一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法。包括將干黃姜原料粉碎、加水浸泡、酶解去雜質(zhì)、提取薯蕷皂苷、固定化酶制劑組合物水解薯蕷皂苷為薯蕷皂素、航空煤油提取、成品，本發(fā)明利用固定化酶技術(shù)，將市售價(jià)格昂貴的鼠李糖苷酶和β?葡萄糖苷酶成功的應(yīng)用于附加值較低的工業(yè)產(chǎn)品。本發(fā)明利用生物方法替代傳統(tǒng)酸解薯蕷皂苷顯著降低環(huán)境污染，本發(fā)明方法反應(yīng)條件溫和，成本低。
【專利說(shuō)明】
-種固定化酶的制備及水解善敲皂素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種固定化酶的制備及水解馨葫皂素的方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 馨葫皂素，是一種白色或微黃色結(jié)晶性粉末，被醫(yī)藥界稱為"藥用黃金"，藥用價(jià)值 非常重要和廣闊。我國(guó)的馨葫皂素是世界上穩(wěn)定增長(zhǎng)而且緊缺的激素類原料，在世界醬體 醫(yī)藥原料歷史中，我國(guó)的馨葫皂素一直處于主導(dǎo)和壟斷的地位，占領(lǐng)全世界醬體醫(yī)藥原料 的97%市場(chǎng)份額。其他發(fā)達(dá)國(guó)家?guī)资陙?lái)雖然致力于尋找和制作替代品，但是由于先天氣 候地理?xiàng)l件和原材料的缺陷，導(dǎo)致替代品造價(jià)高昂，產(chǎn)品利用率低等缺點(diǎn)，W至于全世界的 發(fā)達(dá)國(guó)家?guī)资陙?lái)被迫只能依賴中國(guó)進(jìn)口。從黃姜中提取的皂素是醫(yī)藥工業(yè)合成激素的重 要基始原料，W其為基礎(chǔ)可合成加工如雙締、沃氏氧化物等中間體原料藥產(chǎn)品和黃體酬、醋 酸強(qiáng)的松、布地奈德、醋酸潑尼松、甲基睪丸素、環(huán)丙孕酬、米司酬、雄締工酬、倍地米松、去 氨表雄酬等激素類系列產(chǎn)品。運(yùn)些藥物用途極為廣泛，是世界僅次于抗生素類的第二大類 藥物。
[0003] 但馨葫皂素的加工過(guò)程需要采用大量的鹽酸對(duì)黃姜中的馨葫皂巧進(jìn)行高溫加壓 水解，水解的過(guò)程中可將黃姜中的淀粉，纖維之類的物質(zhì)部分或全部水解，產(chǎn)生的糖液及剩 余的酸對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，反應(yīng)條件溫和，生產(chǎn)成本 低的方法。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:包括W下步驟：
[0006] (1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過(guò)20目篩，加入到300kg~500kg中，將生料淀粉酶、 普魯蘭酶、真菌Q-淀粉酶加入上述溶液中酶解；
[0007] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[000引（3)將步驟(2)進(jìn)行固液分離，固體用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0009] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[0010] 將高分子化合物載體加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為10°C的條件下攬拌， 使其溶解;然后加入與高分子化合物載體質(zhì)量比為1:30~1:60的酶，攬拌均勻，置于1(TC的 恒溫?fù)u床上，震蕩化；將上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C條件下靜置 lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水分，收 集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0011] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進(jìn)行酶解， 產(chǎn)生馨葫皂素粗品；
[0012] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進(jìn)行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[0013] 其中：步驟(1)所述的每毫升生料淀粉酶的活力為10000~20000IU，每毫升普魯蘭 酶的活力為1000~5000IU，每毫升真菌a-淀粉酶的活力為50000~100000IU;
[0014] 步驟(4)所述高分子化合物載體殼聚糖，W及殼聚糖與非極性大孔樹脂、聚丙締酷 胺中的一種或幾種的混合物；
[0015] 步驟(4)所述每毫升所述固定化酶制劑組合物中，0-葡萄糖巧酶的活力為8000~ 12000IU，鼠李糖巧酶的活力為2000~5000IU;
[0016] 步驟(5)所述馨葫皂素粗品是指馨葫皂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量在50% W下；
[0017] 本發(fā)明中生料淀粉酶購(gòu)自美國(guó)杜邦公司，普魯蘭酶、真菌a-淀粉酶、鼠李糖巧酶、 e-葡萄糖巧酶均為寧夏乙征生物工程有限公司自產(chǎn)，其他試劑均為市售。
[0018] 本發(fā)明達(dá)到的有益效果：
[0019] 1、本發(fā)明中用生料淀粉酶替代傳統(tǒng)酸解或者酶解去除淀粉的益處在于:替代酸解 可W減少環(huán)境污染，反應(yīng)條件溫和，成本低;傳統(tǒng)酶解是淀粉必須經(jīng)過(guò)糊化才能進(jìn)行液化糖 化，而本發(fā)明專利應(yīng)用的生料淀粉酶直接可水解生淀粉，淀粉不需要糊化過(guò)程，并且添加量 少，淀粉液化效果好，可明顯節(jié)約能源和降低生產(chǎn)成本。
[0020] 2、本發(fā)明中用普魯蘭酶和真菌a-淀粉酶可水解生料淀粉酶不能水解的支鏈淀粉， 使淀粉水解徹底，運(yùn)樣馨葫皂巧才能徹底從淀粉的包裹中釋放出來(lái)，提高馨葫皂巧的提取 率。
[0021] 3、用固定化的0-葡萄糖巧酶和鼠李糖巧酶替代酸水解，直接將馨葫皂巧水解為馨 葫皂素，反應(yīng)條件溫和，固定化酶可W反復(fù)利用，節(jié)約成本，提高轉(zhuǎn)化率。
[0022] 4、我們驚奇的發(fā)現(xiàn)，用殼聚糖做酶的固定化載體，一方面殼聚糖對(duì)酶活有非常好 的保護(hù)作用；另一方面，殼聚糖可W作為抑菌劑，在整個(gè)馨葫皂巧水解過(guò)程中可W起到非常 好的抑菌作用，防止雜菌污染產(chǎn)生其他物質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】：
[0023] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí) 施方式做詳細(xì)的說(shuō)明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)W便于充分理解本發(fā)明。但是 本發(fā)明能夠W很多不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W在不違背本發(fā) 明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。
[0024] (1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過(guò)20目篩，加入到300kg~500kg中，將生料淀粉酶、 普魯蘭酶、真菌Q-淀粉酶加入上述溶液中酶解；
[0025] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0026] (3)將步驟(2)進(jìn)行固液分離，固體用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0027] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[00%]將高分子化合物載體加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為10°C的條件下攬拌， 使其溶解;然后加入與高分子化合物載體質(zhì)量比為1:30~1:60的酶，攬拌均勻，置于1(TC的 恒溫?fù)u床上，震蕩化；將上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C條件下靜置 lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水分，收 集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0029] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進(jìn)行酶解， 產(chǎn)生馨葫皂素粗品；
[0030] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進(jìn)行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[0031 ]表1本發(fā)明方法與普通提取方法對(duì)比
[0032]
[0033] 應(yīng)用結(jié)果表明：應(yīng)用本發(fā)明方法后，馨葫皂巧收率與目前正常生產(chǎn)工藝相比平均 提高9%;馨葫皂素收率于目前正常生產(chǎn)工藝相比提高8.9%;純度與正常工藝相比提高 2% ;溶解度提高3%，說(shuō)明皂素的純度和收率都有比較明顯的提高。
[0034] 實(shí)施例1
[00巧](1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過(guò)20目篩，加入到300kg中，將生料淀粉酶20000IU、 普魯蘭酶1000IU、真菌a-淀粉酶100000IU加入上述溶液中酶解；
[0036] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解2地；
[0037] (3)將步驟(2)進(jìn)行固液分離，固體用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0038] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[0039] 將殼聚糖加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為10°C的條件下攬拌，使其溶解;然 后加入與殼聚糖質(zhì)量比為1:30的0-葡萄糖巧酶12000IU和鼠李糖巧酶2000IU，攬拌均勻，置 于l〇°C的恒溫?fù)u床上，震蕩化;將上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C條件 下靜置lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水 分，收集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0040] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進(jìn)行酶解， 產(chǎn)生馨葫皂素粗品；
[0041] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進(jìn)行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] (1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過(guò)20目篩，加入到300kg中，將生料淀粉酶10000IU、 普魯蘭酶5000IU、真菌a-淀粉酶50000IU加入上述溶液中酶解；
[0044] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0045] (3)將步驟(2)進(jìn)行固液分離，固體用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0046] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[0047] 將殼聚糖與非極性大孔樹脂Wl: 1混合后加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為 l〇°C的條件下攬拌，使其溶解;然后加入與殼聚糖質(zhì)量比為1:40的0-葡萄糖巧酶8000IU和 鼠李糖巧酶5000IU，攬拌均勻，置于10°C的恒溫?fù)u床上，震蕩化；將上述混合液逐滴滴入 3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C條件下靜置lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用 0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水分，收集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0048] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進(jìn)行酶解， 產(chǎn)生馨葫皂素粗品；
[0049] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進(jìn)行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[00加]實(shí)施例3
[0051 ] (1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過(guò)20目篩，加入到300kg中，將生料淀粉酶16000IU、 普魯蘭酶2000IU、真菌a-淀粉酶90000IU加入上述溶液中酶解；
[0052] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0053] (3)將步驟(2)進(jìn)行固液分離，固體用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0054] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[0055] 將殼聚糖、非極性大孔樹脂聚丙締酷胺Wl :1:1混合后加水配制成2g/L濃度的溶 液，在溫度為l〇°C的條件下攬拌，使其溶解;然后加入與殼聚糖質(zhì)量比為1:50的0-葡萄糖巧 酶10000IU和鼠李糖巧酶3000IU，攬拌均勻，置于1 (TC的恒溫?fù)u床上，震蕩化;將上述混合液 逐滴滴入3mol/L的氯化巧溶液中，在2°C條件下靜置lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球， 并用0.4mol/L的葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水分，收集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0056] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進(jìn)行酶解， 產(chǎn)生馨葫皂素粗品；
[0057] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進(jìn)行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[0化引實(shí)施例4
[0059] (1)將IOOkg干黃姜原料粉碎，過(guò)20目篩，加入到300kg中，將生料淀粉酶15000IU、 普魯蘭酶3000IU、真菌a-淀粉酶70000IU加入上述溶液中酶解；
[0060] (2)將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h;
[0061] (3)將步驟(2)進(jìn)行固液分離，固體用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇I(K)L提取馨葫皂巧， 提取3次，每次30min，液體可用于制造酒精；
[0062] (4)制備固定化酶制劑組合物：
[0063] 將殼聚糖與聚丙締酷胺Wl: 1混合后加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為10°C 的條件下攬拌，使其溶解;然后加入與殼聚糖質(zhì)量比為1:50的(6-葡萄糖巧酶9000IU和鼠李 糖巧酶4000IU，攬拌均勻，置于10°C的恒溫?fù)u床上，震蕩化;將上述混合液逐滴滴入3mol/L 的氯化巧溶液中，在2°C條件下靜置lOmin，使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用0.4mol/L的 葡萄糖洗涂，抽濾除去游離水分，收集得到的凝膠小球即為固定化酶；
[0064] (5)將步驟(3)提取的馨葫皂巧用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進(jìn)行酶解， 產(chǎn)生馨葫皂素粗品；
[0065] (6)將步驟巧）的馨葫皂素用航空煤油進(jìn)行提取，得到含量為98% W上的純馨葫皂 素。
[0066] W上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干變形和改進(jìn)，運(yùn)些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)W所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法，包括以下步驟： (1) 將IOOkg干黃姜原料粉碎，過(guò)20目篩，加入到300kg~500kg中，將生料淀粉酶、普魯 蘭酶、真菌α-淀粉酶加入上述溶液中酶解； (2) 將步驟(1)中的黃姜水溶液在自然溫度下酶解24h; (3) 將步驟(2)進(jìn)行固液分離，固體用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇100L提取薯蕷皂苷，提取3 次，每次30min，液體可用于制造酒精； (4) 制備固定化酶制劑組合物： 將高分子化合物載體加水配制成2g/L濃度的溶液，在溫度為HTC的條件下攪拌，使其 溶解;然后加入與高分子化合物載體質(zhì)量比為1:30~1:60的酶，攪拌均勻，置于HTC的恒溫 搖床上，震蕩Ih;將上述混合液逐滴滴入3mol/L的氯化鈣溶液中，在2°C條件下靜置IOmin， 使其凝膠固化，收集凝膠小球，并用〇.4mol/L的葡萄糖洗滌，抽濾除去游離水分，收集得到 的凝膠小球即為固定化酶； (5) 將步驟(3)提取的薯蕷皂苷用步驟(4)制備的固定化酶制劑組合物進(jìn)行酶解，產(chǎn)生 薯蕷皂素粗品； (6) 將步驟(5)的薯蕷皂素用航空煤油進(jìn)行提取，得到含量為98%以上的純薯蕷皂素。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法，其特征在于:步 驟（1)所述的每毫升生料淀粉酶的活力為10000~20000IU，每毫升普魯蘭酶的活力為1000 ~5000IU，每毫升真菌α-淀粉酶的活力為50000~100000IU。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法，其特征在于:步 驟(4)所述高分子化合物載體殼聚糖，以及殼聚糖與非極性大孔樹脂、聚丙烯酰胺中的一種 或幾種的混合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法，其特征在于:步 驟(4)所述每毫升所述固定化酶制劑組合物中，β-葡萄糖苷酶的活力為8000~12000IU，鼠 李糖苷酶的活力為2000~5000IU。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固定化酶的制備及水解薯蕷皂素的方法，其特征在于:步 驟(5)所述薯蕷皂素粗品是指薯蕷皂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量在50%以下。
【文檔編號(hào)】C12N11/10GK105925559SQ201610466954
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】蘇二正, 陳龍
【申請(qǐng)人】寧夏乙征生物工程有限公司