專利名稱：一種乙烯基修飾的基因芯片、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因芯片，具體地說，涉及一種乙烯基修飾的基因芯片、其制備方 法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因芯片(Gene Chip)通常指DNA芯片，其基本原理是指將大量寡核苷酸分子固 定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶 分子的數(shù)量?；蛐酒母拍瞵F(xiàn)已泛化到生物芯片(biochip)、微陣列(Microarray)、DNA 芯片(DNAchip)，甚至蛋白芯片?；蛐酒闪颂结樄滔嘣缓铣杉夹g(shù)、照相平板印刷技 術(shù)、高分子合成技術(shù)、精密控制技術(shù)和激光共聚焦顯微技術(shù)，使得合成、固定高密度的數(shù)以 萬計的探針分子以及對雜交信號進(jìn)行實時、靈敏、準(zhǔn)確的檢測分析變得切實可行?；蛐酒?技術(shù)在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)臨床檢驗領(lǐng)域、生物制藥領(lǐng)域和環(huán)境醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出了 強(qiáng)大的生命力，其中關(guān)鍵技術(shù)在于基因芯片具有微型化、集約化和標(biāo)準(zhǔn)化的特點，從而有望 實現(xiàn)“將整個實驗室縮微到一片芯片上”的愿望?；蛐酒趪鴥?nèi)外已形成研究與開發(fā)的 熱潮，許多科學(xué)家和企業(yè)家將基因芯片同當(dāng)年的PCR技術(shù)相提并論，認(rèn)為核酸雜交技術(shù)的 集成化已經(jīng)和正在使分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)生一場變革，將帶來巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。寡核苷酸在基片表面的固定是制作基因芯片的第一步，因此制備高質(zhì)量的基因芯 片基片，實現(xiàn)寡核苷酸的有效固定是基因芯片研究的關(guān)鍵技術(shù)之一?；d體的材料表面 必須有可以進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的活性官能團(tuán)，以便與生物分子進(jìn)行偶聯(lián)；而載體本身應(yīng)當(dāng)是惰 性的，即有足夠的穩(wěn)定性和良好的生物兼容性。理想的基因芯片基片應(yīng)具有以下特點1) 基片的熒光背景信號低；2)固定的寡核苷酸必須穩(wěn)定，在雜交、洗滌和分析過程中不易脫 落；3)有足夠的固定密度以保證檢測分析時能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的檢測信號；4)適度的固定容 量；5)盡量減少非特異性吸附。目前適用于制作基片載體的材料有玻璃片、硅片、金基底、 尼龍、纖維素和聚丙烯酰胺等?；砻娴幕钚怨倌軋F(tuán)修飾主要有氨基、醛基、環(huán)氧基等，但 是環(huán)氧基修飾基片過程較為復(fù)雜，固定效率不高；氨基修飾基片雖較為簡單，但結(jié)合固定效 果不理想；醛基修飾基片的固定量較低，靈敏度不高，穩(wěn)定性方面也存在問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種穩(wěn)定的、結(jié)合強(qiáng)度大、固定效率高、熒 光背景低的乙烯基修飾的基因芯片。本發(fā)明的另一目的是提供上述乙烯基修飾的基因芯片的制備方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供用上述乙烯基修飾的基因芯片在固定寡核苷酸中的 應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種乙烯基修飾的基因芯片，其基因芯片的基片 載體表面上帶有末端含碳碳雙鍵的活性官能團(tuán)，其結(jié)構(gòu)如式1所示，<formula>formula see original document page 4</formula>其中，η為1-10的整數(shù)，m為大于1的整數(shù)。前述的基因芯片，其中制備所述基片載體的材料包括無機(jī)材料或有機(jī)高分子材 料，所述無機(jī)材料包括玻璃、硅片、金屬(例如金、銀、鐵、鋅、銅)等；有機(jī)高分子材料包括 殼聚糖、葡聚糖、聚乙烯醇、纖維素、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乳酸或聚丙烯酸酯等。制備本發(fā)明乙烯基修飾的基因芯片的方法，其包括步驟1)用乙醇將基片載體洗凈；2)采用分子自組裝技術(shù)將10_15mM的三乙氧基硅基烯組裝在羥基化或氨基化的 基片載體表面，形成一層末端為雙鍵的單分子自組裝膜，在無水乙醇中漂洗兩遍，氮氣吹 干；3)將上述所得基片載體放置在烘箱中，50-120°C下烘烤30-60min，即得。本發(fā)明提供的乙烯基修飾的基因芯片在固定寡核苷酸中的應(yīng)用，其具體方法為1)將1當(dāng)量5’-端帶有末端雙鍵修飾的寡核苷酸和0. 5% -1%當(dāng)量Grubbs催化 劑溶于DMSO中，配制成寡核苷酸濃度為ImM的點樣液；2)用點樣儀吸取上述點樣液，在基片上設(shè)定的矩陣上點樣，點樣量是5_20nL，點 樣后的基片放置在37°C相對濕度為75%的恒溫恒濕箱中避光固定8-12小時；3)清洗，甩干。所述的5’ -端帶有末端雙鍵修飾的寡核苷酸，其3’ _端還帶有熒光基團(tuán)，其結(jié)構(gòu) 如式2所示，<formula>formula see original document page 4</formula>式 2
其中，η為1-10的整數(shù)，F(xiàn)代表熒光基團(tuán)。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果是(1)本發(fā)明提供的乙烯基修飾的基因芯片，其基片修飾方法簡單、方便，適合大規(guī) 模生產(chǎn)，基片載體來源豐富。(2)本發(fā)明采用分子自組裝技術(shù)，將活性基團(tuán)通過共價鍵固定在基片載體表面，不 易脫落，固定率高，而且可以保證表面活性基團(tuán)的高密度性和均一性。(3)本發(fā)明提供的乙烯基修飾的基因芯片適于固定有末端雙鍵修飾的寡核苷酸， 固定方法采用烯烴復(fù)分解反應(yīng)，結(jié)合強(qiáng)度大，固定效率高。(4)本發(fā)明提供的乙烯基修飾的基因芯片不會導(dǎo)致熒光信號的明顯增大，熒光背 景低，635nm波長下的熒光背景小于100，平均固定效率大于50%。


圖1為本發(fā)明乙烯基修飾的基因芯片基片表面修飾原理圖2為本發(fā)明乙烯基修飾的基因芯片固定有末端雙鍵修飾的寡核苷酸原理圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1以無機(jī)材料為基片載體的基因芯片制備(1)用無水乙醇將表面羥基化的玻璃片(羥基化的玻璃片按照常規(guī)方法制備，具 體為配制濃H2SO4 H2O2體積比為7 3的溶液，于室溫下處理玻璃基片30min，再用大量 去離子水淋洗，放在烘箱中干燥，即得)清洗干凈；(2)將玻璃片放置在三乙氧基硅基烯，η = 1(化合物A)的無水乙醇溶液中 (15mM) 30min,使基片載體表面形成一層末端為雙鍵的單分子自組裝膜，在無水乙醇中漂洗 兩遍，氮氣吹干；(3)將上述所得基片放置在烘箱中，100°C下烘烤45min，使組裝更加牢固。其制備原理如圖1所示。實施例2以有機(jī)高分子材料為基片載體的基因芯片制備(1)用無水乙醇將聚乙烯醇為材質(zhì)的表面羥基化的塑料片(羥基化的塑料片的制 備方法與實施例1中羥基化的玻璃片的制備方法相同)清洗干凈；(2)將塑料片放置在三乙氧基硅基烯，η = 5(化合物A)的無水乙醇溶液中 (IOmM) 30min,使基片載體表面形成一層末端為雙鍵的單分子自組裝膜，在無水乙醇中漂洗 兩遍，氮氣吹干；(3)將上述所得基片放置在烘箱中，60°C下烘烤30min，使組裝更加牢固。實施例3熒光背景檢測將實施例1和實施例2中制備好的基因芯片基片插入掃描儀Gen印ix 4000B,采 用635nm波長檢測，在PMT為650，激光強(qiáng)度為100%的條件下對基片的全部點樣區(qū)域進(jìn)行 掃描，然后從掃描儀自帶軟件中讀取熒光背景值。結(jié)果表明，熒光背景值均小于70，說明熒 光背景很低，符合實驗要求。實施例4在基片載體上固定有末端雙鍵修飾的寡核苷酸(1)配置點樣液將1 μ mol的5’ -端帶有末端雙鍵且3’ -端帶有Cy5熒光基團(tuán)
修飾的寡核苷酸(結(jié)構(gòu)如式3所示)和0. 5% μ mol的Grubbs催化劑溶于DMSO中，配制成
寡核苷酸濃度為ImM的點樣液；
O
γν
、人Oh0^I n式 3
5' ^^V^0 ^O-TCAU ACU GUU GUC GGAGUU-O3'
。 其中，F(xiàn)代表Cy5熒光基團(tuán)。(2)用點樣儀吸取上述點樣液，在實施例1和實施例2制備好的基因芯片基片上設(shè)定的矩陣上點樣，點樣量為5nL，點樣后的基片在37°C相對濕度為75%的恒溫恒濕箱中避光固定12小時；(3)清洗，甩干，即制成基因芯片。其制備原理如圖2所示。實施例5固定效率檢測將實施例4中已固定好寡核苷酸的基因芯片插入掃描儀Gen印ix4000B，采用 635nm波長檢測，在PMT為650，激光強(qiáng)度為100 %的條件下對基片的全部點樣區(qū)域進(jìn)行掃 描，然后從掃描儀自帶軟件中讀取熒光信號強(qiáng)度Pl。將掃描后的基因芯片置于含0. 1 % SDS 的SSC溶液中漂洗lOmin，然后在去離子水中漂洗lOmin，氮氣吹干，然后掃描芯片，讀取熒 光信號強(qiáng)度P2。每個點樣點的固定率=P2/P1X100%結(jié)果表明單個點樣點的固定率均大于50%，平均固定率為57.6%。實施例6通過雜交反應(yīng)檢驗基因芯片的信號特性以實施例1中制備的基片作為載體，按照實施例4的步驟將細(xì)胞色素P450基因分 型寡核苷酸探針點樣與基片上。擴(kuò)增一份已知基因分型的DNA樣本得到雜交模板，取2uL 模板加到芯片的雜交區(qū)，加入雜交液(5XSSC)10uL，將芯片放到自動雜交洗滌儀的槽內(nèi)， 設(shè)定雜交穩(wěn)定為55°C，雜交lh，雜交后自動洗滌和風(fēng)干。將基因芯片插入掃描儀Ger^pix 4000B，采用635nm波長檢測，在PMT為650，激光強(qiáng)度為100%的條件下對基片的全部點樣 區(qū)域進(jìn)行掃描，采用分析軟件，將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成基因型別。結(jié)果分析得到的陽性雜交點和陰性 雜交點與樣本基因序列和基因型別符合，陽性探針點信號強(qiáng)，陰性點本底低，結(jié)合力和分辨 力都很好，能夠滿足微陣列芯片的制備和雜交反應(yīng)要求。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
一種乙烯基修飾的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片的基片載體表面上帶有末端含碳碳雙鍵的活性官能團(tuán)，其結(jié)構(gòu)如式1所示，式1其中，n為1-10的整數(shù)，m為大于1的整數(shù)。FSA00000133956500011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，制備所述基片載體的材料包括玻璃、 硅片、金、銀、鐵、鋅、銅、殼聚糖、葡聚糖、聚乙烯醇、纖維素、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙 烯、聚乳酸或聚丙烯酸酯。
3.制備權(quán)利要求1或2所述的基因芯片的方法，其特征在于，其包括步驟1)用乙醇將基片載體洗凈；2)采用分子自組裝技術(shù)將10-15mM的三乙氧基硅基烯組裝在羥基化或氨基化的基片 載體表面，形成一層末端為雙鍵的單分子自組裝膜，在無水乙醇中漂洗兩遍，氮氣吹干；3)將上述所得基片載體放置在烘箱中，50-120°C下烘烤30-60min，即得。
4.權(quán)利要求1或2所述的基因芯片在固定寡核苷酸中的應(yīng)用，其具體方法為1)將1當(dāng)量5’-端帶有末端雙鍵修飾的寡核苷酸和0.5% -1%當(dāng)量Grubbs催化劑溶 于DMS0中，配制成寡核苷酸濃度為ImM的點樣液；2)用點樣儀吸取上述點樣液，在基片上設(shè)定的矩陣上點樣，點樣量是5-20nL，點樣后 的基片放置在37°C相對濕度為75%的恒溫恒濕箱中避光固定8-12小時；3)清洗，甩干。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的5’-端帶有末端雙鍵修飾的寡核 苷酸，其3’ -端還帶有熒光基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)如式2所示，<formula>formula see original document page 2</formula>其中，n為1-10的整數(shù)，F(xiàn)代表熒光基團(tuán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種乙烯基修飾的基因芯片，該基因芯片的基片載體表面上帶有末端含碳碳雙鍵的活性官能團(tuán)，其結(jié)構(gòu)如式1所示，式1，其中，n為1-10的整數(shù)，m為大于1的整數(shù)。本發(fā)明還提供了該乙烯基修飾的基因芯片的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的乙烯基修飾的基因芯片適于固定末端有雙鍵修飾的寡核苷酸，結(jié)合強(qiáng)度大，固定效率高，熒光背景低。
文檔編號C12Q1/68GK101831503SQ20101018694
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者劉迎春, 高源 申請人:北京歐凱納斯科技有限公司