專利名稱：一種毛栓菌及其固定化方法和應(yīng)用的制作方法
一種毛栓菌及其固定化方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程及廢水處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株毛栓菌及其固定化方 法和在印染廢水與造紙廢水脫色中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氣候變暖和環(huán)境污染是當今世界人類面臨的最主要問題。據(jù)報道，全世界每年生 產(chǎn)的染料有100，000種，700，000噸，中國每年生產(chǎn)的染料達150，000噸，而印染和造紙行業(yè) 在染料的使用過程中有10% 15%的染料會隨水排放，中國每年大約有15，000 22，500 噸的印染和造紙等廢水排出，印染和造紙廢水已成為自然水體生態(tài)系統(tǒng)中最重要的污染源之一。印染和造紙廢水具有色度高、COD高、鹽度高和毒性大等特點。目前多采用化學法 (如化學混凝法、濕式空氣氧化法、光催化氧化法等)、物理法(如吸附法、膜分離等)、生 化法和電化學法等進行印染和造紙廢水處理，但許多方法單獨處理印染和造紙廢水往往不 能達到廢水排放標準，且處理費用較高，有些方法甚至存在二次污染的風險。因此，利用生 物技術(shù)來進行印染和造紙廢水的處理逐漸受到人們的關(guān)注，然而，由于印染和造紙廢水的 特殊性，使得一般微生物無法或很難在這類廢水中生長繁殖和發(fā)揮降解作用，這也是目前 常規(guī)生物處理技術(shù)(如活性污泥法、生物膜法)處理印染和造紙廢水效率低下的根本原因 之一。有證明表明，好氧細菌在厭氧條件下脫色因偶氮還原酶對底物的專一性較低，Km值 較高，無法徹底降解染料，且處理后的水中含有大量的毒性和致癌中間產(chǎn)物，如芳香胺化合 物等，嚴重制約了其在印染和造紙廢水處理中的應(yīng)用。70年代從腐爛的木材中得到的能降解木質(zhì)素的擔子菌——白腐真菌，因其細胞外 降解能力較強，已成為印染廢水脫色降解的理想菌種。本專利使用的毛栓菌屬于白腐真菌 的一種，對染料降解譜較寬，不需經(jīng)過特定污染物的預(yù)處理，培養(yǎng)條件簡單，抗逆性強，環(huán)境 適應(yīng)性好，是一株處理印染和造紙廢水的理想菌種。白腐真菌為好氧真菌，在脫色反應(yīng)器中需要考慮氧氣因素。目前解決白腐真菌好 氧培養(yǎng)主要通過兩條途徑，一是通過攪拌或通入空氣而實現(xiàn)，但因白腐真菌對剪切力十分 敏感，攪拌處理對其脫色活性影響很大，嚴重限制了其大規(guī)模應(yīng)用。二是多采用固定化技 術(shù)，增強真菌的耐受能力，提高脫色效率。目前使用的固定化載體主要為瓊脂，海藻酸鈣，角 叉菜膠，鋼絲網(wǎng)，高分子材料等惰性材料，脫色效果較好，但都存在載體需要提前合成、成本 較高和回收處理困難等問題。為此，本發(fā)明提供用天然材料為載體的白腐真菌固定化方法 及其在印染廢水脫色中的應(yīng)用技術(shù)，為生產(chǎn)環(huán)保型生物脫色劑及其在印染廢水、造紙廢水 等工業(yè)廢水處理過程中的應(yīng)用提供關(guān)鍵材料和技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是提供一種具有高效、廣譜脫色活性的毛栓菌(Fimgalia sp.)DD616菌株及其固定化方法與在印染和造紙廢水脫色中的應(yīng)用。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案
1、一種毛栓菌(Fungalia sp. )DD616的分離及鑒定將含有濃度為0. 3mg/ml橙G的PDA平板暴露于空氣中30min，然后于28°C恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察脫色圈的發(fā)生，并從脫色圈中挑出菌絲；該菌種在PDA平板上初生菌絲 白色，隨著時間的延長菌絲變黃。對該菌株染色體DNA中核糖體基因內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列 的PCR擴增和測序分析，將該菌株鑒定為毛栓菌(Fungalia sp.)，菌株編號為DD616，該菌 株已于2010年4月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCC No. 3680。2、一種毛栓菌的固定化方法將玉米芯、稻草秸稈、小麥秸稈、蘆葦葉等粉碎，稱量0. 5 5. Og裝入250ml錐形 瓶中，再向瓶中加入5 15ml水和0. 5 5. 0%的葡萄糖，121°C高壓滅菌30min后，接入 在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天的毛栓菌DD616菌株的菌餅3 8塊，菌餅直徑為0. 7cm, 28°C 30°C搖床培養(yǎng)培養(yǎng)3 7天，使真菌在載體上生長，去除培養(yǎng)液，即為毛栓菌DD606菌株的 固定化。3、一種固定化的毛栓菌在印染和造紙廢水脫色中的應(yīng)用將固定化毛栓菌DD616菌株按干重的10 40g/L接種到三角瓶中，分別加入濃 度為0. 5 1. Og/L的活性藍K-GC、活性翠藍KN-G、活性紅紫X-2R、分散橙S-4SL、分散藍 2BLN、橙K-GN、活性紅K-2BP、活性X黃K-6G、粉碎大紅S-R、橙G等，28C搖床培養(yǎng)2d，脫色 率高達40 99%。用該固定化的毛栓菌DD616菌株對橙G進行連續(xù)脫色，每3d排出脫色 液，繼續(xù)加入含有相同濃度和含量的橙G，依次循環(huán)，共可脫色6批(18d)，并保持每批脫色 率為98%，之后脫色率有所降低。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比其有益效果是首先，毛栓菌DD616菌株具有較寬的脫色 譜和較強的脫色能力，對橙G可連續(xù)脫色18d而保持98%的脫色率；其次，本發(fā)明采用的 固定化載體為常見的農(nóng)業(yè)廢棄物，環(huán)境友好，無污染，而且可以對毛栓菌提供一定的營養(yǎng)物 質(zhì)；第三，本發(fā)明的固定化過程簡單，毛栓菌可在這些天然廢棄物上直接生長，不需要合成 載體的復(fù)雜操作；因此，固定化毛栓菌應(yīng)用于造紙廢水處理、印染廢水處理和服裝行業(yè)等廢 水脫色處理等，具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景。
四

圖1.固定化毛栓菌的脫色譜圖2.固定化毛栓菌的脫色持續(xù)時間圖3.固定化毛栓菌對不同濃度染料的脫色效率
五、具體實施方案實施例1、毛栓菌的分離與鑒定將含有濃度為0. 3mg/ml橙G的PDA平板暴露于空氣中30min，然后于28°C恒溫培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察脫色圈的發(fā)生，并從脫色圈中挑出菌絲；該菌種在PDA平板上初生菌絲白 色，隨著時間的延長菌絲變黃。對該菌株染色體DNA中核糖體基因內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的 PCR擴增和測序分析，將該菌株鑒定為毛栓菌(Fungalia sp.)，菌株編號為DD616，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 3680。(I)DNA提取將DD616菌株在新鮮的PDA培養(yǎng)基上活化后轉(zhuǎn)接到搖瓶中，震蕩 培養(yǎng)3d后，過濾收集菌絲體，用無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干殘余水分。將菌絲體置于 研缽中，加入石英砂和ImL高鹽緩沖液充分研磨。將研磨好的勻漿置于印pendorf管中， IOOOOrpm離心lOmin，收集上清液，而后加入等體積的氯仿_異戊醇抽提，IOOOOrpm離心 IOmin移取上清，重復(fù)用氯仿-異戊醇抽提并離心，而后用70%乙醇沉淀，溶于適量的TE溶 液中得到總提取溶液。(2)PCR擴增針對真核微生物核糖體基因內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列設(shè)計特異性 引物 ITSl 和 ITS4 (White 等 1990)，ITSl 為:5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，，ITS4 為 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR 反應(yīng)的混合液的總體積為 50 μ L，包括1 XPCR buffer, MgCl2 3mM, 4 種 dNTP 各 200mM,上下游引物各 0. 3 μ M, Taq 酶 2. 0U, DNA 模板 2 μ L。 將反應(yīng)體系放于PCR儀上，反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性，然后進入循環(huán)，94°C變性lmin，55°C 復(fù)性45s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)，最后72°C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ L擴增產(chǎn) 物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外檢測。同時設(shè)置不含模板DNA的陰性對照。(3)PCR產(chǎn)物序列測定PCR產(chǎn)物以ITSl為測序引物，送南京基天生物科技有限公 司測序，經(jīng)與Genbank數(shù)據(jù)庫的序列進行同源性比對分析，鑒定該菌為毛栓菌(Fimgalia sp.) ο實施例2、毛栓菌的固定化方法將玉米芯、稻草秸稈、小麥秸稈、蘆葦葉等粉碎，稱量0. 5 5. Og裝入250ml錐形 瓶中，再向瓶中加入5 15ml水和0. 5 5. 0%的葡萄糖，121°C高壓滅菌30min后，接入在 PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天的毛栓菌DD616菌株的菌餅3_8塊，菌餅直徑為0. 7cm, 28°C 30°C 搖床培養(yǎng)培養(yǎng)3 7天，使真菌在載體上生長，去除培養(yǎng)液，即為毛栓菌的固定化；(1)不同天然載體的脫色效率用玉米芯、稻草秸稈、蘆葦葉和小麥秸稈為載體， 以橙G染料為脫色對象，固定化毛栓菌DD616菌株兩天的脫色效率分別為99%、99%、90% 和 80%。(2)固定時間與脫色的關(guān)系用玉米芯為載體，以橙G染料為脫色對象，檢測固定 化時間與脫色的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)固定化5d后脫色效果最好，對橙G的脫色率為99%。(3)糖對固定化的作用在毛栓菌DD616菌株固定化過程中加入不同濃度的葡萄 糖(1 10g/ml)，發(fā)現(xiàn)添加0. 1 3. Og/L的葡萄糖，有利于固定化毛栓菌DD616菌株對橙 G的脫色效率，處理2天的脫色率在90%以上。實施例3、毛栓菌固定化后對印染和造紙廢水脫色中的應(yīng)用(1)脫色譜將固定化毛栓菌DD616菌株按干重的30g/L接種到三角瓶中，分別 加入濃度為1. Og/L的活性藍K-GC、活性翠藍KN-G、活性紅紫X-2R、分散橙S-4SL、分散藍 2BLN、橙K-GN、活性紅K-2BP、活性X黃K-6G、粉碎大紅S-R，28C搖床培養(yǎng)2d，脫色率高達 40 99% (圖1)，顯示了很好的廣譜性。(2)連續(xù)脫色效率用固定化的毛栓菌DD616菌株對橙G進行連續(xù)脫色，每3d排 出脫色液，繼續(xù)加入含有相同濃度和含量的橙G，依次循環(huán)，橙G濃度為0. 6g/L ；連續(xù)脫色6 批，共18d，脫色率> 98%，第7批(21d)降至73. 8% (圖2)。(3)對不同染料濃度的脫色效率用固定化的毛栓菌DD616菌株處理不同濃度的橙G(1 10g/ml)，28°C搖床培養(yǎng)培養(yǎng)2d，檢測其脫色率。脫色結(jié)果見圖3。以lg/ml濃度 脫色率最高。
權(quán)利要求
一種毛栓菌(Fungalia sp.)DD616菌株，其特征是將含有濃度為0.3mg/ml橙G的PDA平板暴露于空氣中30min，然后于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)獲得，并鑒定為毛栓菌(Fungalia sp.)，菌株編號為DD616，該菌株已于2010年4月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.3680。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛栓菌DD616菌株的天然載體固定化方法，其特征是將玉米 芯或稻草秸稈或小麥秸稈或蘆葦葉粉碎，稱量0. 5 5. Og裝入250ml錐形瓶中，再向瓶中 加入5 15ml水和0. 5 5. 0%的葡萄糖，121 °C高壓滅菌30min后，接入在PDA培養(yǎng)基上 培養(yǎng)5天的毛栓菌DD616菌株的菌餅3 8塊，菌餅直徑為0. 7cm, 28°C搖床培養(yǎng)3 7天， 使真菌在載體上生長，去除培養(yǎng)液，即為毛栓菌DD606菌株的固定化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛栓菌DD616菌株的天然載體固定化及其在印染廢水和造紙 廢水脫色中的應(yīng)用方法，其特征是固定化的毛栓菌DD616菌株可用于多種染料的脫色；在 含固定化毛栓菌DD616菌株的三角瓶中分別加入濃度為0. 5 1. Og/L的活性藍K-GC或活 性翠藍KN-G或活性紅紫X-2R或分散橙S-4SL或分散藍2BLN或橙K-GN或活性紅K-2BP或 活性X黃K-6G或粉碎大紅S-R或橙G，28C搖床培養(yǎng)2d，脫色率達40 90%。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物工程及廢水處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種毛栓菌(Fungaliasp.DD616)及其固定化方法和在印染與造紙廢水脫色中的應(yīng)用。該菌株保藏號為CGMCC No.3680；該菌株用玉米芯、小麥秸稈、水稻秸稈、蘆葦葉天然載體進行固定化處理；該菌固定化處理后可用于造紙和印染廢水等的脫色。
文檔編號C12R1/645GK101962619SQ20101018638
公開日2011年2月2日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者劉常宏, 王兆強, 胡楊, 薛雅蓉 申請人:南京大學