(dòng)物中而不在昆蟲細(xì)胞中起 作用的蛋白或RNA序列。為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，本發(fā)明設(shè)計(jì)了使甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)依賴于 EMCV IRES的方法。設(shè)計(jì)的IRES不含多聚(C)序列但保留了 EMCV多聚蛋白的最初4個(gè)密 碼子，以實(shí)現(xiàn)VEEV TC-83結(jié)構(gòu)基因的最有效翻譯。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)證實(shí)這些其他氨 基酸對病毒復(fù)制沒有負(fù)面效應(yīng)，但對病毒結(jié)構(gòu)蛋白的翻譯具有可檢測的積極效果(未顯示 數(shù)據(jù))。在一構(gòu)建體VEEV/IRES中，將IRES序列克隆至完整5，UTR下游亞基因組RNA中 (圖1A)。由此，預(yù)料該基因組能夠進(jìn)行亞基因組RNA合成。在另一重組體VEEV/mutSG/IRES 中，通過13個(gè)同義點(diǎn)突變使亞基因組啟動(dòng)子失活(圖IA和1B)，預(yù)料這防止回復(fù)突變?yōu)榛?性SGRNA啟動(dòng)子。為了促進(jìn)VEEV結(jié)構(gòu)蛋白的合成，克隆IRES序列以取代^S 5' UTR0體外合成VEEV/IRES、VEEV/mutSG/IRES 和未修飾的 wt VEEVTC-83 的基因組 RNA， 并轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中。在感染性中心試驗(yàn)中，VEEV/IRES RNA表現(xiàn)出與TC-83RNA相同 的感染性，并且發(fā)展了類似于那些TC-83的統(tǒng)一大小的噬斑(圖IA和1C)。這強(qiáng)烈地表明 設(shè)計(jì)的病毒的生產(chǎn)性復(fù)制不需要額外的適應(yīng)性突變。VEEV/IRES復(fù)制至超過109PFU/ml的 滴度，但這些最終滴度和病毒復(fù)制速率比VEEVTC-83的低得多(圖1D)。使用缺乏亞基因組 啟動(dòng)子的另一重組病毒基因組VEEV/mutSG/IRES轉(zhuǎn)染的BHK-21細(xì)胞產(chǎn)生感染性病毒的效 率非常低(圖1D)。在感染性中心試驗(yàn)中，該構(gòu)建體主要表現(xiàn)出細(xì)小的噬斑，并且它們的數(shù) 目難以估計(jì)。令人驚訝的是，該病毒在連續(xù)傳代后表現(xiàn)出進(jìn)一步進(jìn)化，并迅速發(fā)展了產(chǎn)生更 大噬斑的變體(圖IC和未示出的數(shù)據(jù))。圖ID中所示的生長曲線表示形成小噬斑和大噬 斑的病毒的釋放。因此，這些試驗(yàn)的結(jié)果表明，至少在VEEV/IRES基因組的情況下，EMCV IRES能夠 產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白的水平，足以用于VEEV復(fù)制。具有突變的亞基因組啟動(dòng)子的構(gòu)建體VEEV/ mutSG/IRES產(chǎn)生能夠用于更有效復(fù)制而進(jìn)化的復(fù)制缺陷病毒。實(shí)施例13VEEV/mutSG/IRES中適應(yīng)性突變的分析VEEV/mutSG/IRES向大噬斑表型的進(jìn)化表明，在病毒基因組中其他突變的累積。由 于大量引入的點(diǎn)突變，向wt基因組序列的回復(fù)突變是不可能的事件，因此適應(yīng)性突變的位 置難以預(yù)計(jì)。為了確認(rèn)突變，隨機(jī)選擇電穿孔后24h收獲的VEEV/mutSG/IRES樣品的5個(gè)噬 斑，并且對2個(gè)噬斑純化變體的整個(gè)基因組(包括3’和5’ UTR)進(jìn)行測序。已確認(rèn)的突變 的列表如圖2A所示。它們中大多數(shù)為同義的，并且不存在于已知的順式作用RNA元件中。 因此，它們對病毒復(fù)制的作用非常地不可靠。然而，兩個(gè)噬斑分離物的基因組在nsP2蛋白 中含有相同的突變Y37tl — C，且基因組中之一也使鄰近的編碼的aa發(fā)生變化(K371 — Q)。為了檢測突變對病毒復(fù)制的影響，將Y37tl — C和Y37tl — C以及K371 — Q克隆至原始VEEV/mutSG/IRES的構(gòu)建體中(圖2B)，并將RNA侵染性、病毒復(fù)制速率和噬斑大小與原 始VEEV/mutSG/IRES和其它構(gòu)建體的比較。還將相同的突變克隆至VEEV TC-83基因組中， 以檢測它們對該親代病毒復(fù)制的影響。在基因組中具有一個(gè)或兩個(gè)突變的IRES-編碼基因 組RNA，即VEEV/mutSG/IRES/1和VEEV/mutSG/IRES/2，在感染性中心試驗(yàn)中表現(xiàn)出與VEEV TC-83RNA和拯救的病毒相同的侵染性，并形成類似于VEEV TC-83噬斑大小的統(tǒng)一的噬斑 大小(數(shù)據(jù)未示出)。它們還表現(xiàn)出生長速率的有力增加(圖2C和1D)，但第二突變的影 響勉強(qiáng)可檢測。因此，將數(shù)據(jù)合起來就表明，nsP2中的Y37tl — C突變對病毒復(fù)制上具有有 力的積極影響，并且第二突變未顯著地改善它。當(dāng)引入VEEV TC-83中基因組時(shí)，相同的突 變對病毒復(fù)制速率或最終的滴度不具有任何可檢測的影響(圖2C)，這表明復(fù)制增強(qiáng)對于 VEEV/mutSG/IRES變體是特異性的。確認(rèn)的aa變化(Y37tl — C和K371 — Q)僅能夠代表一部分導(dǎo)致亞基因組啟動(dòng)子-缺 失的含有IRES病毒有效復(fù)制的可能突變。因此，在平行實(shí)驗(yàn)中，將由樣品分離的其它3個(gè) 噬斑克隆體中的nt 2161-2959進(jìn)行測序，并在體外合成的RNA和5個(gè)噬斑純化的變體的 RNA轉(zhuǎn)染后24h收獲，在Vero細(xì)胞中另外3次傳代后，從病毒儲(chǔ)存液分離所述噬斑純化的 變體。可以預(yù)料這類傳代將導(dǎo)致選擇最有效的復(fù)制病毒。確認(rèn)的突變的列表如圖3A所示。 由RT-PCR來源的DNA片段直接測序；因此，呈現(xiàn)的突變代表噬斑來源的病毒群體中的一致 序列，并且不是源自PCR的(圖:3B)。所有分離物在對應(yīng)于nsP2 RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域羧基端片段的測序片段中，都含有突 變，所有改變的氨基酸都位于氨基酸348-4M之間。此外，在原始病毒儲(chǔ)存液中電穿孔后產(chǎn) 生的最常見突變以及在傳代庫(passaged pool)中的最常見突變?yōu)閅37tl — C。這表明該突 變可能對復(fù)制具有一種最顯著的影響；因此，將具有該特定突變的上述變體VEEV/mutSG/ IRES/1用于以下部分所描述的實(shí)驗(yàn)中。實(shí)施例14nsP2 Y，一 C突變對病毒復(fù)制的影響在nsP2相關(guān)的RNA解旋酶的羧基端片段中適應(yīng)性突變的確認(rèn)，是令人驚訝的，并 且未提出有關(guān)VEEV/mutSG/IRES復(fù)制增加的任何顯而易見的解釋。該突變可能對RNA復(fù)制 或病毒結(jié)構(gòu)蛋白翻譯或病毒粒子形成或復(fù)制復(fù)合體區(qū)域化等具有刺激效果。然而，最期待 的效果為病毒RNA合成的增加。因此，將BHK-21細(xì)胞用體外合成的不同VEEV變體的基因 組轉(zhuǎn)染，在存在ActD的情況下，在電穿孔4.證后開始，用[3H]尿苷將新合成的病毒RNA代 謝標(biāo)記4h，并通過瓊脂糖凝膠電泳分析RNA(圖4A)。如所預(yù)料的，VEEV/IRES能夠進(jìn)行亞基因組RNA合成，這表明在亞基因組RNA 5，UTR的3，末端引入的IRES未干擾亞基因組啟動(dòng)子的活性。VEEV/mutSG/IRES及其在 nsP2中具有適應(yīng)性突變的變體未產(chǎn)生可檢測的SG RNA。因此，引入這些基因組啟動(dòng)子序列 中的13個(gè)突變完全地廢止了亞基因組RNA的轉(zhuǎn)錄。令人驚訝的是，nsP2中的適應(yīng)性突變 對RNA基因組的復(fù)制沒有顯著的影響，并且VEEV/mutSG/IRES/Ι和VEEV/mutSG/IRES/2基 因組RNA與原始設(shè)計(jì)的VEEV/mutSG/IRES基因組一樣有效地復(fù)制。此外，所有變體的基因 組RNA復(fù)制非常類似于VEEV TC-83的基因組RNA復(fù)制。在原始VEEV TC-83RNA的情況下 也沒有檢測到這些突變的影響(見對應(yīng)于VEEV/1和VEEV/2的泳道)。該發(fā)現(xiàn)有力地表明 適應(yīng)性未導(dǎo)致RNA復(fù)制的增加。
在電穿孔后12h，評估病毒結(jié)構(gòu)蛋白的合成(圖4B)。到那時(shí)，VEEV/IRES-和 VEEV/mutSG/IRES-特異性病毒殼體及可能的其它結(jié)構(gòu)蛋白約2倍地合成，效率比在用 VEEV TC-83RNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中低。該合理小的差異未說明分別低多于4和7個(gè)數(shù)量級(jí)的 VEEV/1RES和VEEV/mutSG/IRES病毒的感染性滴度(與VEEV TC-83的滴度相比)，所述滴 度在轉(zhuǎn)染后12h收獲的樣品中檢測。此外，在本實(shí)驗(yàn)和其它實(shí)驗(yàn)中，病毒蛋白在含有原始 VEEV/mutSG/IRES基因組的BHK-21細(xì)胞中的合成，對比在nsP2中具有適應(yīng)性突變的VEEV/ mutSG/IRES/1和VEEV/mutSG/IRES/2，沒有檢測到差異。在用含有IRES的病毒感染的細(xì)胞 中，標(biāo)記的蛋白模式的區(qū)別特征在于，存在兩條額外的帶，其通過質(zhì)譜學(xué)確認(rèn)為熱休克蛋白 Hsp90和Hsp72。它們誘導(dǎo)的生物學(xué)意義仍不清楚，但可能源于導(dǎo)致病毒結(jié)構(gòu)蛋白折疊中的 某些異常，所述異常導(dǎo)致具有由IRES表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞中的應(yīng)激發(fā)展。在其他試驗(yàn)中，評估用VEEV TC-83,VEEV/mutSG/IRES 和 VEEV/mutSG/IRES/1 感染 的細(xì)胞中病毒糖蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布，并且通過用VEEV-特異性抗體染色來分析這些蛋白在 細(xì)胞表面的存在。沒有檢測到糖蛋白分布的顯著差異。檢查適應(yīng)性突變引起病毒基因組中 其他包裝信號(hào)形成的可能性；將含有突變的片段(對應(yīng)于VEEV基因組的nt 2533-2950)克 隆至VEEV/mutSG/IRES基因組的3，UTR中，并在感染性中心試驗(yàn)中檢測體外合成的RNA中 的重組體。與原始VEEV/mutSG/IRES相比，未檢測到噬斑大小或病毒滴度增加。在另一變體中，將亞基因組啟動(dòng)子和VEEV病毒殼體編碼序列克隆至VEEV/mutSG/ IRES基因組的3’UTR中，以檢測來自亞基因組RNA的其他病毒殼體的表達(dá)是否增加病毒復(fù) 制的效率。該修飾對于病毒滴度也沒有任何積極效果。最后，分析VEEV/mutSG/IRES是否 產(chǎn)生無基因組亞病毒顆粒而不是感染性病毒。觀察到情況并非如此用VEEV/mutSG/IRES RNA轉(zhuǎn)染的和用[35S]甲硫氨酸代謝標(biāo)記的細(xì)胞不產(chǎn)生能夠通過蔗糖梯度超速離心檢測的 亞病毒顆粒(數(shù)據(jù)未示出)。因此，結(jié)合上述總和分析，對于原始VEEV/mutSG/IRES非常低 效的復(fù)制，或?qū)τ赩EEV nsP2中檢測的突變對含有IRES的病毒復(fù)制的積極效果，未提出明 顯的機(jī)理解釋。然而，本發(fā)明的主要目的是開發(fā)VEEV變體，其復(fù)制依賴于于EMCV IRES功 能，VEEV/1RES和VEEV/mutSG/IRES/Ι這兩者看來滿足該目的。實(shí)施例15蚊子細(xì)胞和蚊子中IRES依賴性VEEV變體的復(fù)制關(guān)于甲病毒復(fù)制的累積數(shù)據(jù)清楚地表明了它們的遺傳不穩(wěn)定性和進(jìn)化的高速率， 這導(dǎo)致任何異源基因的缺失(17，40)，特別是如果它們對病毒復(fù)制具有負(fù)面效果。因此，本 發(fā)明關(guān)鍵的問題之一是設(shè)計(jì)的EMCV IRES的插入片段是否穩(wěn)定并且使病毒不能在蚊子細(xì)胞 中復(fù)制。為了對此進(jìn)行檢測，將C7IO蚊子細(xì)胞用VEEV/IRES和VEEV/mutSG/IRES病毒感染， 所述VEEV/IRES和VEEV/mutSG/IRES病毒是在體外合成的RNA電穿孔至BHK-21細(xì)胞24h 后收獲的。使用VEEV/mutSG/IRES而不是在nsP2中具有適應(yīng)性突變Y37tl — C的上述VEEV/ mutSG/IRES/Ι，檢測RNA轉(zhuǎn)染后釋放的變體的整個(gè)庫在蚊子細(xì)胞中復(fù)制的能力。對于第一代，在C7IO細(xì)胞感染后48h，VEEV/IRES的滴度接近1. 5X 101QPFU/ml，并 且在第二代后收獲的儲(chǔ)存液中檢測到類似的滴度(圖5A和5B)。相反，在第一代后，VEEV/ mutSG/IRES的滴度為150PFU/ml (這可能反映用于感染的遺留病毒而不是在蚊子細(xì)胞中產(chǎn) 生的新生病毒)，并且在隨后的第二代后低于檢測極限(圖5A和5B)。在其他實(shí)驗(yàn)中，將在 nsP2中含有適應(yīng)性突變的VEEV/mutSG/IRES的噬斑純化變體在C7IO細(xì)胞中傳代。在雙盲傳代后，未回收到感染性病毒。在另一實(shí)驗(yàn)中，用約IO5PFU的VEEV TC-83和VEEV/mutSG/IRES/1變體胸廓內(nèi)接種 埃及斑蚊(Ae. Aegypti)。在埃及斑蚊中，17只用IRES突變體接種的蚊子中沒有一只蚊子為 進(jìn)行了可檢測的復(fù)制，而在CPE實(shí)驗(yàn)中，在17只用TC-83親本菌株接種的蚊子中17只復(fù)制 至可檢測的水平，平均滴度大于IO6PFU/蚊子。因此，含有IRES的VEEV變體VEEV/mutSG/ IRES/1不能在蚊子細(xì)胞中體外和體內(nèi)復(fù)制。為了解釋在蚊子細(xì)胞中傳代后VEEV/IRES (能夠產(chǎn)生亞基因組RNA變體)的高滴 度，隨機(jī)選擇兩個(gè)單獨(dú)的噬斑，并對含有IRES的基因組片段測序。在兩個(gè)分離物中，IRES序 列不再存在于病毒基因組中，并且僅發(fā)現(xiàn)了原始IRES的13和15個(gè)遺留核苷酸(圖5C)。 因此，蚊子細(xì)胞中VEEV/IRES變體的傳代導(dǎo)致IRES陰性變體的累積，并且VEEV/mutSG/ IRES(缺乏亞基因組啟動(dòng)子)不發(fā)展能夠在蚊子細(xì)胞中有效復(fù)制的突變體。實(shí)施例16VEEV/mutSG/IRES/Ι變體表現(xiàn)出減毒表型本發(fā)明旨在開發(fā)不能在蚊子來源的細(xì)胞(并且，相應(yīng)地蚊子載體)中復(fù)制，但在脊 椎動(dòng)物中表現(xiàn)出比親代VEEV TC-83更減毒的表型的VEEV變體。VEEV/mutSG/IRES/1變體較 低的復(fù)制速率帶來的憂慮是，用，該病毒不能在具有完整的IFN-a/b產(chǎn)生和信號(hào)的脊椎動(dòng) 物細(xì)胞中復(fù)制。然而，情況并非如此。圖6所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在不缺乏IFN-α/β分泌 及信號(hào)的NIH 3T3細(xì)胞中復(fù)制的VEEV/mutSG/IRES/Ι的滴度大于109PFU/ml。其復(fù)制引起更 有效的IFN-a/b誘導(dǎo)(圖6)，但顯然，IFN釋放未消除已建立的病毒復(fù)制。如在BHK-21細(xì)胞 中所示(圖2C)，VEEV/mutSG/IRES/l的復(fù)制比VEEV TC-83復(fù)制的效率低，這表明IRES-依 賴性突變體可能是體內(nèi)衰減的。實(shí)際上，用約IO6PFU皮內(nèi)注射接種6日齡小鼠后，86%的 小鼠幸免于感染并且沒有發(fā)展腦炎癥狀；相反，相同劑量的VEEV菌株TC-83殺死92%的小 鼠。結(jié)合這些數(shù)據(jù)，表明基因修飾的IRES依賴性VEEV比親代VEEV TC-83更衰減。然而，VEEV/mutSG/IRES/Ι變體在新生和成年小鼠中仍然保持免疫原性。在12只 幸存于用VEEV/mutSG/IRES/Ι皮內(nèi)注射接種的6日齡小鼠中，10只幸存于5周后給予的 IO4PFU野生型VEEV菌株3908的皮下注射應(yīng)激；相反，在12只以相同方式應(yīng)激的假(PBS) 感染小鼠中，沒有幸存(圖7)。VEEV/mutSG/IRES/Ι在成年小鼠中也是免疫原性的；用約 IO6PFU 一次皮下注射免疫保護(hù)80%的小鼠不受3周后用IO4PFU ( IO4LD5tl)的VEEV菌株 3908的皮下注射激發(fā)(圖8)。在激發(fā)前，所有這些小鼠中的中和抗體滴度(PRNT8tl)為不可 檢測的<1 20，這表明1次種接種后的不完全保護(hù)可能是較低水平的含有IRES的病毒體 內(nèi)復(fù)制的結(jié)果。因此，其高水平的衰減賦予高度安全性，但可能需要重復(fù)接種。實(shí)施例17降低衰減但保持蚊子感染性缺乏的表達(dá)策略在本發(fā)明單獨(dú)的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)新穎的表達(dá)策略以降低衰減但保持蚊子感染性 的缺乏。該策略涉及將IRES置于包膜糖蛋白基因的下游，且病毒殼體基因位于亞基因組區(qū) 3’末端，恰好在3’ UTR的上游(圖9)。因此，獲得亞基因組信息，同時(shí)，包膜蛋白基因以帽 依賴性方式翻譯，而病毒殼體蛋白以IRES依賴性方式翻譯。BHK和Vero細(xì)胞中該新IRES 突變體的復(fù)制也是有效的，但不能在C7/10蚊子細(xì)胞中檢測到。胸廓內(nèi)接種20只埃及斑紋 成年雌蚊子未獲得復(fù)制的證據(jù)。當(dāng)用IRES版本2(IRES version幻接種小鼠時(shí)，所有10只血清轉(zhuǎn)化，平均滴度比常規(guī)TC-83所誘導(dǎo)的滴度低約2倍，并且所有10只小鼠受到IRES 版本2的保護(hù)，而不受致死的皮下應(yīng)激的危害。因此，新的IRES表達(dá)策略看來導(dǎo)致較低的 衰減同時(shí)保持蚊子非感受態(tài)表型。表權(quán)利要求
1.產(chǎn)生減毒重組甲病毒的方法，包括以下步驟在甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4(nsP4)編碼序列的末端和亞基因組RNA編碼序列的起始AUG 之間克隆腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(EMCV IREQ，代替亞基因組RNA的天然 5' UTR0
2.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括通過所述亞基因組RNA中成簇的點(diǎn)突變和所述天然5’UTR的缺失使所述甲病毒亞基因 組啟動(dòng)子失活。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述亞基因組啟動(dòng)子的失活不修飾非結(jié)構(gòu)蛋白4的羧基端。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其還包括在非結(jié)構(gòu)蛋白2(nsP》中引入有效增加病毒復(fù)制、釋放和病毒滴度的適應(yīng)性突變。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述適應(yīng)性突變?yōu)閅37tl— C、K371 — Q、P349 — T、 D418 —A、Ku3 —T 或其組合。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述甲病毒為基孔肯雅病毒。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述甲病毒為東部馬腦炎病毒。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述甲病毒為委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述甲病毒為西部馬腦炎病毒。
10.通過權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的減毒重組甲病毒。
11.如權(quán)利要求10所述的減毒重組甲病毒，其中所述甲病毒不能在蚊子中復(fù)制，不能 通過蚊子載體傳播，能夠誘導(dǎo)高水平的IFN α/β,能在IFN α/β細(xì)胞中緩慢生長，能在 IFN信號(hào)缺失ΒΗΚ-21細(xì)胞中緩慢生長或其組合。
12.載體，包含編碼權(quán)利要求10所述的減毒重組甲病毒的核苷酸序列。
13.宿主細(xì)胞，包含并表達(dá)權(quán)利要求12所述的載體。
14.藥物組合物，包含權(quán)利要求10所述的減毒重組甲病毒和藥用可接受載體。
15.免疫原性組合物，包含權(quán)利要求10所述的減毒重組甲病毒。
16.保護(hù)個(gè)體不受暴露于甲病毒而導(dǎo)致的感染危害的方法，其包括以下步驟 給予免疫有效量的權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，由此保護(hù)所述個(gè)體不受暴露于所述甲病毒而導(dǎo)致的感染的危害。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述個(gè)體為人類或家畜。
18.產(chǎn)生不能感染蚊子的減毒重組甲病毒的方法，包括以下步驟將腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)和病毒殼體基因克隆至包膜糖蛋白基因下游， 且所述病毒殼體基因位于亞基因組區(qū)3’末端，恰好在3’ UTR的上游，其中所述病毒殼體以 帽非依賴性方式表達(dá)且所述包膜蛋白基因以帽依賴性方式翻譯，但病毒殼體蛋白以IRES 依賴性方式翻譯。
全文摘要
本發(fā)明公開了不能在蚊子細(xì)胞中復(fù)制并且不能通過蚊子載體傳播的減毒重組甲病毒。這些減毒甲病毒可以包括但不限于西部馬腦炎病毒、東部馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒或基孔肯雅病毒。本發(fā)明還公開了產(chǎn)生這類甲病毒的方法和它們作為免疫原性組合物的用途。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102083986SQ200980110510
公開日2011年6月1日 申請日期2009年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月24日
發(fā)明者葉蓮娜·芙偌洛娃, 埃利亞·V·芙偌洛烏, 斯科特·C·韋弗 申請人:德克薩斯大學(xué)系統(tǒng)董事會(huì)