一種內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用，所述的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3經(jīng)過畢赤酵母表達(dá)，純化后，比酶活高達(dá)4,757.4U/mg；rEPG3最適pH值為5.5，最適溫度為55℃；在pH 3.0?7.5下25℃處理24h還保持75.2％的酶活力，在45℃下處理1h之后還保持89.8％的酶活力，這說(shuō)明此酶具有良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。CGMCC 3.1550520150831
【專利說(shuō)明】
-種內(nèi)切多聚半乳糖酵酸酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種能夠分解聚半乳糖醒酸或果膠的內(nèi)切多 聚半乳糖醒酸酶巧PG3的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 果膠是一種主要由部分甲醋化的D-半乳糖醒酸經(jīng)a-(l，4)-糖巧鍵聚合而成的多 糖類物質(zhì)。果膠是植物組織的重要組成部分，其廣泛存在于高等植物組織中，尤其在果實(shí)、 莖塊、漿果中含量最為豐富。鑒于果膠結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，果膠酶按其作用方式大致可W分為原 果膠酶、果膠醋酶、多聚半乳糖醒酸酶和果膠裂解酶。在運(yùn)些復(fù)合酶中，內(nèi)切多聚半乳糖醒 酸酶是最重要的組成部分，其能夠隨機(jī)水解由兩個(gè)非甲醋化的半乳糖醒酸殘基所組成的糖 巧鍵，從而使高聚合度的果膠發(fā)生解聚。
[0003] 果膠酶是一類具有重要應(yīng)用價(jià)值的復(fù)合酶，是全球產(chǎn)銷量最大的工業(yè)酶制劑之 一，其已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、造紙、紡織和果膠廢液處理等領(lǐng)域。酸性果膠酶主要由真 菌產(chǎn)出，并主要應(yīng)用于食品領(lǐng)域，特別是果蔬汁、果酒的加工，其能夠顯著提高壓棒果蔬汁 的出汁率，降低果汁果酒的粘度，增加澄清效果，從而保證果汁果酒的品質(zhì)。內(nèi)切多聚半乳 糖醒酸酶rEPG3具有較高的催化活性W及良好的抑穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，運(yùn)些特征使得其具 有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種性質(zhì)優(yōu)良的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶。該酶含有379 個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID NO: 1所示。該酶屬于內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶的重組酶，記為 巧 PG3。
[0005] 其中，rEPG3的N端19個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信號(hào)膚序列。因此，成熟的內(nèi)切多聚半乳 糖醒酸酶的蛋白巧PG3有360個(gè)氨基酸，序列如SEQ ID N0:2所示。
[0006] 所述的巧PG3的信號(hào)膚序列如SEQ ID NO:3所示。
[0007] 本發(fā)明克隆了運(yùn)一內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶基因，克隆得到的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸 酶基因記為epg3，DNA全序列分析結(jié)果表明：epg3結(jié)構(gòu)基因全長(zhǎng)1419bp，含有4個(gè)內(nèi)含子，序 列如沈Q ID NO:4所示。
[000引所述的ep的的cDNA長(zhǎng)1140bp，序列如沈Q ID N0:5所示。
[0009] 所述的ep的去除其信號(hào)膚序列后的CDNA序列如SEQ ID N0:6所示。
[0010] 其中，所述的邱的的信號(hào)膚的CDNA序列如沈Q ID N0:7所示。
[00川含有上述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā) 明保護(hù)的范圍。
[0012] 上述重組載體為將上述DNA分子插入質(zhì)粒得到的重組載體。
[0013] 上述重組載體包含在己氏畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)的pPIC9K載體。本 發(fā)明的重組載體具體為在PPIC9K載體的SnaB巧日Avr II酶切位點(diǎn)間插入序列表中SEQ ID NO: 6核巧酸得到的重組載體pPIC9K-rEPG3。
[0014] 上述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的重組菌。
[0015] 上述宿主菌包含了重組載體pPIC9K-rEPG3的宿主菌，優(yōu)選為酵母菌;所述酵母菌 具體可為己氏畢赤酵母。
[0016] 上述的DNA分子或上述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制 備內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0017] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的方法，所述 方法包括W下步驟：
[0018] 1)用pPIC9K-rEPG3重組載體轉(zhuǎn)化己斯德畢赤酵母(PicMa pastoris GS115)，篩 選得到重組菌株GS115/VEPG3。
[0019] 2)培養(yǎng)重組菌株，甲醇誘導(dǎo)重組內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶基因ep的的表達(dá)。
[0020] 3)回收并純化所生產(chǎn)的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3。
[0021] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明從草酸青霉CZ1028的基因組序列中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼內(nèi) 切多聚半乳糖醒酸酶的基因ep的，可在宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因W生產(chǎn)內(nèi)切多聚半乳糖醒酸 酶巧PG3,用于降解聚半乳糖醒酸或果膠。對(duì)該內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3進(jìn)行酶活力相 關(guān)檢測(cè)，其酶促反應(yīng)的最適抑為5.5、最適溫度為55°C ;在最適pH和最適溫度下，該酶對(duì)底物 聚半乳糖醒酸的比酶活力為4，757.4U/mg;在抑3.0-7.5下25 °C處理2地還保持75.2 %的酶 活力，在45°C下處理化之后還保持89.8%的酶活力，說(shuō)明此酶具有良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn) 定性。運(yùn)些特征使得其具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為草酸青霉CZ1028的基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0023] 圖2為草酸青霉CZ1028總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0024] 圖3為草酸青霉CZ1028總RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后的CDNA瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0025] 圖4為草酸青霉CZ1028基因組中含有一個(gè)假定內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶全長(zhǎng)基因的 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0026] 圖5為草酸青霉CZ1028-個(gè)假定內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶的CDNA的PCR產(chǎn)物的瓊脂 糖凝膠電泳圖。
[0027] 圖6為草酸青霉CZ1028的一個(gè)假定內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶的成熟蛋白質(zhì)的編碼區(qū) 的基因序列。
[0028] 圖7為重組質(zhì)粒pPIC9K-rEPG3的構(gòu)建。
[0029] 圖8為重組己氏畢赤酵母菌株GS115/VEPG3的菌液PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0030] 圖9為制備及純化重組假定內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的SDS-PAGE分析。
[0031] 圖10為純化的重組假定內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3水解聚半乳糖醒酸的產(chǎn)物的 TLC分析。
[0032] 圖11為內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的最適作用抑和溫度曲線。
[0033] 圖12為內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的抑耐受性曲線。
[0034] 圖13為內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的溫度耐受性曲線。
[0035] 圖14為內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax的測(cè)定。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如沒有特別提及，均采用本領(lǐng)域的通用方法。下 述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的百 分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。W下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置=次重復(fù)實(shí) 驗(yàn)，結(jié)果取平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0037] 1.菌株、載體、酶、試劑盒及糖類物質(zhì)來(lái)源
[0038] 草酸青霉CZ1028為本實(shí)驗(yàn)室通過草酸青霉(Penicillium oxalicum)誘變篩選得 到的高產(chǎn)多聚半乳糖醒酸酶菌株，已保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中屯、，保藏號(hào)為 CGMCC3.15505,保藏方式為公開保藏，公眾可W獲得。己氏畢赤酵母(Pichia pastor is)菌 株GS115購(gòu)自 Invitrogen公司（California,USA)。表達(dá)載體pPIC9K購(gòu)自 Invihogen公司 (California,USA)。限制性內(nèi)切酶SnaB I和Avr II、T4DNA連接酶及用于PCR的LA Taq酶均 購(gòu)自化KaRa公司（迂寧，中國(guó)），糖巧內(nèi)切酶H購(gòu)自化W England Biolabs公司（北京，中國(guó)）。 用于cDNA第一條鏈合成的反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自化ansGen Biotech公司（北京，中國(guó)），用于RNA 提取的RNAiso Plus、用來(lái)連接PCR產(chǎn)物的pMD?18-T載體克隆試劑盒和用于PCR的化qTM化t Stad Version試劑盒都購(gòu)自TaKaRa公司（迂寧，中國(guó)），化a壯ord法蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu) 自捷瑞生物公司（上海，中國(guó)）。半乳糖醒酸、=半乳糖醒酸、聚半乳糖醒酸、橘皮果膠和蘋果 皮果膠均購(gòu)自Sigma公司。
[0039] 2.培養(yǎng)基
[0040] 1)真菌培養(yǎng)基
[0041 ]固態(tài)斜面培養(yǎng)基采用馬鈴馨-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。
[0042] 提取RNA和DNA所用的產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基成分為(g^):橘皮果膠10，（NH4)2S化1.4， MgS〇4.7H2〇 0.3，KH2P04 2.0，CaCl2*2H2〇 0.4,化N03 5.0，Tween 801.0,和Iml微量元素 (g/l:CoCl2 2.0，MnS〇4 ?出0 1.6，ZnS〇4 ?出0 1.4和FeS〇4*7出0 0.5)，最終各成分用 0.05M巧樣酸鋼緩沖液溶解至pH 5.5。
[0043] 2)酵母培養(yǎng)基
[0044] YPD培養(yǎng)基：1%酵母浸出物、2%膜蛋白腺、2%葡萄糖，固體培養(yǎng)基還另需要加入 2 %瓊脂。
[0045] YTO遺傳霉素(G418)固體培養(yǎng)基：1 %酵母浸出物、2 %膜蛋白腺、2 %葡萄糖、2 %瓊 脂和不同量的G418。
[0046] MD固體培養(yǎng)基：1.34%無(wú)氨基酸酵母氮源(YNB)、4Xl〇-5%生物素、2%葡萄糖和 2 %瓊脂。
[0047] BMGY培養(yǎng)基：1 %酵母浸出物、2 %膜蛋白腺、1 OOmM憐酸鐘化6.0、1.34%YNB、4 X 1 (T5 %生物素和1 %甘油。
[004引 BMMY培養(yǎng)基：1 %酵母浸出物、2 %膜蛋白腺、1 OOmM憐酸鐘化6.0、1.34%YNB、4 X 10-5%生物素和0.5%甲醇。
[0049] 3.多聚半乳糖醒酸酶活力及蛋白質(zhì)濃度測(cè)定：
[0050] W聚半乳糖醒酸為底物測(cè)定多聚半乳糖醒酸酶的活力，參照Miller等所描述的方 法（Miller GL.1959.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.Anal.Chem.31:426-428)。
[0051 ] I)半乳糖醒酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0052] 用去離子水配制2g/L的半乳糖醒酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2ml離屯、管中用去離子水將標(biāo)準(zhǔn) 液適當(dāng)稀釋成8個(gè)500化不同濃度的葡萄糖溶液(g/L):0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4,每個(gè)樣品濃度分別設(shè)S個(gè)重復(fù)。在所有樣品中加入1ml的DNS試劑，混勻，沸水中煮10分 鐘，用冰水冷卻至室溫，3420 X g離屯、5分鐘，每個(gè)樣品分別取200ul上清液加入到96孔酶標(biāo) 板中，在波長(zhǎng)540nm下測(cè)定樣品的吸光值。W半乳糖醒酸濃度為橫軸(X軸），W光吸收值為縱 軸（Y軸）作散點(diǎn)圖，添加趨勢(shì)線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 〇.9591x+0. 1559(相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9994)。
[0053] 2)酶活力測(cè)定及酶活力單位的定義
[0054] 在2mL的離屯、管中加入45化L含0.5%聚半乳糖醒酸的緩沖液(pH值根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要 來(lái)設(shè)定），在設(shè)定溫度的水浴鍋中保溫5分鐘后(溫度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來(lái)設(shè)定），加入50化酶液 并快速混勻。保溫反應(yīng)15分鐘后加入ImL的DNS試劑終止反應(yīng)并沸水浴10分鐘顯色。用冰水 冷卻至室溫，3420 X g離屯、5分鐘，取20化L反應(yīng)液加入到96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀于540nm處 測(cè)定光吸收值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)=次，對(duì)照酶液用沸水煮滅活。在設(shè)定的測(cè)定條件下，每分鐘 水解半乳糖醒酸聚合物釋放出Iwiiol還原糖所需的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位化)。
[0055] 3)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定使用Radford法（Bradford ,M . M. 1976 . A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical Biochemistry.72: 248-254)。
[0056] 4.假定內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3編碼基因ep的的獲得：
[0057] 1)產(chǎn)多聚半乳糖醒酸酶的草酸青霉CZ1028菌絲體的制備
[005引（1)草酸青霉CZ1028抱子懸浮液的制備:將草酸青霉CZ1028的抱子接種到固體PDA 斜面上，30°C靜置培養(yǎng)5天后，取新鮮抱子置于含0.1 % triton XlOO無(wú)菌超純水的S角瓶 中，用=角瓶中的玻璃珠充分打散抱子。
[0059] (2)草酸青霉CZ1028產(chǎn)酶培養(yǎng):將抱子液接種于前述的產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基(每IL體積 S角瓶中含100mL液體培養(yǎng)基)至終濃度IX IO5個(gè)/mL,置于30°C、150巧m搖床培養(yǎng)2天后，生 長(zhǎng)的菌絲體用于提取基因組DNA和RNA。
[0060] 2)草酸青霉CZ1028基因組DNA的提取:收集產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中的菌絲體，先后用無(wú) 菌生理鹽水和20mM/L的抓TA洗涂菌體，得到干燥菌絲體，加液氮充分研磨菌絲體后用SDS法 提取基因組DNA。將提取所得的DNA溶液進(jìn)行濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳(沒有特別說(shuō)明 均使用此濃度的瓊脂糖凝膠），結(jié)果如圖1所示:泳道M為A隧菌體DNA用限制性內(nèi)切酶化ndm 進(jìn)行完全酶切之后得到的產(chǎn)物，含有7個(gè)DNA片段，從大到小分別為:23.13、9.416、6.557、 4.361、2.322、2.027和0.564化;泳道1為草酸青霉〔21028的基因組0魁。電泳結(jié)果表明已經(jīng) 成功提取得到草酸青霉CZ1028的基因組DNA。
[0061 ] 3) RNA的提取及CDNA第一條鏈的合成
[0062]使用RNAiso Plus試劑提取草酸青霉CZ1028的總RNA，提取方法按照說(shuō)明書進(jìn)行， 提取得到的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖2所示:泳道M為化2000DNA Marker，含有6個(gè) DNA片段，從大到小分別為：2.00、1.00、0.75、0.50、0.25和0.1 Okb,泳道1為為草酸青霉 CZ1028的總RNA，可W清晰看到18S和28S RNA兩條帶。電泳結(jié)果表明成功提取得到草酸青霉 CZ1028的總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說(shuō)明書上所述的操作方法將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為 CDNA并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖3所示：泳道M為化2000DNA Marker,泳道1為草酸青 霉CZ1028CDNA第一條鏈的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果。電泳結(jié)果表明成功合成CDNA的第一條鏈。
[0063] 4)假定內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3全長(zhǎng)DNA的獲得及分析
[0064] 設(shè)計(jì)一對(duì)引物（引物1)，上游引物為5'-416〇：1'〔467^41'〔44〇：1'1'押640-3'，下游引 物為5 '-CTAGCAGCTAGCCACGCTGGG-3 '，W提取得到的草酸青霉CZ1028基因組DNA作為模板， 使用LA Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系參照說(shuō)明書，PCR反應(yīng)程序如下：94 °C 5min一 [ 94 °C 30sec 一 55°C30sec 一 72°C90sec]5 一 [94°C30sec 一 60°C30sec 一 72°C90sec]3〇 一 72°C10min， 4°C保存。
[0065] 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下切下HOObp左右的條帶，使用 DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖4:泳道M為化2000DNA Marker，泳道1為假定的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的全長(zhǎng)DNA?；厥账玫漠a(chǎn)物，使用T載 體克隆試劑盒連接至PMD18-T載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。使用引物1進(jìn)行菌落PCR，將含有 重組質(zhì)粒的陽(yáng)性大腸桿菌送去測(cè)序，得到該基因全長(zhǎng)DNA的序列為序列表中的SEQ ID NO: 4。該序列全長(zhǎng)1419bp，用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)化ttp://www.ncbi .nlm.nih.gov/)中的草酸青霉114- 2全基因組測(cè)序結(jié)果對(duì)比分析表明該序列含有4個(gè)內(nèi)含子，其在SEQ ID N0:4中的位置(bp) 分別為:252-327、753-817、950-1021、1107-1172。
[0066] 5)假定內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3全長(zhǎng)CDNA的獲得及分析
[0067] W得到的草酸青霉CZ1028CDNA的第一條鏈作為模板，使用引物1和LA Taq酶進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系參照說(shuō)明書，PCR反應(yīng)程序如下:94°C5min一[94°C30sec一55°C30sec一 72°C60sec]5 一 [94°C30sec 一 60°C30sec 一 72°C960sec]3〇 一 72°C10min，4°C 保存。將 PCR 產(chǎn)物 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下切下IlOObp左右的條帶，使用DNA純化回收試劑盒進(jìn) 行回收并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖5:泳道M為化2000DNA Marker,泳道1為假定內(nèi)切 多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的全長(zhǎng)cDNA?；厥账玫降漠a(chǎn)物，使用T載體克隆試劑盒連接至 PMD18-T載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。使用引物1進(jìn)行菌落PCR，將含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性大腸 桿菌送去測(cè)序，得到該基因全長(zhǎng)CDNA的序列為序列表中的SEQ ID N0:5。該序列全長(zhǎng) 1 HObp，使用在線軟件分析化ttp://www.cbs.dtu.化/services/SignalP/)表明為：全長(zhǎng) cDNA(SEQ ID N0:5)由成熟的編碼區(qū)（SEQ ID N0:6)和信號(hào)膚區(qū)（SEQ ID N0:7)組成。編碼 379個(gè)氨基酸(SEQ ID NO: 1)，其中成熟區(qū)為360個(gè)氨基酸(SEQ ID N0:2)，信號(hào)膚區(qū)為19個(gè) 氨基酸(SEQ ID N0:3)。
[006引 5.重組質(zhì)粒pPIC9K-rEPG3的構(gòu)建
[0069]設(shè)計(jì)引物2，上游引物為5' -GACCTACGTATCGCCTGTCGCCCAGCCAG-3 '，下游引物為5 ' - CGACCTAGGCTAGCAGCTAGCCACGCTGGG-3'，W得到的草酸青霉CZ1028cDNA的第一條鏈作為模 板，使用TaKaRa Taq?化t Start Version試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增成熟編碼區(qū)的CDNA，反應(yīng)體 系參照說(shuō)明書，PCR 反應(yīng)程序如下:95°C5min 一 [95°C30sec 一 56°C30sec 一 72°C80sec]3G 一 72 °C10min，4°C保存。使用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖6: 泳道M為化2000DNA Marker,泳道1為用來(lái)構(gòu)建pPIC9K-rEPG3成熟編碼區(qū)的基因。分別將將 表達(dá)載體PPIC9K和假定內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3成熟編碼區(qū)的基因進(jìn)行限制性酶切 (SnaB I+Avr II)，瓊脂糖凝膠電泳觀察后，分別切下雙酶切處理的表達(dá)載體和成熟編碼區(qū) 的基因并使用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收。將純化后的表達(dá)載體和成熟編碼區(qū)基因用 化KaRa T4DNA連接酶進(jìn)行連接，反應(yīng)體系參照說(shuō)明書。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使用引物2 進(jìn)行菌落PCR，對(duì)陽(yáng)性大腸桿菌的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖7:泳 道Ml為A隧菌體DNA用限制性內(nèi)切酶化ndm進(jìn)行完全酶切之后得到的產(chǎn)物、泳道1為不攜帶 外源基因的載體PPIC9K雙酶切、泳道2為重組質(zhì)粒雙酶切、泳道3為重組質(zhì)粒單酶切、泳道4 為重組質(zhì)粒、M2為化2000DNA Marker。從圖7泳道2可W看到兩條帶，一條為線性的PPIC9K載 體，另一條為連接在載體上的目的基因，由此得出結(jié)論:重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將酶切驗(yàn)證過 的重組質(zhì)粒拿去測(cè)序，用DNAman軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果分析表明，未發(fā)現(xiàn)基因突變、缺失或移碼情 況，將該重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-rEPG3 (' r '代表重組的意思）。
[0070] 6.含有質(zhì)粒pP I C9K-rEPG3的重組己氏畢赤酵母的構(gòu)建
[0071] 1)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母
[0072] 分別將不攜帶外源基因的載體PPIC9K和攜帶成熟編碼基因的載體pPIC9K-rEPG3 用限制性內(nèi)切酶SacI進(jìn)行單酶切，得到線性化質(zhì)粒。分別將運(yùn)兩個(gè)線性化質(zhì)粒用LiCl法轉(zhuǎn) 化至己氏畢赤酵母菌株GSl 15中。具體方法詳見Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)試劑盒
[0073] 2)重組己氏畢赤酵母的篩選與鑒定
[0074] (1)將LiCl處理后的細(xì)胞懸浮液適當(dāng)稀釋后涂在MD平板上，在30°C恒溫培養(yǎng)箱中 倒置培養(yǎng)3天。
[0075] (2)用滅菌處理過的超純水和玻璃珠將MD平板上的菌落洗脫下來(lái)，適當(dāng)稀釋后分 別取IOOul各個(gè)梯度的菌液涂在G418濃度為0.5-4. Omg/mL的Yro平板上，在30°C恒溫培養(yǎng)箱 中倒置培養(yǎng)3-4天。
[0076] (3)用牙簽將含G418(>2.0mg/mL)的Yro平板上的較大菌落接種于Yro液體培養(yǎng)基 中，在30°C，250巧m的搖床中培養(yǎng)2地，產(chǎn)生的發(fā)酵液用來(lái)做菌體PCR，鑒定重組子。用正向引 物5 ' AOX: 5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ' 和反向引物3 ' AOX: 5 ' -GCAAATGGCATTCTGACATCC- 3' 引物進(jìn)行菌體PCR。菌體PCR反應(yīng)條件如下：95°C5min一[92°C30sec一52°C30sec一72°C 2min]30一72°C 1 Omin，4°C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后如圖8所示：泳道Ml為1 kb DNA ladder，含有 10 個(gè) DNA 片段，從大到小分別為 10.00、9.00、8.00、7.00、6.00、5.00、4.00、 3.00、2.00和1.00化，泳道I的PCR產(chǎn)物是W轉(zhuǎn)化pPIC9K-rEPG3得到的單菌落為模板的擴(kuò)增， 泳道2的PCR產(chǎn)物是W轉(zhuǎn)化不攜帶外源基因的載體PPIC9K得到的單菌落為模板的擴(kuò)增，泳道 M2為化2000DNA Marker。從圖8的泳道1中可W看到PCR有一條ieOObp的條帶，長(zhǎng)度為載體上 的原有序列長(zhǎng)度(詳見Invi化Ogen公司的載體PPIC9K的商品說(shuō)明書）與外源DNA長(zhǎng)度之和， 泳道2可W看到PCR有一條5(K)bp的條帶，長(zhǎng)度為載體上的原有序列長(zhǎng)度。
[0077] (4)將PC閲金證后的陽(yáng)性克隆用牙簽分別接種于含2ml BMGY培養(yǎng)基的指形瓶中，30 °C，250巧m的搖床培養(yǎng)至過夜，然后在室溫下3000 X g離屯、5分鐘，最后將沉淀垂懸于含4ml BMMY培養(yǎng)基的指形瓶中，培養(yǎng)條件仍為30°C，250巧m，其間每隔24h加入0.5%體積的甲醇。 培養(yǎng)72h后收集發(fā)酵上清液在50°C，pH 5.0條件下測(cè)每個(gè)陽(yáng)性克隆的多聚半乳糖醒酸酶活 力，最終確定一株表達(dá)最高多聚半乳糖醒酸酶活力的菌株，命名為GS115/VEPG3,含有不攜 帶外源基因載體pP IC9K的對(duì)照菌株命名為GS115/CK。
[0078] 7.重組己氏畢赤酵母中ep的基因的表達(dá)及純化
[00巧]I)誘導(dǎo)重組己氏畢赤酵母菌株GS115/VEPG3表達(dá)重組蛋白質(zhì)巧PG3 [0080] 將生長(zhǎng)在固體Yro板上的GS115/VEPG3菌株用牙簽分別接種于含50ml BMGY培養(yǎng)基 的250mlS角瓶中，30°C，250巧m的搖床培養(yǎng)至0D600達(dá)到2-4,然后取25ml該發(fā)酵液在室溫 下3000 Xg離屯、5分鐘，最后將沉淀垂懸于含50ml BMMY培養(yǎng)基的250mlS角瓶中，同樣條件 下培養(yǎng)，其間每隔24h加入0.5 %體積的甲醇后并取樣保留W用來(lái)SDS-PAGE檢測(cè)化aemml i UK.1976.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.化1:ure . 227:680-685)，共計(jì)培養(yǎng)8天。結(jié)果如圖9-A所示：泳道M為蛋白 質(zhì)分子量標(biāo)記，包含7條帶，從上到下依次為97.2、66.4、44.3、29.0、20.1和14.3kDa;泳道l- 8為重組己氏畢赤酵母菌株GS115/rEPG3每段間隔時(shí)間的表達(dá)產(chǎn)物分析a-8天）。由圖9-A得 到結(jié)論:重組己氏畢赤酵母菌株GSl 15/VEPG3誘導(dǎo)6天后蛋白表達(dá)量接近高峰。
[0081 ] 2)重組蛋白質(zhì)巧PG3的純化
[0082] (1)在4°C，l，1325Xg條件下離屯、10分鐘收集誘導(dǎo)6天的GS115/VEPG3發(fā)酵上清液。
[0083] (2)在4°C，5000 Xg條件下用截留分子量為10.OkDa的15ml超濾管(Millipore)將 收集的發(fā)酵上清液進(jìn)行濃縮，濃縮過程中用〇.〇2mM的Tris-Hcl的緩沖液更換濃縮液中的發(fā) 酵液。
[0084] (3)將收集到的濃縮液4°C保存，取其中部分用GE公司的分子篩（HiLoad 16/ GOOsupredex 75co Iumn)進(jìn)行純化(流速:0.5ml/min、緩沖液:0.02mM Tri S-Hc 1、收集：Iml/ 管）
[0085] (4)將所有的收集管保存在4°C冰箱。用SDS-PAGE檢測(cè)每管收集液純度，將只含有 一條帶的蛋白液進(jìn)行糖巧內(nèi)切酶H處理(詳見說(shuō)明書），結(jié)果如圖9-B所示:泳道M為蛋白質(zhì)分 子量標(biāo)記，條帶數(shù)量和大小參見圖9-A。泳道1為重組己氏畢赤酵母菌株GS115/VEPG3誘導(dǎo)6 天后表達(dá)產(chǎn)物、泳道2為重組己氏畢赤酵母菌株GS115/CK誘導(dǎo)6天后表達(dá)產(chǎn)物、泳道3為純化 產(chǎn)物，泳道4為純化產(chǎn)物經(jīng)化d細(xì)處理后的條帶。從圖9-B可W看到，泳道3中僅有一條蛋白質(zhì) 條帶，該條帶對(duì)應(yīng)的分子量約為36.6f5kDa，與經(jīng)過計(jì)算化ttp: //ww. cnh叫O . cn/CalMW/ MyMW. asp)得到的重組蛋白質(zhì)巧PG3的理論分子量36.7化化相符合，并且經(jīng)EndoH處理后條 帶(泳道4)大小不變，說(shuō)明純化得到的巧PG3沒有明顯糖基化現(xiàn)象。終上所述，依照上述方法 成功純化得到了重組蛋白質(zhì)巧PG3。
[00化]8.純化的重組蛋白質(zhì)巧PG3的酶學(xué)特性
[0087] 1)底物特異性及產(chǎn)物分析
[0088] 如前所訴，重組蛋白質(zhì)巧PG3的基因ep的與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比較后，發(fā)現(xiàn)其為假定的內(nèi) 切多聚半乳糖醒酸酶，所W必須對(duì)其底物特異性及產(chǎn)物分析進(jìn)行檢測(cè)，用0.1 M的巧樣酸-憐 酸氨二鋼緩沖液分別配制含0.5%聚半乳糖醒酸、橘皮果膠和蘋果皮果膠的P冊(cè).5的反應(yīng)底 物，在55°C下測(cè)重組蛋白質(zhì)巧PG3針對(duì)各底物的酶活力，W水解聚半乳糖醒酸產(chǎn)生的酶活力 為100%，其它底物下的酶活力折算為相對(duì)酶活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組蛋白質(zhì)巧PG3針對(duì)聚半乳 糖醒酸、橘皮果膠和蘋果果膠的酶活力分別為100%、26.5%和16.6%。此實(shí)驗(yàn)說(shuō)明重組蛋 白質(zhì)巧PG3為多聚半乳糖醒酸酶。在含抑5.5,1%聚半乳糖醒酸的底物中加入一定量的重組 蛋白質(zhì)巧PG3,40°C保溫48小時(shí)，每隔一段時(shí)間取樣煮沸滅活后4°C保存，將所取樣品進(jìn)行薄 層層析（TLC)實(shí)驗(yàn)化 squivel JCC,Voget CE.2004.Purification and partial characterization of an acidic polygalacturonase from Aspergillus kawachii .J.Biotechnol. 110:21-28.)。結(jié)果如圖10所示:在反應(yīng)O分鐘(min)至I小時(shí)化）的 過程中，聚半乳糖醒酸迅速降解，有部分=半乳糖醒酸(G3)生成，未見半乳糖醒酸(Gl)生 成;反應(yīng)2小時(shí)至24小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物主要為半乳糖醒酸聚合物和=半乳糖醒酸，并未見半乳 糖醒酸明顯生成;反應(yīng)48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物主要為=半乳糖醒酸。底物特異性和化C結(jié)果 表明重組蛋白質(zhì)巧PG3是典型的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶。
[00例 2)最適作用抑值和溫度（I'emperature)
[0090]用0.1 M的巧樣酸-憐酸氨二鋼緩沖液配制含0.5%聚半乳糖醒酸的pH2.2-7.0的反 應(yīng)底物，在50°C下，按前述方法測(cè)定不同抑值對(duì)純化的巧PG3的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶活力 的影響。設(shè)測(cè)定的最高酶活力為100%，其它pH值的酶活力與最高酶活力的比值折算為相對(duì) 酶活力(Relative activity);結(jié)果見圖11-A:內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的最適作用pH 值為抑5.5。
[0091 ]用pH 5.5的0.1 M的巧樣酸-憐酸氨二鋼緩沖液配置0.5%的聚半乳糖醒酸溶液，按 照前述測(cè)定多聚半乳糖醒酸酶活力的方法分別在不同溫度下(25-80°C)測(cè)定純化的內(nèi)切多 聚半乳糖醒酸酶巧PG3的酶活力。設(shè)最適溫度下的酶活力為100%，其它溫度下的酶活力折 算為相對(duì)酶活力。結(jié)果見圖11-B:內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3的最適作用溫度為55°C。所 W可W設(shè)定抑5.5、55°C為巧PG3的最適反應(yīng)條件，并測(cè)得其特異性比酶活力為4,757.4U/ mg。
[0092] 3)pH穩(wěn)定性與溫度穩(wěn)定性
[0093] 將純化的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3進(jìn)行抑穩(wěn)定性檢測(cè)，分別采用0.1 M巧樣酸- 憐酸氨二鋼緩沖液(pH 2.2-7.0),0.1 M IYis-HCl緩沖液(pH 7.0-9.0),0.1 M甘氨酸-氨氧 化鋼緩沖液(pH 9.0-10.0)，將酶保存于不同pH值的緩沖液中，于25°C分別放置1小時(shí)和24 小時(shí)后，在pH 5.5、55°C (最適條件）下測(cè)定不同pH緩沖液中的殘余酶活力（ReSidual activity)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3在抑2.2-10.0緩沖液中保溫1小 時(shí)后仍殘余73.2%的酶活(見圖12-A)，純化的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3在抑3.0-7.5緩 沖液中保溫24小時(shí)后仍殘余75.2%的酶活(見圖12-B)，W上結(jié)果表明純化的內(nèi)切多聚半乳 糖醒酸酶巧PG3具有良好的pH穩(wěn)定性，尤其是在酸性條件下。
[0094] 將純化的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3進(jìn)行溫度耐受性檢測(cè)，分別采用不同的保 存溫度(45°C 、50°C?和55°C ▲)，將酶用含有0.5%聚半乳糖醒酸的抑5.5緩沖液稀釋，然 后稀釋酶液在上述溫度的水浴鍋中保溫1個(gè)小時(shí)，每隔15分鐘取樣并在最適條件下測(cè)定酶 活力。W不做如上處理的酶液的酶活力為100%，不同溫度保溫后的殘余酶活力折算為相對(duì) 酶活力。結(jié)果見圖13:純化的內(nèi)切多聚半乳糖醒酸酶巧PG3在45°C的條件下保溫1小時(shí)后仍 然保留89.8 %的酶活力，說(shuō)明該酶具有較好的溫度穩(wěn)定性。
[OOM ] 4)巧PG3的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km、Vmax的測(cè)定
[0096] 分別配制不同濃度的聚半乳糖醒酸液(umol/ml)，按照本研究中測(cè)定內(nèi)切多聚半 乳糖醒酸酶的反應(yīng)體系，在最適條件下測(cè)定巧PG3在W上述不同濃度底物的酶活力，蛋白質(zhì) 濃度檢測(cè)用化a壯ord法。底物濃度(S)和反應(yīng)速度(V)的雙倒數(shù)圖見圖14,根據(jù)雙倒數(shù)作圖 得出的方程來(lái)計(jì)算得到巧PG3的Km值為:72.3皿01/ml，Vmax為64，565.7U/mg。
[0097] 5)金屬離子、有機(jī)物對(duì)巧PG3酶活力的影響
[0098] (1)將抑5.5的0.5%聚半乳糖醒酸液配制成含不同濃度（ImM或2mM)的金屬離子氯 化物的反應(yīng)底物，在最適作用條件下測(cè)定巧PG3的酶活力。結(jié)果見表1:發(fā)現(xiàn)Mn2+和Cu2+對(duì) 巧PG3的酶活力有抑制作用，其中化最為明顯。
[0099]

[0100] (2)將抑5.5的0.5%聚半乳糖醒酸液配制成含不同濃度（IOmM或20mM)有機(jī)物的反 應(yīng)底物，在最適作用條件下測(cè)定巧PG3的酶活力。結(jié)果見表2:發(fā)現(xiàn)SDS對(duì)巧PG3的酶活力有強(qiáng) 烈抑制作巧.見它有化物對(duì)訊PG3的酪活力雙有影晌。
[0101]
[0102]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3,其特征在于，其氨基酸序列如下：SEQ ID NO :1或 SEQ ID NO:2所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的基因 epg3,其特征在于： 其核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。3. 包含權(quán)利要求2所述DNA分子的表達(dá)盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。4. 權(quán)利要求3所述的重組載體為將權(quán)利要求2所述DNA分子插入表達(dá)質(zhì)粒得到的重組載 體。5. 權(quán)利要求3所述的重組菌為將權(quán)利要求4所述的重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的重組 菌。6. 權(quán)利要求2所述的DNA分子或權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞系及重組菌在制備內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3的制備方法，其特征在于，所述方法包 括以下步驟： 1) 用權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，篩選得到重組菌株； 2) 培養(yǎng)重組菌株，甲醇誘導(dǎo)重組內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶基因 epg3的表達(dá)； 3) 回收并純化所表達(dá)的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3。8. 權(quán)利要求1所述的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶rEPG3在降解聚半乳糖醛酸或果膠中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK105925549SQ201511025114
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日
【發(fā)明人】程忠, 陳東, 盧波, 羅貞貞, 朱綺霞, 蘆志龍, 黃日波
【申請(qǐng)人】廣西科學(xué)院