專利名稱：表達(dá)嗜熱子囊菌原變種chit-taa基因的畢赤酵母工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程，具體地說是一種表達(dá)嗜熱子囊菌原變種 Thermoascuaurantiacus var. aurantiacus ^Ii/^JLTMBSS1IS chit-taa W^1F^X 程菌株 Pichia pastoris GS-CHIT-TAA-176。
背景技術(shù)：
幾丁質(zhì)(chitin)是由N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖通過β ，4-糖苷鍵連接起來 的直鏈多聚物，結(jié)構(gòu)與纖維素類似，是最豐富的天然高分子化合物之一。幾丁質(zhì)酶可以水解 幾丁質(zhì)產(chǎn)生幾丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖，且廣泛存在于自然界的生物中，具有重要的生 理功能，在植物病蟲害的生物防治中發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)作用方式和酶解產(chǎn)物，將幾丁質(zhì)酶分為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶(endochitinase)、 N-乙酰-β-葡萄糖胺酶和幾丁二糖酶(chitbiosidase)。內(nèi)切幾丁質(zhì)酶從幾丁質(zhì)鏈的 任一部位切割，產(chǎn)生幾丁質(zhì)寡聚糖，如Glu (NAG)2、Glu(NAG)3等；N-乙酰β -葡萄糖胺酶 又稱外切酶(exochitinase)，此酶從幾丁質(zhì)寡糖或幾丁質(zhì)鏈的非還原末端依次切下N-乙 酰-β-葡萄糖幾丁單糖；幾丁二糖酶則是專一的將幾丁二糖降解為幾丁單糖。這三種酶可 以用紙層析加以區(qū)分，SDS-PAGE技術(shù)則可加以有效的鑒定。另外每一種酶都有一系列同工 酶。幾丁質(zhì)酶廣泛應(yīng)用于輕工、醫(yī)藥、環(huán)保、食品加工、可再生資源的綜合利用等方面， 被認(rèn)為是最有應(yīng)用潛力的酶制劑之一。目前國內(nèi)外幾丁質(zhì)素酶主要由常溫木霉生產(chǎn)，但存 在菌種產(chǎn)酶量低、活力低、酶穩(wěn)定性差及成本高等問題，使其幾丁質(zhì)酶的生產(chǎn)和應(yīng)用受到很 大限制。由于熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶在高溫條件下的熱穩(wěn)定，因此具有重要應(yīng)用前景和商業(yè)價值。^^^MMW.7^^ (Thermoascus aurantiacus var aurantiacus)
質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基中50°C條件下可以產(chǎn)生熱穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶，但要使之用于規(guī)模化工 業(yè)生產(chǎn)，還存在一些尚未解決的問題。如嗜熱子囊菌原變種培養(yǎng)條件比較苛刻，高溫發(fā)酵需 要特殊設(shè)備，產(chǎn)酶效率低，造成成本增加，因此限制了它的應(yīng)用。解決這一問題的有效途徑 是應(yīng)用分子生物學(xué)手段，將嗜熱子囊菌原變種熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶基因?qū)氤亟湍钢懈咝П?達(dá)，利用酵母生長快、易于培養(yǎng)等特點，使熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶基因在常溫和短時間內(nèi)快速、大 量表達(dá)，期望達(dá)到降低能耗和提高經(jīng)濟效益的目的。

發(fā)明內(nèi)容
H明以Hf禾中(Thermoascus aurantiacus var aurantiacus)為 材料獲得一種幾丁質(zhì)酶基因，命名為chit-taa，在Genbank中的登錄號為⑶338053，全長 cDNA為1385bp，包含一個由1188個核苷酸構(gòu)成的開放閱讀框，編碼396個氨基酸。將此氨 基酸序列在國際基因庫中進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)該幾丁質(zhì)酶屬于糖苷水解酶18家族，包含兩個區(qū) 域S-X-G-G和D-X-D-X-E高度保守。
構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pPIC9K/chit-taa，利用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化 Pichiapastoris GS115，在MD和匪培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)PCR鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，G418篩 選多拷貝轉(zhuǎn)化子，然后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，獲得畢赤酵母工程菌株GS-CHIT-TAA-176。該 工程菌株接種于含BMGY培養(yǎng)基中，在28°C 200rpm/min搖床培養(yǎng)6d后，幾丁質(zhì)酶活達(dá)到 28. 96U/mg, SDS-PAGE檢測該蛋白的分子量為43. 9kDa，酶在60°C保溫60min，仍有67. 7% 的活性，具有一定的熱穩(wěn)定性，有重要的經(jīng)濟價值和社會價值。


圖1幾丁質(zhì)酶基因chit-taa PCR產(chǎn)物電泳圖譜泳道1 :Marker-DL2000泳道2 :cDNA(0RF)圖 2 幾丁質(zhì)酶 CHIT-TAA 的 SDS-PAGE 分析泳道M 低分子量蛋白Marker泳道1-7 酵母工程菌Pichia pastoris GS-CHIT-TAA-176的誘導(dǎo)1-7天的表達(dá) 情況圖3重組幾丁質(zhì)酶CHIT-TAA的純化泳道1 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)泳道2 純化的重組幾丁質(zhì)酶CHIT-TAA
具體實施例方式實施例1 嗜熱子囊菌原變種(T. aurantiacus var aurantiacus)的分離鑒定(1)標(biāo)本采集從堆肥中采集。(2)分離培養(yǎng)將采集標(biāo)本取0. 5克放置在PDA平板上50°C培養(yǎng)3天后，進(jìn)行分離 純化。操作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻(xiàn)。(3)鑒定參考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文獻(xiàn)。實施例2 幾丁質(zhì)酶基因chit-taa的克隆(1)嗜熱子囊菌原變種總RNA的提取參照Trizol試劑盒說明。(2) cDNA 第一條鏈的合成按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3. O 試劑盒說明書進(jìn)行取1 2 μ g總RNA，加RNase Free ddH20至9. 5 μ L，將RNA樣品在 75°C變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各 種成分IOmmol/L dNTP Mixture 2 μ L，10 X RTBuffer (Mg2+) 2 μ L, 25mmol/L MgCl24 μ L, Oligo d(T)-Adaptor Primer 1 μ L,RNaseInhibiter 0. 5 μ L,AMV Reverse Transcriptase 1 μ L (Final Volume 20 μ L)，將反應(yīng)液混合后，室溫下放lOmin，然后42°C溫育60min，再煮 沸5min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。加入180 μ L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 μ L，混勻，稍微離心， 保存于_20°C，備用。(3)中間片段的分離根據(jù)幾丁質(zhì)酶的同源保守序列設(shè)計兼并引物。上游引物為 5，-TAYTTYGTCAAYTGGGCMAT-3，，下游引物為5，-CRGCRTARTCRTARGCCAT-3，(4)3’和5’序列的分離幾丁質(zhì)酶基因5’端序列克隆，使用Tail-PCR的方法，根 據(jù)中間前面得到片段設(shè)計3個向外的特異巢式引物，以及通過巢式引物以及上游公共兼并引物ADp5擴增得到。P5-41 :5，-GTTTCTCGGCTGGCAGGTCTTGAG-3，P5-103 :5’ -GGTCAAGTATCTTCGCCGTTGTC-3，P5-290 :5’ -CCCGTCCAGCTTCAGTACTC-3’AD1:5， -NTCGASTWTSGWGTT-3，AD2 :5，-NGTCGASWGANAWGAA-3‘AD3 :5，-WGTGNAGffANCANAGA-3‘AD4 :5，-TGWGNAGSANCASAGA-3‘AD5 :5，-AGffGNAGffANCAffAGG-3‘幾丁質(zhì)酶基因3，端序列克隆，按照 TaKaRa RNAPCR kit (AMV) Ver3. 0 (TaKaRa)和 3，RACE Kit, 2nd Genneration (Roche Applied Science)使用說明進(jìn)行。3，RACE 的上游 引物序列為5， -GTCTTGATGGGCTGGAT-3，5， -GACACGGACAAGCACTATC-3，下游引物為M13M4 :GTTTTCCCAGTCACGAC。(5)基因克隆取0. 5 μ 1 PCR回收產(chǎn)物與pMD18_T載體進(jìn)行連接，操作步驟按照 TaKaRa公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，在表面涂有X_gal 和IPTG的含氨卞青霉素(100yg/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培
養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。(6)質(zhì)粒DNA的提取堿法提取質(zhì)粒DNA。(7)序列測定DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進(jìn)行，序 列引物為M13啟動子引物。嗜熱子囊菌原變種chit-taa全長的cDNA為1385bp。開放閱讀 框部分為1188bp，編碼396個氨基酸的一段序列，將此氨基酸序列在國際基因庫中進(jìn)行檢 索，發(fā)現(xiàn)屬于糖苷水解酶第18家族，其中2個基序S-X-G-G和D-X-D-X-E具保守性。該序
列如下
(A)SEQ ID NO1的信息
(a)序列特征*長度1385堿基對；*類型核酸；*鏈型雙鏈；*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b)分子類型rcDNA
(C)假設(shè)否
(d)反義否
(e)最初來源BiH^ii^lifHi^ft (Thermoascus aurantiacus var. aurantiacus)
(f)序列描述
1CTGCAAAAGA GATCATCTGG GATGAAATCT GTGGTTTATT TTGTAAATTG GGCAATCTAC
61GGCCGCAACC ACCACCCTCA AGACCTGCCA GCCGAGAAAC TTACTCACGT TCTCTACGCC
121TTTGCCAATG TCCGTCCGGA CAACGGCGAA GTATACTTGA CCGACCCATG GTCCGACACG
181GACAAGCACT ATCCCAGCGA TTCATGGAAC GACGTCGGCA CCAATGTCTA CGGGTGCATC
241AAGCAGCTGT TCCTGCTCAA GAAGCGCAAC AGGAATCTGA AAGTGCTCCT GTCMTTGGT
301GGCTGGACGT ACTCATCAAA TTTTGCCCAA CCGGCGAGTA CTGAAGCTGG ACGGGCCAGG
361TTCGCGGAGA CTGCTGTGCA GTTGCTTCTT GATCTGGGTC TTGATGGGCT GGATGTTGAT
(4) PCR 反應(yīng)(25yL):cDNA 2 μ L, IOXBuffer 2. 5 μ L, 10mmol/L dNTP 2 μ L, 25mmol/L MgCl2 2 μ L，上、下游弓 | 物各 1 μ L，Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ L (5U/ μ L)，ddH20 14 μ L。反應(yīng)條件為 94°C 3min 預(yù)變性；94°C lmin，57°C lmin，72°C 3min，共 30 個循環(huán)， 72°C 延伸 10min，10°C 保存。(5)基因克隆取0.5yL PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒 pMDIS-T/chit-taa，操作步驟按TaKaRa公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。然后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α，在涂有X-gal和IPTG的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基中培 養(yǎng)過夜。 (6)質(zhì)粒DNA提取堿法提取質(zhì)粒DNA。(7)用EcoR I和Not I對重組質(zhì)粒pMD18-T/chit_taa產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，同時用 EcoR I和Not I雙酶切酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K，DNA膠回收試劑盒回收純化chit_taa基因 及載體pPIC9K片斷。然后進(jìn)行體外連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K/chit-taa，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大 腸桿菌JM109，在含Amp的LB轉(zhuǎn)化平板上挑選單菌落，提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR和酶切鑒定， 測序確認(rèn)重組質(zhì)粒的讀碼框正確。實施例4 表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因chit-taa的酵母工程菌株的構(gòu)建及篩選(1)重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/chit-taa用限制性內(nèi)切酶 Sac I線性化。(2)轉(zhuǎn)化電擊轉(zhuǎn)化酵母菌株P(guān)ichia pastoris GSl 15酵母感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法 參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。(3)篩選用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化子對應(yīng)點種在匪和MD平板上，30°C培養(yǎng)2_4d， 挑取在MD/MM平板上均生長良好的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。挑取陽性轉(zhuǎn)化子分別點種于 1. 00mg/mL, 2. 00mg/mL, 3. 00mg/mL, 4. 00mg/mL G418 的 YPD 平板上篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子。實施例5 畢赤酵母Pichiapastoris GSl 15的誘導(dǎo)表達(dá)和活性檢測(1)將陽性轉(zhuǎn)化子接種于含25mL BMGY培養(yǎng)基中，28 °C 200rpm/min搖床培養(yǎng) 24h(OD600達(dá)2-6)，離心收集菌體，將細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的BMMY培養(yǎng)基中，至0D_值為 1. 0，28°C 200rpm/min繼續(xù)培養(yǎng)，每12h補充甲醇至終濃度為1 %，每24h取樣，室溫10，OOOg 離心5min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。(2)酶活性檢測酶活性測定采用DNS法，蛋白含量測定采用Bradford法。(3)重組幾丁質(zhì)酶CHIT-TAA的最適反應(yīng)溫度、pH及熱穩(wěn)定性誘導(dǎo)表達(dá)的重組幾 丁質(zhì)酶經(jīng)過DEAE-Si^pharose陰離子交換柱層析，獲得電泳均一的純化蛋白，用純化的重組 幾丁質(zhì)酶測定其性質(zhì)。在不同溫度和PH條件下分別測定重組幾丁質(zhì)酶的酶活力，將最高的 酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下幾丁質(zhì)酶的相對酶活性；將幾丁質(zhì)酶在不 同的溫度下保溫不同的時間(lOmin，20min, 30min, 40min, 50min, 60min)后，檢測剩余酶活 力。實施例6 表達(dá)chit-taa基因的畢赤酵母工程菌株GS-CHIT-TAA-176的保藏表達(dá)chit-taa基因的畢赤酵母工程菌株GS-CHIT-TAA-176的保藏單位中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院 微生物研究所；保藏日期2010年5月10日；酵母工程菌株編號為=CGMCC No. 3820 ；畢赤 酵母工程菌株的分類命名為巴氏畢赤酵母Pichia pastoris。
權(quán)利要求
一種表達(dá)嗜熱子囊菌原變種(Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus)幾丁質(zhì)酶基因chit taa的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT PCR及RACE等方法從嗜熱子囊菌原變種(Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus)獲得熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶基因chit taa，將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，獲得表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9K/chit taa，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，從中篩選出表達(dá)熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶基因chit taa的畢赤酵母工程菌株GS CHIT TAA 176。
全文摘要
本發(fā)明是一種表達(dá)嗜熱子囊菌原變種(Thermoascus aurantiacus var.aurantiacus)熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶基因chit-taa的畢赤酵母工程菌GS-CHIT-TAA-176。通過RT-PCR及RACE等方法從嗜熱子囊菌原變種中獲得幾丁質(zhì)酶基因chit-taa，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K/chit-taa，并導(dǎo)入畢赤酵母GS115，從中篩選出一種表達(dá)幾丁質(zhì)酶的酵母工程菌GS-CHIT-TAA-176。該工程菌幾丁質(zhì)酶的酶活性可達(dá)28.96U/mg，在50℃穩(wěn)定，60℃保溫60min仍有70.3％的活性，熱穩(wěn)定性高，用于轉(zhuǎn)化環(huán)境中的幾丁質(zhì)廢料及其它工業(yè)領(lǐng)域，具有經(jīng)濟價值和社會價值。
文檔編號C12R1/84GK101962621SQ201010186688
公開日2011年2月2日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者張婕, 李多川, 謝晨, 郭曉紅 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)