一種山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及山核桃無(wú)性栽培的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]山核桃是山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)樹種，具有童期較長(zhǎng)，不容易采收，樹體高大以及園藝化栽培等困難，阻礙了山核桃的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。植物嫁接手段是植物無(wú)性繁殖里面比較重要的栽培技術(shù)，也是解決山核桃優(yōu)良種質(zhì)及園藝栽培的重要手段。
[0003]植物生長(zhǎng)素IAA是一種植物中重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)分子，主要參與植物根莖葉的生長(zhǎng)和發(fā)育，維持植物頂端優(yōu)勢(shì)，維管束的形成與分化，植物的向性運(yùn)動(dòng)等諸多過(guò)程，在植物的整個(gè)生命周期都起著重要的作用。Aux/IAA蛋白是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素IAA的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，主要編碼一種通過(guò)生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)來(lái)表達(dá)的組織或發(fā)育階段特異性的基因家族。Aux/IAA的啟動(dòng)子元件能和生長(zhǎng)素IAA的響應(yīng)因子ARF特異結(jié)合形成二聚體，然后激活或者抑制基因的表達(dá)。
[0004]目前，根據(jù)對(duì)楊樹、擬南芥等植物的突變體的Aux/IAA調(diào)控機(jī)制的了解，不論是外界的環(huán)境因子還是植物的生長(zhǎng)激素都能夠?qū)ux/IAA的功能產(chǎn)生重要的作用，為了更深入的了解和分析山核桃無(wú)性栽培的技術(shù)中Aux/IAA的功能，有必要提出一種山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，利用分子生物學(xué)手段分析山核桃Aux/IAA基因在其嫁接過(guò)程中的生物學(xué)功能，闡明可能的作用機(jī)制，通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)素原初響應(yīng)基因CcIAA的克隆，分析山核桃的嫁接調(diào)控的機(jī)理以及該基因和生長(zhǎng)素的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)系，有利于更進(jìn)一步了解Aux/IAA對(duì)山核桃的嫁接成活率影響作用機(jī)制以及山核桃嫁接過(guò)程中生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，其旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于Aux/IAA對(duì)山核桃的嫁接成活率影響作用機(jī)制以及山核桃嫁接過(guò)程中生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的了解及分析并不深入，山核桃嫁接成活率較低的技術(shù)問(wèn)題。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出了一種山核桃Aux/IAA基因克隆的分析方法，包括如下步驟:
[0007]步驟一、儀器準(zhǔn)備:液氮罐、高速冷凍離心機(jī)、滅菌鍋、超級(jí)純水儀、電熱恒溫水箱、超級(jí)低溫冰箱、紫外分光光度計(jì)、PCR儀、通風(fēng)櫥、電泳槽、小型渦旋儀、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫?fù)u床、制冰機(jī)、超凈工作臺(tái)、轉(zhuǎn)膜儀、燒杯、天平、移液管、研缽研棒和熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀；
[0008]步驟二、植物材料準(zhǔn)備:用于山核桃Aux/IAA基因克隆的實(shí)驗(yàn)樣品，選取山核桃的嫁接枝條進(jìn)行采集，采取后迅速用錫箔紙包好放入液氮罐，用作樣品并存放入-70°C環(huán)境中備用；用于qRT-PCR和Western blot的樣品，選取長(zhǎng)勢(shì)相似的兩年生的實(shí)生苗砧木和留有一個(gè)健壯芽的大概約9cm左右長(zhǎng)的一年生苗的接穗，并在實(shí)驗(yàn)基地中完成嫁接，采用兩種不同的生長(zhǎng)激素:IAA 4mg/1，NPA 0.3ug/1來(lái)處理山核桃接穗，時(shí)間為30miη，站木用蘸有激素的毛筆蘸濕。對(duì)照組用清水處理。在山核桃嫁接之后O天，I天，3天，5天，7天，14天采樣，共有36個(gè)不同的樣品，我們對(duì)每一個(gè)樣品準(zhǔn)備25個(gè)重復(fù)并用錫箔紙包好后立即放入液氮中，并存放于-70°C保存后備用。
[0009]樣品編號(hào)如下:
[0010]對(duì)照組接穗:jO，jI，j3，j5，j7，j 14;
[0011 ]對(duì)照組站木:z0，zl，z3，z5，z7，zl4;
[0012]IAA處理接穗:1 j0，I j I，I j3，I j5，I j7，I j 14;
[0013]1八八處理砧木:120，121，123，125，127，121;
[0014]NPA處理接穗:Nj0，Nj I，Nj 3，Nj 5，Nj7，Nj 14;
[0015]NPA處理砧木:NzO，NzI，Nz3，Nz5，Nz7，Nz14;
[0016]步驟二、總RNA提取并檢測(cè):在實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)經(jīng)步驟二米集后的嫁接枝條樣品進(jìn)行總RNA的提取，獲得嫁接枝條樣品的總RNA提取液，并從總RNA的提取液中吸取2ul進(jìn)行OD值測(cè)定，檢測(cè)質(zhì)量與濃度，從總RNA的提取液中吸取4ul與Buffer混勻后進(jìn)行電泳檢測(cè)；
[0017]步驟四、Aux/IAA基因的RACE擴(kuò)增:步驟如下:
[0018]I )RACE引物設(shè)計(jì):利用山核桃454測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，找到一個(gè)320bp的生長(zhǎng)素IAA基因，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物如下:
[0019]GSPl:GTTCTTCTCTGTCATCTGTCCCCCG
[0020]GSP2:TCAGAGAGGGAAGGCTACAAGGGGT[0021 ] IAA-F:ATGGAAAGCAAGGTAGCATATG
[0022]IAA-R:TCATACTCCACATCCCAAGCCTC
[0023]2)擴(kuò)增第一鏈cDNA:操作步驟如下:
[0024]①在兩個(gè)200ul離心管中分別加入2.0ul5 XFirst-Stand Buffer，I.0ul DTT,1.0ul dNTP Mix混勻，輕微離心至底部，待用；
[0025]②在另兩個(gè)200ul的離心管中加入2ul總RNA，在合成5 ’ -RACE-Ready cDNA的離心管中加入Iul 5’-Q)S Primer和0.75ul雙蒸水;在合成3’-RACE-Ready cDNA的離心管中加Alul 3’-CDS Primer和1.75ul雙蒸水，混合均勻，輕微離心至管底；
[0026]③對(duì)步驟②中的混合液72°C溫育3min，42 °C 2min，瞬時(shí)離心；
[0027]④在合成5’-RACE-Ready cDNA的離心管中再加入Iul SMARTHA Oligo，混勻；
[0028]⑤在步驟①中的混合液中加入0.25ul RNase Inhibitor和I.0ul SMARTScribeReverse Transcriptase，混勾，PCR反應(yīng):42°C90min; 72°C 1min;
[0029]⑥加入10ul雙蒸水稀釋，保存在_20°C冰箱備用。
[0030]3)RACE擴(kuò)增；以獲得的5’-RACE-Ready cDNA和3 ’-RACE-Ready cDNA為模板分別進(jìn)行5 ’和3 ’ RACE-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增5 ’和3 ’ cDNA末端。RACE反應(yīng)體系為50ul，內(nèi)含10 X UPM 5ul、基因特異性引物Iul^PrimeSTAR Max DNA聚合酶25ul、雙蒸水16.5ul、模板2.5ul AACE擴(kuò)增的條件為:941€3111丨11;941€308，651€308，721€908，共30個(gè)循環(huán)；最后72°(:延伸511^11。
[0031]4)陽(yáng)性片段回收;對(duì)經(jīng)過(guò)步驟3)所獲得的5’和3’cDNA末端擴(kuò)增產(chǎn)物割膠回收，操作步驟如下:
[0032]①利用1%瓊脂糖凝膠電泳跑完膠，再用干凈的手術(shù)刀把含有目的片段的膠塊切割下來(lái)，最后放入已經(jīng)編好號(hào)的1.5ml離心管中；
[0033]②依據(jù)膠塊重量加入3倍體積的BufferB2;
[0034]③在37 0C水浴鍋中水浴I Omin直至被完全融化；
[0035]④把融化完全的溶液移入吸附柱，12000rpm，離心lmin，然后去除收集管里面的液體，再將吸附柱繼續(xù)放進(jìn)同樣的收集管中；
[0036I⑤參照第④步重復(fù)一遍；
[0037]⑥往吸附柱里面加入700ul的Wash solut1n，12000rpm，離心lmin，然后去除收集管里面的液體，再將吸附柱重新放到收集管里面；
[0038]⑦參照第⑥步重復(fù)一遍；
[0039]⑧將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)，12000rpm，離心lmin;
[0040]⑨往吸附膜中央加入30ul Elut1n buffer，室溫靜置lmin，將吸附管與新的離心管放入離心機(jī)中，12000rpm，離心lmin;
[0041 ]⑩將DNA溶液放在-20 °C下保存。
[0042]5 )PCR回收產(chǎn)物和PMD18-T載體連接:在PCR回收產(chǎn)物與載體連接前必須添加PolyA尾巴，以獲得的回收產(chǎn)物DNA為模板，加PolyA尾反應(yīng)體系為1ul:內(nèi)含10 XBuffer 2.5ul，dNTP 2ul，Mg2+l.5ul，rTaq酶0.2ul，雙蒸水0.8ul，模板3ul;PCR反應(yīng)條件為:72°C延伸20min。外源DNA和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)，在200ul PCR管中反應(yīng)，操作步驟如下:
[0043]①配制DNA溶液5ul:1.0ul的Pmd 18-T vector、0.1mol?0.3mol(4ul)的目的DNA;
[0044]②加入5ul的Solut1n〗，在16°C下連接過(guò)夜(10小時(shí)以上)。
[0045]6)制備感受態(tài)并轉(zhuǎn)化:
[0046]感受態(tài)的制備步驟如下:
[0047]①受體菌的培養(yǎng):從LB平板上挑取新活化的E.coli DH5a單菌落，接種于3?5mlLB液體培養(yǎng)基中，37 °C下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(12h左右)；將該菌種懸液以1:100的比例接種，取250ul菌液轉(zhuǎn)接到25ml LB液體的培養(yǎng)基里面，37°C振蕩培養(yǎng)2?3h至0D600 = 0.5左右；
[0048]②感受態(tài)的細(xì)胞制備:在超凈工作臺(tái)上，將細(xì)菌液體轉(zhuǎn)入50ml離心管中，然后冰上放置1min;在4°C下，4000r/min，離心1min，棄去上清并將管倒置Imin以便培養(yǎng)液流盡；用在冰上已經(jīng)預(yù)冷的0.lmol/1的CaCl2溶液1ml輕輕重懸細(xì)胞，然后冰上放置30min;O?4°C4000!'/111；[11，離心10111；[11，然后棄去上清并且加入21111預(yù)冷的0.11]101/1的03(]12溶液，再輕輕重懸細(xì)胞，必須冰上放置；
[0049]③感受態(tài)的細(xì)胞分裝與凍存:在2ml已經(jīng)制備完全的感受態(tài)的細(xì)胞里面加入2ml30 %甘油(即1:1體積，甘油終濃度15 % );將此感受態(tài)細(xì)胞分裝成每份200yL( I.5mldorf管)，液氮速凍，快速轉(zhuǎn)入-70 0C冰箱保存。
[0050]將連接過(guò)夜的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，操作步驟如下:
[0051]①將感受態(tài)的細(xì)胞在冰上溶化并且加入需要轉(zhuǎn)化的1ul連接產(chǎn)物，冰上放置30min；
[0052 ] ②42 0C水浴鍋中熱擊45s，冰上放置2min ；
[0053]③加入750ul LB(不含Amp)培養(yǎng)基，200rpm 37°C恒溫?fù)u床來(lái)培養(yǎng)Ih左右；
[0054]④4000rpm離心5min，留10ul涂板(含Amp)；
[0055 ] ⑤37 cC倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)左右。
[0056]7)細(xì)菌檢測(cè):操作步驟如下:
[0057]①1.5ml離心管加入Iml LB(含Amp)培養(yǎng)基；
[0058]②挑取單菌落(>3個(gè))；
[0059]③200rpm、37°C恒溫?fù)u床來(lái)培養(yǎng)5h左右；
[0060]④驗(yàn)證:以菌液為模板，菌檢反應(yīng)體系為25ul:內(nèi)含內(nèi)含1XBuffer 2.5ul、dNTP2ul、Mg2+l.5ul、rTaq酶0.2ul、上下游引物各2.5ul、雙蒸水10.8ul、模板3ul。菌檢反應(yīng)條件為:941€3111丨11;941€308，631€308，72°(:1111丨11，共30個(gè)循環(huán)；最后72°(:延伸511^11。
[0061 ]⑤I %瓊脂糖的凝膠電泳檢測(cè)；
[0062]⑥重?fù)u含有目的基因的菌液，測(cè)序，然后由5’和3’cDNA末端序列拼接得到全長(zhǎng)cDNA序列ο
[0063]步驟五、CcIAA基因驗(yàn)證和分析:根據(jù)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行驗(yàn)證。用5’-RACE-Ready cDNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為50ul，內(nèi)含上下游引物各3ul、PrimeSTAR Max DNA聚合酶25111、雙蒸水16111、模板3111。？0財(cái)廣增條件為:94°(:11^11;941€308，671€308，72°(:11^1130s，共30個(gè)循環(huán);最后72°C延伸SmiruPCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物割膠回收，并加PolyA尾后利用pMD-18T載體連接并測(cè)序，得到全長(zhǎng)序列。測(cè)定得到的序列利用NCBI，DNAMAN軟件搜索并對(duì)同源性進(jìn)行比對(duì)以及推導(dǎo)氨基酸的序列；
[0064]步驟六、CcIAA基因生物信息學(xué)的分析:利用在線軟件分析CcIAA蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；Clustalx軟件來(lái)進(jìn)行序列的比對(duì);DNAMAN軟件對(duì)蛋白序列進(jìn)行比對(duì);DNAMAN軟件來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)的進(jìn)化樹并進(jìn)行分析；
[0065]步驟七、CcIAA基因在轉(zhuǎn)錄水平上的分析:步驟如下:
[0066]I)提取山核桃不同嫁接時(shí)期嫁接莖的總RNA;
[0067]2)對(duì)內(nèi)參與目的基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì):根據(jù)CcIAA的cDNA序列，運(yùn)用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)基因引物三對(duì):
[0068]Aux/IAA-f-Ι:5’-ATGGAGATTGGATGCTGGTTGG
[0069]Aux/IAA-r-Ι:5’ -TGGGTTGCTGTGACTTGTAGGT