用于檢測(cè)家蠶蠶卵微孢子蟲的lamp引物及快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及一種家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP檢測(cè)引 物及其應(yīng)用和家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 家蠶微粒子病是病原性的家蠶微抱子蟲(Nosema bombycis，N.b)經(jīng)食下傳染或胚 卵（胎)傳染，使家蠶感染發(fā)病的一種毀滅性疫病，也是目前影響我國蠶絲業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展 的重要疫病，每年各地因微粒子病危害而造成的經(jīng)濟(jì)損失十分慘重。同時(shí)，野外昆蟲微抱子 蟲可交叉感染家蠶，并能在蠶體間W及不同蠶期間傳播，導(dǎo)致大批蠶種報(bào)廢，嚴(yán)重制約蠶種 貿(mào)易和蠶業(yè)可持續(xù)發(fā)展。各地區(qū)蠶業(yè)主管部口和相關(guān)生產(chǎn)單位投入大量人力、物力和財(cái)力， 采取傳統(tǒng)顯微鏡鏡檢母蛾，淘汰帶毒母蛾產(chǎn)下的蠶種的常規(guī)方法進(jìn)行防治家蠶微粒子病， 但效果不佳。我國將家蠶微粒子病列為進(jìn)出口動(dòng)物檢疫二類疫病的檢疫名錄。
[0003] 最初人們判別家蠶是否感染家蠶微粒子病主要根據(jù)顯微鏡下組織研磨液中的微 抱子蟲的形態(tài)和大小進(jìn)行的，運(yùn)種方法也有效地遏制了世界各地蠶區(qū)微粒子病的流行，捶 救了世界的養(yǎng)蠶業(yè)。而對(duì)于家蠶蠶卵微抱子蟲的檢測(cè)主要是通過將產(chǎn)卵24h后的蠶卵浸酸 處理，待蠶卵解化收蟻后進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)，運(yùn)種方法不僅耗費(fèi)了大量時(shí)間，而且顯微鏡鏡檢 的缺點(diǎn)是對(duì)操作人員的技術(shù)及經(jīng)驗(yàn)要求較高，且很難將其他抱子類似物與家蠶微抱子蟲抱 子區(qū)別開來。隨著PCR技術(shù)的普及，人們開始使用PCR方法來檢測(cè)家蠶微抱子蟲并且達(dá)到了 較高的靈敏度。目前用于家蠶微粒子病PCR檢測(cè)的引物多是針對(duì)祀基因 SS化RNA的(Ter巧R S,Smith JE,Bouchon D,et al.Ultrastructural characterization and molecular taxonomy of Nosema granulosis sp.n.,a transovarially transmitted,feminizing (TTF)microsporidium.J.Eukaryot.Microbiol.1999,(46):492-499;Huang Wei-Fone, Tsai Shu-Jen,Lo Chu-Fang,et al.The novel organization and complete sequence of the ribosomal RNA gene of Nosema bombycis.Fungal Genetics and Biology, 2004.4U5) :473-481)但是劉吉平等(2004K劉吉平，曹陽，Smith J.E.等.模擬感染家蠶微 粒子病的PCR分子診斷技術(shù)研究.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004,37( 12): 1925-1931)研究發(fā)現(xiàn)，基 于ieSrDNA保守區(qū)段設(shè)計(jì)的引物檢測(cè)蠶卵微抱子蟲，經(jīng)常會(huì)有非目的條帶及假陽性結(jié)果出 現(xiàn)，推測(cè)蠶卵抽提物中可能存在某種抑制物質(zhì)干擾了對(duì)病原微抱子蟲基因組DNA有效擴(kuò)增。
[0004] 本申請(qǐng)人根據(jù)長期的研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果，針對(duì)家蠶微抱子蟲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，經(jīng)測(cè) 序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了家蠶微抱子蟲S邱tin2基因（登錄號(hào):KJ451481.1)，發(fā)現(xiàn)WS邱tin2基因?yàn)殪?序列設(shè)計(jì)的PCR引物檢測(cè)微抱子蟲并無非特異性條帶及假陽性結(jié)果。但是，使用該基因設(shè)計(jì) 的PCR引物對(duì)于家蠶微抱子蟲檢測(cè)方法操作步驟較多，且花費(fèi)時(shí)間較長。況且，微抱子蟲寄 生于蠶卵中，且蠶卵含量明顯高于要檢測(cè)的微抱子蟲，在提取獲得的DNA樣品中，兩者DNA同 時(shí)存在，家蠶蠶卵DNA對(duì)檢測(cè)造成嚴(yán)重的干擾，因此，要想直接W蠶卵DNA為模板進(jìn)行微抱子 蟲的LAMP檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)提出了更高的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)蠶卵中是否感染家蠶微抱子蟲 所存在的操作步驟多、花費(fèi)時(shí)間長、干擾大等缺陷，設(shè)計(jì)出一組適用于家蠶蠶卵微抱子蟲的 LAMP檢測(cè)的檢測(cè)引物，基于所述引物，可成功建立家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供一種家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP快速檢測(cè)方 法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)：
[000引提供一組用于檢測(cè)家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP引物，所述引物為Septin2-F3、 S邱tin2-B3、S巧tin2-FIP(Flc+F2)和S邱tin2-BIP(Blc+B2)，其序列分別如沈Q ID N0:1 ~ 4所示。
[0009] SEQ ID NO: 1:
[0010] Septin2-F3：5'-CCAATTTCACACCTCCGTT-3'
[0011] 沈Q ID NO:2
[0012] Septin2-B3:5'-ACACAAGCTCTAAATCGGTC-3 '
[0013] SEQ ID NO:3:
[0014] Septin2-FIP(Flc+F2)：
[0015] 5，-GTAAGTTTAATTGGCCCCAGGGATATTGTAACATCACCAAAAATAACCG-3,
[0016] SEQ ID N0：4：
[0017] Septin2-BIP(Blc+B2)：
[001 引 5'-GTTTAGGCTAAGGGAAATGCTTGTATAATATTCTTCTGTGGTTTCGA-3'
[0019] 在本發(fā)明方法的關(guān)鍵技術(shù)之一是引物的設(shè)計(jì)，基于引物的科學(xué)設(shè)計(jì)，才能成功實(shí) 現(xiàn)操作步驟少、花費(fèi)時(shí)間短、干擾小、特異性強(qiáng)的LAMP檢測(cè)，本申請(qǐng)人根據(jù)Septin2基因設(shè)計(jì) 了若干組引物，經(jīng)過復(fù)雜和困難的篩選工作，并對(duì)運(yùn)些引物的有效性、特異性、反應(yīng)時(shí)間等 反復(fù)進(jìn)行了分析、總結(jié)和模擬實(shí)驗(yàn)，綜合考慮檢測(cè)方法的各種影響因素，才確定所述適用于 家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP檢測(cè)的檢測(cè)引物。
[0020] 本發(fā)明同時(shí)提供一種家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP檢測(cè)方法，包括W下步驟：
[0021] SI.提取待測(cè)樣品模板DNA;
[0022] S2.基于所述檢測(cè)引物，配置反應(yīng)體系；
[0023] S3.在步驟S2所配置的反應(yīng)體系使用的反應(yīng)管中加入20化密封液;采用染色法判 定結(jié)果在管蓋內(nèi)側(cè)加入化L顯色液；
[0024] S4.反應(yīng):將反應(yīng)管置于恒溫水浴箱或其他恒溫設(shè)備中，63 °C恒溫放置60min;然后 95°C，放置2min滅活；
[00巧]S5.結(jié)果判定：
[0026] 采用染色法進(jìn)行結(jié)果判定:將反應(yīng)管管蓋內(nèi)側(cè)的顯色液彈入反應(yīng)管，與反應(yīng)產(chǎn)物 混合;在自然光下通過肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)產(chǎn)物顏色變?yōu)榫G色，說明待測(cè)樣品含有家蠶 蠶卵微抱子蟲;反應(yīng)產(chǎn)物變?yōu)槌紊瑒t不含有家蠶蠶卵微抱子蟲；
[0027] 或者采用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行結(jié)果判定：取化L反應(yīng)后的產(chǎn)物，與IiiL 6 X loading buffer和化Ld地2〇混合，于2%瓊脂糖凝膠電泳；若出現(xiàn)大小不等的眾多梯形條 帶，說明待測(cè)樣品含有家蠶蠶卵微抱子蟲;若無大小不等的眾多梯形條帶，說明待測(cè)樣品不 含有家蠶蠶卵微抱子蟲；
[0028] 或者采用實(shí)時(shí)巧光法進(jìn)行結(jié)果判定:若有"S"型擴(kuò)增曲線且擴(kuò)增值超過設(shè)定的闊 值為陽性，若擴(kuò)增曲線的擴(kuò)增值未超過設(shè)定的闊值則為陰性。
[0029] 其中，S2所述的反應(yīng)體系是采用優(yōu)化后的25化反應(yīng)體系，分別如下：
[0030] (1)采用染色法進(jìn)行結(jié)果判定的25iiL反應(yīng)體系為：
[0031] 在PCR管中配置，采用優(yōu)化后的25iiL反應(yīng)體系，如下表所述：
[0032]
[00：
[0034] 建議:對(duì)于N個(gè)樣品，應(yīng)配制(N+3)倍體積的反應(yīng)液(包括陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各一 個(gè)，W及分裝耗費(fèi)誤差），保證各反應(yīng)管分裝均勻。
[0035] (2)實(shí)時(shí)巧光法判定結(jié)果
[0036] 在PCR管中配置，采用優(yōu)化后的25iiL反應(yīng)體系，如下表所述：
[0037]
[0038] (3)瓊脂糖凝膠電泳法判定結(jié)果
[0039] 在PCR管中配置，采用優(yōu)化后的25iiL反應(yīng)體系，如下表所述：
[0040]
[004U 所述2 X Reaction Mix為反應(yīng)緩沖液，組成為20mMTris-HCl，pH8.8 ; IOmMKCl; 2mMMgS04; 20mM(NH4)2S04; 0.1 % Tri ton X-IOO; 2. SmMdNTPs; IM甜菜堿；25mMMgCl2;
[0042] 所述 Septin2-F3/B3 為 5pmol/化；所述 Septin2-FIP/BIP 為 20 ~40pmol/化；所述 Bst DNA polymerase為8U/]iL。
[0043] 陽性對(duì)照品為S邱t in2DNA-pMD重組質(zhì)粒。
[0044] 所述顯色液為10000 X SYBR Green I;所述巧光指示劑為IX SYBR Green I。
[0045] 步驟SI用Qiagen公司出品的試劑盒DNeasy Plant Mini