專利名稱：新孢蟲的血清學(xué)檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用受試血清與能和新孢蟲(Neospora caninum)反應(yīng)的蛋白質(zhì)作用的方法進(jìn)行新孢蟲感染的血清學(xué)檢測(cè)。
背景技術(shù)：
在許多種動(dòng)物中新孢蟲和剛地弓形體(Toxoplasma gondii)是密切相關(guān)的致病的原生動(dòng)物寄生蟲。新孢蟲已經(jīng)被認(rèn)為是牛和其他動(dòng)物流產(chǎn)，神經(jīng)學(xué)相關(guān)的肢體缺陷和新生兒死亡率的原因。剛地弓形體是綿羊流產(chǎn)的常見(jiàn)原因。有效的控制新孢蟲病和弓形體病需要快速診斷。因此開(kāi)發(fā)有效的針對(duì)新孢蟲的診斷試驗(yàn)是重要的。
有幾種本領(lǐng)域已知的試驗(yàn)?zāi)軌蚺袛鄤?dòng)物是否已經(jīng)暴露過(guò)新孢蟲。但是，迄今沒(méi)有開(kāi)發(fā)出可以區(qū)分新孢蟲天然血清陽(yáng)性動(dòng)物和新孢蟲接種動(dòng)物和/或新孢蟲血清反應(yīng)陰性(未接種)動(dòng)物的診斷試驗(yàn)和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明首次提供一種區(qū)分新孢蟲天然血清陽(yáng)性動(dòng)物和新孢蟲疫苗接種過(guò)的動(dòng)物的方法。本發(fā)明也提供用血清學(xué)測(cè)定判斷動(dòng)物是否已感染新孢蟲的方法。
本發(fā)明一方面提供檢測(cè)血清樣品中新孢蟲抗體的方法，其通過(guò)將血清與剛地弓形體蛋白接觸并檢測(cè)血清中結(jié)合抗體的存在。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示對(duì)截短的BAG1-GST的Western印跡反應(yīng)泳道1抗全長(zhǎng)BAG1-GST的兔抗血清(陽(yáng)性對(duì)照)泳道2天然的( )血清反應(yīng)陰性母牛的血清(陰性對(duì)照)泳道3新孢蟲滅活疫苗免疫49天的母牛的混合抗血清泳道4新孢蟲減毒疫苗免疫49天的母牛的混合抗血清泳道5自然感染的血清反應(yīng)陽(yáng)性的母牛的混合抗血清泳道6分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)圖2顯示對(duì)截短的和全長(zhǎng)的BAG1-GST的Western印跡反應(yīng)泳道1-4截短的BAG1-GST抗原泳道5分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)泳道6-9全長(zhǎng)BAG1-GST抗原泳道1，6天然的血清反應(yīng)陰性母牛的血清(陰性對(duì)照)泳道2，7新孢蟲滅活疫苗免疫119天的母牛的混合抗血清泳道3，8新孢蟲減毒疫苗免疫119天的母牛的混合抗血清泳道4，9自然感染的血清反應(yīng)陽(yáng)性母牛的抗血清泳道5分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種測(cè)定系統(tǒng)，其能夠區(qū)分接種的和自然暴露于新孢蟲的血清反應(yīng)陽(yáng)性動(dòng)物。依照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)剛地弓形體和新孢蟲的蛋白只存在于天然血清反應(yīng)陽(yáng)性的動(dòng)物中。以本發(fā)明方法提供的測(cè)定結(jié)果為基礎(chǔ)，現(xiàn)在可以將新孢蟲血清反應(yīng)陰性的動(dòng)物及以前用新孢蟲為基礎(chǔ)的疫苗接種過(guò)的動(dòng)物(參見(jiàn)例如，美國(guó)序列第09/260,414號(hào)“減毒活新孢蟲疫苗”，在此引入以作參考和美國(guó)序列第09/138,985號(hào)“新孢蟲疫苗”，在此引入以作參考)與血清反應(yīng)陽(yáng)性(即天然暴露的)動(dòng)物可靠地區(qū)分和隔離。
暴露過(guò)新孢蟲的動(dòng)物的血清會(huì)與剛地弓形體和新孢蟲蛋白以及它們的片段反應(yīng)。“反應(yīng)”意思是形成可檢測(cè)到的抗原-抗體復(fù)合物?？乖贵w復(fù)合物的形成是預(yù)示著動(dòng)物天然感染了新孢蟲。以前接種過(guò)新孢蟲的動(dòng)物的血清和天然新孢蟲血清反應(yīng)陰性的動(dòng)物的血清不會(huì)與剛地弓形體和新孢蟲蛋白以及它們的片段反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供區(qū)分接種過(guò)(血清反應(yīng)陰性)和天然暴露于新孢蟲-血清反應(yīng)陽(yáng)性的動(dòng)物的方法。
而且，依照本發(fā)明，如果希望，可以基于本發(fā)明的測(cè)定結(jié)果對(duì)新孢蟲血清陽(yáng)性動(dòng)物進(jìn)行接種。本發(fā)明所考慮的動(dòng)物包括牛(cattle)，小牛(calves)，公牛(bulls)，母牛(cows)和閹牛(steer)。優(yōu)選地，將本發(fā)明的方法應(yīng)用于母牛，最優(yōu)選，應(yīng)用于小牛。
按照本發(fā)明，源于剛地弓形體或新孢蟲的任何純化的，天然的或重組的慢殖子抗原或其片段，可被用作本發(fā)明的血清學(xué)測(cè)定的檢測(cè)抗原。“片段”意思是全長(zhǎng)的剛地弓形體或新孢蟲蛋白的部分肽段，其提供存在于動(dòng)物血清中的抗體識(shí)別的表位。按照本發(fā)明，全長(zhǎng)剛地弓形體或新孢蟲蛋白的截?cái)嘈问揭怖斫鉃槠巍?br> 在一個(gè)實(shí)施方案中，全長(zhǎng)慢殖子抗原谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白(BAG-1)是檢測(cè)抗原，(SEQ ID NO.2)。在另一實(shí)施方案中，缺少BAG-1的N-末端28個(gè)氨基酸的截短的BAG-1-GST融合蛋白是檢測(cè)抗原，(SEQ IDNO.3)。在本領(lǐng)域中BAG-1也稱作BAG-5。本發(fā)明打算將自然感染新孢蟲的動(dòng)物的抗血清或者接種過(guò)新孢蟲的動(dòng)物的抗血清或者未經(jīng)過(guò)感染(uninfected)的抗血清用作試驗(yàn)樣品。
按照本發(fā)明，當(dāng)慢殖子抗原或其片段被固定在固相支持物上時(shí)，其反應(yīng)性便提供了檢測(cè)新孢蟲抗體的方法。特別是，本發(fā)明方法的進(jìn)行可以通過(guò)將動(dòng)物血清樣品與慢殖子-階段的蛋白或其片段接觸，然后反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，并用傳統(tǒng)的檢測(cè)和定量方法檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)生的復(fù)合物。“抗體”意思是能與抗原上特異表位結(jié)合的免疫球蛋白分子?？贵w可以是多克隆的混合物或者是單克隆的?？贵w可以是天然來(lái)源或者重組來(lái)源的完整的免疫球蛋白，也可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)部分。
已知有許多檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物的量和/或其存在與否的方法，所有這些方法也是本發(fā)明所考慮的。例如，Western印跡測(cè)定的進(jìn)行可以通過(guò)將抗原附著于固體支持物如硝酸纖維素紙上，將該紙與血清檢測(cè)樣品保溫，并檢測(cè)硝酸纖維素濾紙上在全長(zhǎng)(約55kDa)或截短的(約51kDa)剛地弓形體BAG1-GST蛋白預(yù)期分子量處特異條帶存在與否。在兩個(gè)預(yù)期分子量處的任何一處存在條帶，都說(shuō)明該動(dòng)物是新孢蟲血清陽(yáng)性。相反地，兩個(gè)預(yù)期分子量處的任何一處條帶都缺失說(shuō)明該動(dòng)物是接種過(guò)的。
本發(fā)明也考慮用Western印跡測(cè)定，其中將抗原附著在硝酸纖維素紙上并且將抗原用有染料附著的抗體染色。也可以使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，其中抗原或抗體是用酶標(biāo)記的。本發(fā)明也打算用放射免疫測(cè)定法，其中抗原或抗體是用放射性元素標(biāo)記的。
本發(fā)明打算提供檢測(cè)動(dòng)物血清中新孢蟲抗體的存在/量或缺失的方法。因此，含有測(cè)定試劑(assay)和陽(yáng)性和/或陰性反應(yīng)對(duì)照，和其他必需成分的診斷測(cè)定試劑盒可以按照本發(fā)明所講授來(lái)組合。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，在不背離廣義描述的本發(fā)明的精神或范圍情況下，可以對(duì)具體實(shí)施方案所示的本發(fā)明進(jìn)行許多變動(dòng)和/或修改。因此，這些實(shí)施方案在各個(gè)方面只作說(shuō)明而不是限制。
實(shí)施例1新孢蟲血清反應(yīng)陰性動(dòng)物和新孢蟲接種動(dòng)物的抗血清可以使用任何血清反應(yīng)陰性或PCR陰性動(dòng)物的血清樣品，該動(dòng)物隨后接受新孢蟲速殖子(tachyzoite)為基礎(chǔ)的改良活疫苗，滅活的或亞單位為基礎(chǔ)的疫苗。在本實(shí)施例中，經(jīng)有資格的獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室(Washington StateDiagnostic Lab，Pullman，WA)用診斷性ELISA試驗(yàn)判定4個(gè)月齡小牛是血清反應(yīng)陰性。將小牛在0天和21天用基于速殖子的i)改良的、活的、減毒新孢蟲疫苗(USPTO專利申請(qǐng)第09/260,414號(hào)“減毒活新孢蟲疫苗”，在此引入以作參考)，或者ii)滅活的、全細(xì)胞勻漿物新孢蟲疫苗(USPTO專利申請(qǐng)第09/138,985號(hào)“新孢蟲疫苗”，在此引入以作參考)接種。兩種疫苗都是基于速殖子抗原的，以該抗原作為疫苗的保護(hù)成分。新孢蟲改良的、活的、減毒疫苗每劑含有5×107Ncts-8個(gè)速殖子并且皮下給予3個(gè)血清反應(yīng)陰性動(dòng)物。新孢蟲滅活的勻漿物疫苗每劑含有100ug總速殖子蛋白，配制在皂角甙為基礎(chǔ)的佐劑中(750ug Quil A/150ug膽固醇)并經(jīng)皮下給予3個(gè)血清反應(yīng)陰性動(dòng)物。接種后49和119天，將每種疫苗組的3個(gè)小牛的血清收集，匯集并分裝凍存于-20℃直至進(jìn)行血清學(xué)測(cè)定試驗(yàn)(參見(jiàn)實(shí)施例4)。
實(shí)施例2新孢蟲自然感染的，血清反應(yīng)陽(yáng)性動(dòng)物的抗血清可以使用任何自然感染的，血清反應(yīng)陽(yáng)性或PCR陽(yáng)性動(dòng)物的血清樣品。在本實(shí)施例中，經(jīng)有資格的獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室(Washington State Diagnostic Lab，Pullman，WA)用診斷性ELISA試驗(yàn)判定所購(gòu)牛群中每個(gè)動(dòng)物的血清學(xué)狀態(tài)。將該試驗(yàn)報(bào)告為血清反應(yīng)陽(yáng)性的21個(gè)動(dòng)物進(jìn)行鑒定。將每個(gè)血清反應(yīng)陽(yáng)性動(dòng)物的血清樣品收集，匯集，并分裝凍存于-20℃直至進(jìn)行血清學(xué)測(cè)定試驗(yàn)(參見(jiàn)實(shí)施例4)。
實(shí)施例3新孢蟲血清學(xué)試驗(yàn)使用的慢殖子抗原可以使用任何純化的，天然的或重組的新孢蟲或剛地弓形體慢殖子蛋白(剛地弓形體慢殖子蛋白BAG1；Genebank編號(hào)U23944)。在本實(shí)施例中，使用剛地弓形體慢殖子抗原，BAG1(本領(lǐng)域也稱作BAG5)的兩種不同的重組制備的形式。第一種形式是用親和層析從大腸桿菌表達(dá)和純化的全長(zhǎng)BAG1-谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白(S.F.Parmley，et.al.1995.Mol.Biochem.Parasit.73253-257，在此引入以作參考)。第二種形式是用親和層析從大腸桿菌表達(dá)和純化的、缺少頭28個(gè)氨基酸的截短的BAG1-GST融合蛋白(Parmley et al.，1995)。將純化的、重組的全長(zhǎng)BAG1-GST和截短的BAG1-GST蛋白凍存在-20℃直至進(jìn)行血清學(xué)測(cè)定試驗(yàn)(實(shí)施例4)。
實(shí)施例4血清學(xué)試驗(yàn)可以使用任何本領(lǐng)域已知的以抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè)試驗(yàn)(ELISA，競(jìng)爭(zhēng)ELISA，RIA，Western印跡等等)。在本實(shí)施例中，使用Western印跡測(cè)定。將總量5mg的剛地弓形體全長(zhǎng)BAG1-GST或截短的BAG1-GST蛋白溶解，與5×變性上樣緩沖液(Pierce，IL.)混合并上樣至預(yù)制的4-20％Tris-甘氨酸連續(xù)梯度凝膠(Novex，San Diego，CA)的1mm×2孔上。將凝膠按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書于125V電泳1.5小時(shí)。于25V持續(xù)1小時(shí)將凝膠印跡于20μM硝酸纖維素膜上(Bio-Read，Hercules，CA)。將膜干燥并切成同樣長(zhǎng)度/寬度的條。將這些條在封閉緩沖液(含5％脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(PBS))中室溫保溫過(guò)夜，用PBS洗滌，然后與血清檢測(cè)樣品(上面實(shí)施例1或2來(lái)源的)保溫。
將實(shí)施例1和2來(lái)源的分裝的血清檢測(cè)樣品在室溫溶解并用PBS配制成1∶200的新鮮制備的稀釋液。將天然的血清反應(yīng)陰性的母牛血清用作陰性對(duì)照(1∶200稀釋)?？谷L(zhǎng)BAG1-GST的兔抗血清用作陽(yáng)性對(duì)照(M.McAllister惠贈(zèng)；M.McAllister，et.al.，1996.J.Parasitol.82(2)354-355)并在使用前用PBS作1∶12,500稀釋。
將每個(gè)試驗(yàn)條(實(shí)施例3制備的)加入每個(gè)稀釋的血清樣品并于室溫保溫1小時(shí)。將所述條在含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)中短暫洗滌2次并加入親和純化的、磷酸酶標(biāo)記的山羊抗牛IgG 1∶400的PBS稀釋液(KPL，Gaithersburg，MD.)。于室溫保溫1小時(shí)后，將所述條在PBST中短暫洗滌2次，然后在磷酸酶底物BCIP/NBT(KPL，Gaithersburg，MD.)中保溫。適當(dāng)顯色后(大約10分鐘)將所述條短暫放于雙蒸水中終止酶反應(yīng)。然后將所述條在空氣中干燥。結(jié)果如圖1所示。
實(shí)施例5血清學(xué)試驗(yàn)的解釋血清學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性指示試驗(yàn)血清樣品和新孢蟲或剛地弓形體慢殖子抗原之間特異反應(yīng)的存在。在本實(shí)施例中，通過(guò)判定在全長(zhǎng)(大約55kDa)或截短的(51kDa)剛地弓形體BAG1-GST蛋白預(yù)期分子量處特異條帶的存在或缺失，來(lái)檢測(cè)實(shí)施例4中使用的條的特異反應(yīng)。
如圖1所示，泳道5，在與新孢蟲自然感染的牛匯集血清保溫的條中，存在大約52-55kDa的條帶，說(shuō)明在新孢蟲自然感染的血清反應(yīng)陽(yáng)性試驗(yàn)樣品和截短的BAG1-GST慢殖子抗原之間有特異反應(yīng)。相反，圖1的泳道3和4，未檢測(cè)到抗55kDa BAG1-GST蛋白的反應(yīng)，說(shuō)明新孢蟲接種的試驗(yàn)樣品缺乏特異反應(yīng)。
如圖2所示，泳道4和9，在與新孢蟲自然感染的牛匯集血清保溫的條中，存在大約52-55kDa條帶，說(shuō)明在新孢蟲自然感染的血清反應(yīng)陽(yáng)性試驗(yàn)樣品和截短的(泳道4)或全長(zhǎng)的(泳道9)BAG1-GST慢殖子抗原之間有特異反應(yīng)。相反，圖2的泳道2和7，用新孢蟲滅活疫苗免疫119天的母牛匯集抗血清未檢測(cè)到抗任何一種形式BAG1-GST蛋白的反應(yīng)。相似地，圖2的泳道3和8，用新孢蟲減毒疫苗免疫119天的母牛匯集抗血清未檢測(cè)到抗任何形式BAG1-GST蛋白的反應(yīng)。
本發(fā)明中描述的對(duì)剛地弓形體重組慢殖子抗原反應(yīng)的差異證明利用慢殖子抗原的血清學(xué)試驗(yàn)可以區(qū)分或診斷新孢蟲自然感染的和新孢蟲接種的動(dòng)物。源自新孢蟲(例如SEQ ID No.1或2)或新孢蟲(例如SEQID No.3或4)的任何純化的，天然的或重組的慢殖子抗原或其片段，可被用作此診斷試驗(yàn)的檢測(cè)抗原。任何源自新孢蟲自然感染的或新孢蟲接種的動(dòng)物的抗血清可被用作此診斷試驗(yàn)的試驗(yàn)樣品。
序列表<110>輝瑞產(chǎn)品公司(PFIZER PRODUCTS INC.)<120>新孢蟲的血清學(xué)檢測(cè)<130>PC23020A<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1219<212>DNA<213>剛地弓形體(Toxoplasma gondii)<220>
<221>CDS<222>(219)..(905)<220>
<221>CDS<222>(303)..(905)<400>1tgcttttgcc aaaggagacc tgtgtgcaga ggacttcgct gctaaaaagc agaagagtgc 60acggcgtgtg tagctcagtg gcatttcggg actcggtctt gcgtcgttcg cgactggacg 120tcgtcgtctg tgagagcgtc aaactaggga gaaggggcgg gccagagcgt tcggaaaatt 180atctgcaaag cccaggtccc gtatgatatt caaaaaag atg gcg ccg tca gca tcg 236Met Ala Pro Ser Ala Ser1 5cat ccg ccg gga gct tgt cca ccg gga tgt acc aag cat cct gct act 284His Pro Pro Gly Ala Cys Pro Pro Gly Cys Thr Lys His Pro Ala Thr10 15 20gcg aca gcc att tcc ccg agt gga gtg tgt ccc atg cgt gcg ttc cat 332
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Gly Ala Lys Gln Gln Ile Ser Val Lys195 200<210>4<211>672<212>DNA<213>新孢蟲(Neospora caninum)<400>4cccctttctt ctctccgttt caagatgagc aagctcagca cagacggcct gaagaaggcc 60atcggagaga tcttggaggg ctcgcgggaa aagaagagaa agttcgtgga gaccgtcgag 120cttcagatcg gtttgaagga ttacgacacc caaagagaca agcgtttcag cggaagcgtg 180aggcttccta acgtcccccg cccccgcatg cgcgtgtgcg tgatgggaga tgctgtgcat 240tgcgagcaag caaaggagct gggactggaa ttcatggacg tggaggctat gaagaagttg 300aacaagaaca agaagcttgt gaagaaactc gcacggaagt acgacgcttt cctggcctcg 360caagtgttga ttccgcagat cccccgtctc ctgggtccgg gtcttaacaa ggcgggcaaa 420ttcccgacgc ttatcactca caacgataag ctcgaggata agattcagga natcaagagc 480tcaatcaaat tccaactcag aaaggtgcct gtgcatggtg tcgccgtcng gcacgtcgac 540atgacggagg agcaactgcg cgtgaacctg acactggcca tcaacttcct tgtctctctg 600ctgaagaaga actggaacag cgtgagaacg ctgcacatca agagcaccat gggcaagcct 660cagcagattt ac 67權(quán)利要求
1.區(qū)分天然新孢蟲血清反應(yīng)陽(yáng)性動(dòng)物與用新孢蟲接種的動(dòng)物的一種方法，其包括從動(dòng)物獲得血清樣品和將該血清與剛地弓形體蛋白接觸并檢測(cè)血清結(jié)合抗體的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述剛地弓形體蛋白包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述剛地弓形體蛋白包含SEQ ID NO3的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述剛地弓形體蛋白是BAG-1。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述剛地弓形體蛋白是BAG-5。
6.權(quán)利要求1的方法，其中將所述蛋白附著于支持物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)用以證明結(jié)合抗體存在的蛋白的步驟用Western印跡進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)用以證明結(jié)合抗體存在的蛋白的步驟用放射免疫測(cè)定法進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1的方法，其中檢測(cè)用以證明結(jié)合抗體存在的蛋白的步驟用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括測(cè)定結(jié)合于所述蛋白的抗體的量。
11.對(duì)懷疑感染了新孢蟲的動(dòng)物的診斷方法，其包括從動(dòng)物獲得血清樣品和將該血清與剛地弓形體蛋白接觸并檢測(cè)血清結(jié)合抗體的存在。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述剛地弓形體蛋白包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或者SEQ ID NO3的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述剛地弓形體蛋白是BAG-1或者BAG-5。
14.檢測(cè)血清樣品中新孢蟲抗體的方法，其包括將該血清與剛地弓形體蛋白接觸并檢測(cè)血清中結(jié)合抗體的存在。
15.區(qū)分天然新孢蟲血清反應(yīng)陽(yáng)性動(dòng)物與用新孢蟲疫苗接種動(dòng)物的一種方法，其包括從所述動(dòng)物獲得血清樣品和將該血清與剛地弓形體蛋白片段接觸并檢測(cè)血清結(jié)合抗體的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及接種新孢蟲的動(dòng)物的血清學(xué)檢測(cè)，其通過(guò)將受試血清與能和新孢蟲反應(yīng)的蛋白質(zhì)作用來(lái)進(jìn)行。該蛋白可以是全長(zhǎng)的天然或重組新孢蟲或剛地弓形體慢殖子融合蛋白或者是截短的融合蛋白或者是它們的片段?？梢詫⒃摰鞍子糜谌魏未罅繙y(cè)定，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，放射免疫測(cè)定(RIA)，Western印跡和其他合適形式的免疫測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1639574SQ02821627
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2002年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月31日
發(fā)明者戴維·A·布雷克, 黛安娜·M·里特 申請(qǐng)人:輝瑞產(chǎn)品公司