證的家蠶微抱子蟲Septin2 基因（Accession number :KF421133.1)序列，通過BLAST軟件進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)并無相 似性序列，因此W該基因?yàn)殪牖蛟O(shè)計(jì)Septin2F/R引物。圖1顯示的是PCR引物及LAM巧I物 組在Septin2基因上的位置示意圖。圖2所示為四條LAMP引物設(shè)計(jì)的祀基因序列和位置示意 圖。
[0091]①引物組1四條引物序列為：
[00 巧]巧3:5 ' -AAGGTGAAAGGATTMTGACTT-3'
[0093] 163:5'-TCATATAATTCACTTGCTGTGTA-3'
[0094] IFIP:
[00 巧]5'-CCACTTTAGAGCCTAGTAATCCATT-CTTCAATATTATGACTGTTGGATCG-3 '
[0096] IBIP:
[0097] 5'-AGTCTGCAAGTCAATGACCATTTGTGACTGTAATTCGAGTGT-3'
[009引②引物組2四條引物序列為：
[0099] Septin2-F3：5'-CCAATTTCACACCTCCGTT-3'
[0100] Septin2-B3:5，-ACACAAGCTCTAAATCGGTC-3 '
[0101] Septin2-FIP(Flc + F2):5'-GTAAGTTTAATTGGCCCCAGGGATA-TTGTAACATCACCAAAAATAACCG-3 '
[0102] Septin2-BIP(Blc + B2):5'-GTTTAGGCTAAGGGAAATGCTTGT-ATAATATTCTTCTGTGGTTTCGA-3'
[0103] ③引物組3四條引物序列為：
[0104] 2F3:5 '-TTGGATCGCATGGCATAG-3 '
[0105] 2B3:5，-ACCCAACATTCATTATTATCTGT-3，
[0106] 2FIP:
[0107] 5'-GCAGACTTTTCTAGCCTCTTCAATCAAGCTTTATCAATGGATTACTAGG-3'
[010 引 2BIP:
[0109] 5'-GTCAATGACCATTCAAGTTTCACATCACGATCTACTTCTGTGACT-3'
[0110] 使用上述PCR引物檢測(cè)健康蠶卵和感染了家蠶微抱子蟲的蠶卵，結(jié)果顯示該引物 對(duì)于家蠶蠶卵微抱子蟲的檢測(cè)具有特異性，因此基于該P(yáng)CR引物擴(kuò)增片段位置，WSeptin2 基因?yàn)長(zhǎng)AMP引物設(shè)計(jì)的祀基因，使用在線軟件Primer Explore;rV4(http:// primere邱Iorer. jp/elamp4.0.0/index.html)，設(shè)計(jì)多組LAMP引物，經(jīng)過復(fù)雜和困難的篩 選工作，并對(duì)運(yùn)些引物的有效性、特異性、反應(yīng)時(shí)間等反復(fù)進(jìn)行了分析、總結(jié)和模擬實(shí)驗(yàn)，綜 合考慮檢測(cè)方法的各種影響因素，確定一組即四條特異性引物作為L(zhǎng)AMP檢測(cè)用引物。
[0111] 實(shí)施例2家蠶蠶卵及家蠶蠶卵微抱子蟲的模板DNA的制備
[0112] 取健康家蠶蠶卵或添食家蠶微抱子蟲的家蠶所產(chǎn)蠶卵樣品10~50粒，12000rpm離 屯、5min，棄上清;然后加50~10化1 d地20重懸;吸取重懸的抱子液至預(yù)冷的研鉢中，液氮充 分研磨（3次W上）；將研磨后抱子放入1.5ml離屯、管中，加入40化1 APl (參見Qiagen公司出 品的試劑盒DNeasy Plant Mini Kit說明，W下其他試劑同）和化1化ase，滿旋混勻）；混勻 后的溶液，65°C，解育IOmin(期間上下顛倒試管2~3次）；加13化1 AP2,混合后冰浴5min;然 后HOOOrpm離屯、5min;吸取上清于QIAshredder spin colu皿中的收集管，14000;rpm離屯、 2min;將離屯、管中上清液移至新管（勿攬動(dòng)出現(xiàn)的殘?jiān)?，加?.5倍體積的AP3/E，移液器 混合;將65化1混合液移至化easy Mini spin column中，420化pm,離屯、Imin;剩下的液體重 復(fù)此步驟;將spin colum放入新收集管中。加入500ul buffer AW(參見Qiagen公司出品的 試劑盒DNeasy Plant Mini Kit說明，W下其他試劑同），4200;rpm，離屯、Imin;棄上清;再加 入50化1 AW，14000rpm，離屯、2min(保證收集管不接觸到底部上清）；移收集管至1.5ml或2ml 離屯、管中；加入40]il buffer AE(參見Qiagen公司出品的試劑盒DNeasy Plant Mini Kit說 明，W下其他試劑同）洗脫，室溫放置5min;420化pmlmin;重復(fù)上一步;-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0113] 實(shí)施例3制備陽(yáng)性對(duì)照品：
[0114] 用上游引物Septin2F和下游引物Septin2R為反應(yīng)引物，W家蠶微抱子蟲DNA為模 板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入PMD-19T載體(購(gòu)自化kara公司）獲得S邱tin2DNA-pMD質(zhì)粒 并作為檢測(cè)的陽(yáng)性模板。
[0115] S邱tin2F和下游引物S邱tin2R的序列為：
[0116] Septin2F:5-ATCGCATGGCATAGGAAA-3
[0117] Septin2R:5-CAGGGATACTCACGAACATAAC-3
[0118] 用引物組S邱tin2-F3和S邱tin2-B3作為外部引物，S巧tin2-FIP和S邱tin2-BIP作 為內(nèi)部引物，反應(yīng)緩沖液2 X Reaction Mix(20mM Tris-HCl，p冊(cè).8; IOmM KCl ;2mMMgS〇4; 2〇1111(畑4)25〇4;0.1%化^〇11 X-100;2.8mM dNTPs;lM甜菜堿；25mM MgCl2);Septin2F3/B3 (20~40pmolAiL) ;Septin2FIP/BIP(5pmol/iiL);陽(yáng)性對(duì)照品；Bst DNA polymerase(洲/y L);密封液；顯色液（10000 X SY服Green I);巧光指示劑（I X SYBR Green I);滅菌dd此0; 即為家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP快速檢測(cè)方法的所有檢測(cè)試劑。
[0119] 實(shí)施例3應(yīng)用試驗(yàn)
[0120] 本實(shí)施例提供家蠶蠶卵微抱子蟲的LAMP快速檢測(cè)方法的應(yīng)用試驗(yàn)，操作步驟如 下：
[0121] (1)制備待測(cè)樣品核酸(QIAGEN 歴easy plant mini kit):
[0122] 取健康家蠶蠶卵或添食家蠶微抱子蟲的家蠶所產(chǎn)蠶卵樣品10~50粒，12,0(K)巧m， 離屯、5min，棄上清;然后加50~10化1 d地20重懸;吸取重懸的抱子液至預(yù)冷的研鉢中，液氮 充分研磨(3次W上）；將研磨后抱子放入1.5ml離屯、管中，加入40化1 APl和化1化ase，滿旋 混勻）；混勻后的溶液，65°C，解育IOmin(期間上下顛倒試管2~3次）；加13化1 AP2(參見 Qiagen公司出品的試劑盒說明），混合后冰浴5min;然后1400化pm離屯、5min;吸取上清于 QIAshredder spin COIu皿中的收集管，14000rpm離屯、2min;將離屯、管中上清液移至新管 (勿攬動(dòng)出現(xiàn)的殘?jiān)尤?.5倍體積的AP3/E，移液器混合；將650iU混合液移至Dneasy Mini spin colu皿中，4200rpm離屯、Imin;剩下的液體重復(fù)此步驟;將spin colum放入新收 集管中。加入500ul buffer AW，4200巧m離屯、Imin;棄上清；再加入500]il AW，HOOOrpm離屯、 2min;(保證收集管不接觸到底部上清）；移收集管至1.5ml或2ml離屯、管中；加入40iU buffer AE洗脫，室溫放置5min;4200巧m離屯、Imin;重復(fù)上一步;-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0123] (1)配置反應(yīng)體系：
[0124] ①染色法判定結(jié)果
[0125] 在PCR管中配置，采用優(yōu)化后的25iiL反應(yīng)體系，如下表所述：
[01261
[0127] 建議:對(duì)于N個(gè)樣品，應(yīng)配制(N+3)倍體積的反應(yīng)液(包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各一 個(gè)，W及分裝耗費(fèi)誤差），保證各反應(yīng)管分裝均勻。
[01%]②實(shí)時(shí)巧光法判定結(jié)果
[0129]在PCR管中配置，采用優(yōu)化后的25iiL反應(yīng)體系，如下表所述：
[0
[0132] ③瓊脂糖凝膠電泳法判定結(jié)果
[0133] 在PCR管中配置，采用優(yōu)化后的25iiL反應(yīng)體系，如下表所述：
[0135] (3)加樣：分裝后，分別依次向反應(yīng)管加入化L的d地2〇(空白對(duì)照）、各模板DM、陽(yáng) 性對(duì)照品；然后加入甘油20化密封；（對(duì)于染色法判定結(jié)果，要在反應(yīng)管管蓋內(nèi)側(cè)加入化L顯 色液，將管蓋蓋緊(注意避免顯色液掉入反應(yīng)液中）。（4)反應(yīng):對(duì)于染色法和瓊脂糖凝膠電 泳法判定結(jié)果的檢測(cè)，將反應(yīng)管置于恒溫水浴箱或其他恒溫設(shè)備中，