專利名稱：：新孢子蟲減毒活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及致病原生動物新孢子蟲(Neospora)的減毒株以及抗新孢子蟲病(neosporosis)的活疫苗，所述疫苗是由減毒株制備得到的，它可用于預(yù)防哺乳動物的臨床疾病和流產(chǎn)。新孢子蟲是動物的致病性原生動物寄生蟲，近來人們已認(rèn)識到它是哺乳動物流產(chǎn)、新生兒死亡、先天感染和腦疾病的主要致病原。DubeyandLindsay，1993，ParasitologyToday，9452-458。犬新孢子蟲(N.caninum)感染狗，并先天性地感染幼犬，經(jīng)常導(dǎo)致癱瘓。已從自然感染的幼犬中分離到犬新孢子蟲的tachyzoite。LindsayandDubey，1989，J.Parasitol.75163-165。新孢子蟲是致使奶牛流產(chǎn)的主要原因，在山羊、綿羊和馬中也報道了與新孢子蟲相關(guān)的疾病的例子，即新孢子蟲病。盡管犬新孢子蟲在表面上與病原體即鼠弓形體(Toxoplasmagondii)相似，但從抗原和超微結(jié)構(gòu)上仍可以將犬新孢子蟲和鼠弓形體互相區(qū)分開。DubeyandLindsay，1993，文獻(xiàn)同上。而且，從流產(chǎn)的牛胎兒腦中分離新孢子蟲樣的原生動物寄生蟲，接著在體外培養(yǎng)，顯示出它在抗原和超微結(jié)構(gòu)上與鼠弓形體和Hammondiahammondi都有所不同，而與犬新孢子蟲最相似。Conrad等，1993，Parasitology106239-249。另外，對核的小亞單位核糖體RNA基因的分析表明在分離自牛和狗的新孢子蟲之間沒有核苷酸的差異，但它們與鼠弓形體相比顯示出一致的差異。Marsh等.，1995，J.Parasitol.81530-535。牛流產(chǎn)和先天疾病的新孢子蟲牛分離物的病原學(xué)作用已被證實。Barr等.，1994，J.Vet.Diag.Invest.6207-215。使用被犬新孢子蟲感染的近交BALB/c小鼠已開發(fā)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)新孢子蟲病的嚙齒動物模型。Lindsay等.，1995，J.Parasitol.81313-315。另外，Cole等.，1995，J.Parasitol，81730-732和Long等.，1996，J.Parasitol.82608-611分別描述了研究懷孕的遠(yuǎn)系繁殖和近交小鼠中犬新孢子蟲穿過胎盤傳染的模型。而且，與自然獲得的新孢子蟲誘導(dǎo)的牛流產(chǎn)很相似的實驗性的犬新孢子蟲矮小山羊模型已被闡明。Lindsay等.，1995，Am.J.Vet.Res561176-1180。WO9525541公開了牛新孢子蟲的生物學(xué)純培養(yǎng)物，檢測抗新孢子蟲抗體和新孢子蟲特異性核酸的方法以及含有牛新孢子蟲抗原和載體以用作疫苗的組合物。然而，WO9525541未教導(dǎo)新孢子蟲的減毒活培養(yǎng)物，或者由此制備的能夠在接種動物中激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的活疫苗。第一方面，本發(fā)明提供了得自新孢子蟲種病原親本株的一株的細(xì)胞培養(yǎng)物，該細(xì)胞與親本株的那些細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但是當(dāng)作為活疫苗施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答。第二方面，本發(fā)明提供了保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的疫苗，它含有免疫有效量的得自新孢子蟲種病原親本株的一株的活細(xì)胞和獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，該細(xì)胞與親本株的那些細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但是當(dāng)作為活疫苗施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的疫苗也可以進(jìn)一步含有一種或多種其他成分，包括例如佐劑。本發(fā)明的疫苗可以施用給對新孢子蟲引起的感染和疾病敏感的任何哺乳動物種，包括但不限于狗、奶牛、山羊、綿羊和馬。第三方面，本發(fā)明提供了由新孢子蟲的病原株制備減毒細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，該培養(yǎng)物用于保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的疫苗中，所述方法包括修飾得自新孢子蟲種病原親本株的細(xì)胞；選擇并克隆繁殖一個或多個與親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性的經(jīng)修飾細(xì)胞；并選擇和克隆繁殖一個或多個當(dāng)在活疫苗中被施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答的減毒細(xì)胞。第四方面，本發(fā)明提供了保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的疫苗的制備方法，所述方法包括修飾得自新孢子蟲種病原親本株的細(xì)胞；選擇并克隆繁殖那些與親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性但是當(dāng)在活疫苗中被施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答的經(jīng)修飾細(xì)胞；并以適于作為活疫苗施用給哺乳動物的形式將免疫有效量的減毒細(xì)胞與獸醫(yī)學(xué)可接受的載體相組合。第五方面，本發(fā)明提供了給哺乳動物接種以抗新孢子蟲病的方法，所述方法包括給哺乳動物施用免疫有效量的疫苗，該疫苗含有得自新孢子蟲種病原親本株的一株的活細(xì)胞和獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，所述細(xì)胞與那些親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但是當(dāng)作為活疫苗施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答。第六方面，本發(fā)明提供了聯(lián)合疫苗，它含有免疫有效量的得自新孢子蟲種病原親本株的一株的活細(xì)胞，該細(xì)胞與那些親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但是當(dāng)作為活疫苗施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答；一種或多種可激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗病或病原狀態(tài)的免疫應(yīng)答的其他抗原；和獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。聯(lián)合疫苗可進(jìn)一步含有一種或多種其他成分，包括例如佐劑。本申請人已發(fā)現(xiàn)新孢子蟲種的病原株的細(xì)胞可以被減毒，所得減毒細(xì)胞當(dāng)作為活疫苗施用時可以激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答。本發(fā)明因此提供了得自新孢子蟲種病原親本株的一株的細(xì)胞培養(yǎng)物，該細(xì)胞與那些親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但當(dāng)它作為活疫苗被施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在疫苗中使用的新孢子蟲種減毒細(xì)胞培養(yǎng)物的制備方法，所述疫苗可保護(hù)哺乳動物以抗新孢子蟲病，所述方法包括修飾得自新孢子蟲種病原親本株的細(xì)胞，例如，通過嚴(yán)格連續(xù)傳代或者暴露于誘變劑或者使用重組DNA技術(shù)的基因工程；選擇并克隆繁殖一個或多個與親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性的經(jīng)修飾細(xì)胞；并選擇和克隆繁殖一個或多個當(dāng)在活疫苗中被施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答的減毒細(xì)胞。本文所用術(shù)語“新孢子蟲病”是指哺乳動物由新孢子蟲種或株引起的感染，或是指與哺乳動物被新孢子蟲感染相關(guān)的任何臨床癥狀，狀況，事件或病理學(xué)。本文所用術(shù)語“減毒的”描述了與減毒細(xì)胞、培養(yǎng)物或株所來源的新孢子蟲親本株相比，體外或體內(nèi)的感染性或毒力表現(xiàn)出可測降低的新孢子蟲細(xì)胞、培養(yǎng)物或株。毒力的降低包含任何毒力標(biāo)志的任何可測的降低，包括體外或體內(nèi)的感染性，或者包含與感染相關(guān)的任何臨床癥狀或狀況的嚴(yán)重性或進(jìn)展速率的任何降低。術(shù)語“親本株”指的是當(dāng)施用于哺乳動物時，與通過一次或多次體內(nèi)或體外傳代和/或一個或多個減毒步驟由其得到的減毒株相比，表現(xiàn)出相對高水平病原性的新孢子蟲株。本發(fā)明進(jìn)一步包含新孢子蟲株細(xì)胞疫苗的制備和使用，所述新孢子蟲株得自對特殊的哺乳動物種無致病性的株或種，但該細(xì)胞被化學(xué)或遺傳方法修飾過，從而在該哺乳動物種的成員中都能激發(fā)保護(hù)性的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的活的減毒細(xì)胞在作為活疫苗被施用一次或多次后，能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答?！氨Ｗo(hù)性免疫應(yīng)答”的定義是任何免疫反應(yīng)，或者是抗體或者是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力，或者兩者都有，它們出現(xiàn)在哺乳動物中或者防止或者可檢測地降低隨后的感染，或者消除或者可檢測地降低嚴(yán)重性，或者可檢測地延緩與新孢子蟲病相關(guān)的一種或多種臨床癥狀或狀況進(jìn)展的速率。術(shù)語“免疫有效量”是指當(dāng)施用給哺乳動物時可激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗或抗原的量或劑量。新孢子蟲減毒株的制備既然本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即新孢子蟲病原株的細(xì)胞可以被減毒，所得減毒細(xì)胞當(dāng)作為活疫苗被施用時可激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答，那么本發(fā)明的實施不局限于任何特殊的減毒方法。相反，通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)或方法，包括但不限于嚴(yán)格連續(xù)傳代，或暴露于誘變劑，或通過使用重組DNA技術(shù)的基因工程，或一些它們的組合都可進(jìn)行新孢子蟲病原株細(xì)胞的減毒。通過將新孢子蟲病原株細(xì)胞在易感的宿主細(xì)胞中重復(fù)地體外傳代以進(jìn)行嚴(yán)格連續(xù)傳代直至充分減毒。傳代可在特殊的環(huán)境條件下進(jìn)行以選擇減毒細(xì)胞。例如，傳代可以在低于欲接種的哺乳動物的體溫的溫度下進(jìn)行，以選擇新孢子蟲的溫度-敏感型株，該株在疫苗中施與哺乳動物時不會生長，或僅以降低的速率生長。如本
技術(shù)領(lǐng)域：
中所述，將新孢子蟲細(xì)胞暴露于化學(xué)誘變劑或射線中都可進(jìn)行誘變。對本發(fā)明實施有用的化學(xué)誘變劑的一個非局限性例子是N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)(Sigma)，下文實施例1中描述了它的使用。輻射可從紫外線或電離輻射中選擇。對誘變劑的暴露程度，即化學(xué)誘變劑的濃度或輻射的水平以及暴露時間的長短優(yōu)選的量可導(dǎo)致產(chǎn)生一個或多個新孢子蟲的活細(xì)胞，該細(xì)胞表現(xiàn)出病原性水平的減弱，但當(dāng)它作為活疫苗施用給哺乳動物時可以激發(fā)抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可憑經(jīng)驗確定誘變劑所用的適當(dāng)參數(shù)。根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的技術(shù)，使用重組DNA技術(shù)也可使新孢子蟲的病原株減毒，本發(fā)明欲包含這種經(jīng)修飾的病原株以及由此制備的疫苗?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的重組DNA技術(shù)的非局限性例子包括基因置換或基因剔除以使一個或多個基因失去作用，從而得到病原性減弱的株?？梢允怪プ饔玫幕虬ɡ纾匦璧拇x基因，或編碼毒力因子的基因，或編碼在調(diào)制哺乳動物宿主的免疫應(yīng)答中起作用的表面抗原的基因。在新孢子蟲基因組中可用于定向破壞的必需的代謝基因的非局限性例子是二氫葉酸還原酶-胸苷酸合成酶(DHFR-TS)基因。Titus等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9210267-10271描述了剔除DHFR-TS基因以產(chǎn)生安全的利什曼原蟲屬(Leishmania)活疫苗，該文章并入作參考。通過破壞新孢子蟲的DHFR-TS基因，產(chǎn)生了需要胸腺嘧啶脫氧核苷以持續(xù)生長的營養(yǎng)缺陷型突變體，它表現(xiàn)出減弱的病原性，當(dāng)作為活疫苗被施用時，能激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答?，F(xiàn)有技術(shù)中已知基因置換或基因剔除的重組DNA技術(shù)，但不局限于那些利用同源重組的技術(shù)。例如新孢子蟲病原株的細(xì)胞可以被如質(zhì)粒的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，所述載體含有同源的核苷酸序列，它天然地側(cè)翼于或位于新孢子蟲株的例如必需的代謝基因中，優(yōu)選單拷貝基因。在同源核苷酸序列之間或當(dāng)中，載體可進(jìn)一步含有與病原株之核苷酸序列相對應(yīng)、但最終缺損的核苷酸序列，例如，與病原株序列相比其序列有一個或多個核苷酸“非-沉默”地改變或缺失。用載體轉(zhuǎn)化病原株細(xì)胞后，缺損的基因序列整合到新孢子蟲基因組中，它也可取代原始的或“野生型”序列。因此，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中定向的基因失去了功能，接著在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選病原性減弱的那些細(xì)胞，再在病原性減弱的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出當(dāng)作為活疫苗施用時可以激發(fā)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答的那些細(xì)胞。為了有助于轉(zhuǎn)化子的篩選，載體可以經(jīng)基因工程改造以進(jìn)一步含有報道基因產(chǎn)物或其他選擇性標(biāo)記的編碼序列。在本發(fā)明中有用的報道基因是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的，包括例如編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的基因或編碼熒光素酶的基因。報道基因的另一個非局限性例子是編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶的序列，它可被插入載體中，通過底物，如紅色的-β-D-吡喃半乳糖苷轉(zhuǎn)化成有色產(chǎn)物來檢測酶解活性，從而用于證實轉(zhuǎn)化子。Seeber和Boothroyd，1996，Gene，16939-45使用此報道酶以檢測鼠弓形體的轉(zhuǎn)化子，此文章被并入本文作參考。編碼在本發(fā)明中有用的選擇性標(biāo)記的編碼序列也是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，包括那些編碼賦予抗生素抗性或抗代謝產(chǎn)物抗性的基因產(chǎn)物的序列或提供營養(yǎng)缺陷型需求的序列。這種序列的例子包括那些賦予潮霉素，新霉素或腐草霉素抗性的序列。Messina等.，1995，Gene，165213-217提供了在不同病原體中使用的抗生素抗性標(biāo)記的例子，該文獻(xiàn)描述了在鼠弓形體中使用腐草霉素的抗性標(biāo)記以構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，該文獻(xiàn)已并入本文作參考。報道基因產(chǎn)物或選擇性標(biāo)記的任何編碼序列應(yīng)優(yōu)選與調(diào)節(jié)元件編碼序列有效相聯(lián)以插入載體中。本文所用的“調(diào)節(jié)元件”包括但不限于本領(lǐng)域已知的用于驅(qū)動和/或調(diào)節(jié)表達(dá)的可誘導(dǎo)和不可誘導(dǎo)的啟動子、增強(qiáng)子、操縱子和其他元件。而且如本文所用的DNA編碼序列與一個或多個調(diào)節(jié)元件“有效地相聯(lián)”，其中調(diào)節(jié)元件可有效調(diào)節(jié)和允許DNA編碼序列的轉(zhuǎn)錄和/或相對應(yīng)的mRNA的翻譯。例如，在新孢子蟲細(xì)胞中表達(dá)選擇性標(biāo)記ble的載體可通過在ble開放閱讀框(ORF)的側(cè)翼聯(lián)結(jié)新孢子蟲或密切相關(guān)的Apicomplexa，弓形體的基因調(diào)節(jié)區(qū)來構(gòu)建。不同的單拷貝新孢子蟲或弓形體基因的5’側(cè)翼區(qū)可被用來表達(dá)ble。單拷貝弓形體基因的例子是(i)SAG1，編碼主要的tachyzoite表面抗原p30(Burg等.，1988，J.Immunol.1413584-3591)，(ii)GRA1，編碼可分泌的蛋白質(zhì)p23(Cesbron-Delauw等.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.867537-7541)；和(iii)GRA2，編碼可分泌的蛋白質(zhì)p28(Mercier等.，1993，Mol.Biochem.Parasitol.5971-82)。單拷貝的新孢子蟲基因的例子包括(1)弓形體SAG1，GRA1和GRA2基因的同系物，例如以公開的弓形體序列為基礎(chǔ)，使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR法可鑒定之；(ii)編碼犬新孢子蟲tachyzoite主要細(xì)胞表面蛋白質(zhì)NC-p43的基因(Hemphill，1996，Infect.Immun.644279-4287)；和(iii)編碼免疫決定族17-，29-，30-和37kDa外泌/可分泌的蛋白質(zhì)的基因(Bierkas等.，1994，Clin.Diag.Lab.Immun，1214-221)。SAG1基因的3’側(cè)翼區(qū)可用于提供聚腺苷酸化序列。用于插入5’啟動子、ble基因和3’聚腺苷酸化序列的載體骨架可以是任何標(biāo)準(zhǔn)的，可商購的質(zhì)粒，如pBLUESCRIPTTM(Stratagene)。一旦適當(dāng)?shù)妮d體構(gòu)建完畢，可將之用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染一個或多個新孢子蟲親本株的細(xì)胞。可按照現(xiàn)有技術(shù)將載體導(dǎo)入細(xì)胞中，包括但不限于電穿孔法，微注射法，病毒轉(zhuǎn)染法，脂質(zhì)體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，微粒轟擊法等等。一旦載體被導(dǎo)入新孢子蟲細(xì)胞，被導(dǎo)入的編碼序列在宿主細(xì)胞基因組中的存在、整合和維持，或?qū)胄蛄性谒拗骷?xì)胞中游離都可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確證和監(jiān)測，所述技術(shù)包括但不限于Sounthern雜交分析；PCR分析，包括逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR)；對預(yù)期蛋白質(zhì)產(chǎn)物的免疫學(xué)或比色試驗；檢測標(biāo)記物基因功能的存在或缺失，如新的營養(yǎng)缺陷型的出現(xiàn)；或檢測病原性的減弱。特別適用于病原性原生動物的載體構(gòu)建，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子的選擇，宿主細(xì)胞表達(dá)等的例子描述于下列文獻(xiàn)中，它們都被并入本文作參考SeeberandBoothroyd，1996，上文；Titus等.，1995，上文；Messina等.，1995，Gene，165213-217；Sibley等.，1994，Prol.Natl.Acad.SciUSA，91；5508-5512；DonaldandRoos，1994，Mol，Biochem.Parasitol.，63243-253；Kim等，1993，Science，262911-914；Ryan等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908609-8613；SoldatiandBoothroyd，1993，Science，260349-352；EidandSollner-Webb，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，882118-2121；LeBoWitz等.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879736-9740；LeeandVanderPloeg，1990，Science，2501583-1586；Asbroek等.，1990，Nature，348174-175；CruzandBeverley，1990，Nature，348171-173；以及Laban等，Nature，343572-574。包括載體構(gòu)建，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子的選擇，宿主細(xì)胞表達(dá)等的基因重組一般技術(shù)被進(jìn)一步描述于Maniatis等.，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y，；Ausubel等.，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociates&amp;WileyInterscience，N.Y.；Sambrook等.，1989，MolecularCloningALaboratoryManual.2ndEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.；Innis等(eds)，1995，PCRStrategies，AcademicPress，Inc.，SanDiego，Ca.；以及Erlich(ed)，1992，PCRTechnology，OxfordUniversityPress，NewYork，此類文章被并入本文作參考。減毒步驟之后，從培養(yǎng)物中選擇呈現(xiàn)出一種或多種減弱的病原性指示的細(xì)胞，有限稀釋后克隆繁殖。這種指示的例子包括但不限于體外的新的溫度敏感型或新的營養(yǎng)缺陷型的出現(xiàn)，或者與被親本株感染相比，給哺乳動物施用了減毒株細(xì)胞后，毒力指示如感染性或嚴(yán)重性或一種或多種癥狀或狀況的進(jìn)展速率有所降低。對實施本發(fā)明有用的溫度敏感型的特殊、非局限性例子是其中減毒株細(xì)胞在32℃而不是在37℃生長的株。這種溫度敏感型株在32℃時會導(dǎo)致被感染宿主細(xì)胞的裂解，從而在宿主細(xì)胞單層上出現(xiàn)損傷或噬斑。當(dāng)在37℃下生長時，減毒株不會充分復(fù)制，因此在宿主細(xì)胞單層上不會產(chǎn)生噬斑。可從該屬的包括但不限于犬新孢子蟲的任何種的任何病原株中得到新孢子蟲的減毒株。可從中有效得到減毒株的犬新孢子蟲特殊病原株的非局限性例子是存在于被感染的MARC145猴腎細(xì)胞中的NC-1株，所述細(xì)胞得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，12301ParklawnDrive，Rockville，MD20852USA(ATCC入藏登記號為CRL-12231)。NC-1株還描述于Dubey等.，1988，J.Am.Vet.Med.Assoc.1931259-63(并入本文作參考文獻(xiàn))。另外，也可使用例如上述文獻(xiàn)中所描述的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)從呈現(xiàn)出新孢子蟲病臨床癥狀的受感染動物的組織、器官或體液中得到新孢子蟲的病原株。得自犬新孢子蟲NC-1株的活的減毒株的非局限性例子是存在于被感染的MARC145猴腎細(xì)胞中的NCTS-8，所述細(xì)胞得自ATCC(ATCC入藏登記號為CRL-12230)。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中描述的已知技術(shù)，通過用新孢子蟲株的tachyzoite感染任何可接受的細(xì)胞系，優(yōu)選感染哺乳動物細(xì)胞系即可在體外培養(yǎng)新孢子蟲的親本株和減毒株。新孢子蟲tachyzoites可在其中被培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞系包括例如人的包皮成纖維細(xì)胞(Lindsay等.，1993，Am.J.VetRes54103-106)；牛的心肺主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(Marsh等.，1995，見上文)；和牛的單核細(xì)胞(LindsayandDubey，1989，上文)等。例如可在人包皮成纖維細(xì)胞Hs68(ATCC入藏登記號CRL-1635)單層上培養(yǎng)犬新孢子蟲的tachyzoite(Lindsay等.，1993，見上文)。Bradyzoite也可類似地培養(yǎng)和制備。可在現(xiàn)有技術(shù)描述的幾種培養(yǎng)基的任一種中培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物，并維持被新孢子蟲感染的細(xì)胞培養(yǎng)物。例如，可在添加有10％(V/V)熱滅活的胎牛血清(FBS)或成年馬血清(ES)，2mML-谷氨酰胺，50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEMGibcoLaboratories，N.Y.)中生長被犬新孢子蟲的tachyzoite感染的牛心肺主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的固定單層培養(yǎng)物(Conrad等.，1993，見上文)?？梢栽诤?％(V/V)胎牛血清，1.0mM丙酮酸鈉，1×104U/ml青霉素，1×104μg/ml鏈霉素，5×10-2mM2-巰基乙醇和0.3mg/mlL-谷氨酰胺的RPMI1640(Gibco)(維持培養(yǎng)基)中維持人包皮成纖維細(xì)胞Hs68的單層?？稍谥挥刑ヅＱ逶鲋?0％(V/V)的同一培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)中維持被新孢子蟲感染的人包皮成纖維細(xì)胞Hs68的單層培養(yǎng)物?，F(xiàn)有技術(shù)中已知具有新營養(yǎng)缺陷型的新孢子蟲減毒株需要經(jīng)適當(dāng)修飾的培養(yǎng)基以支持生長。一般在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件下，如37℃和5％CO2維持經(jīng)新孢子蟲感染的哺乳動物細(xì)胞的單層培養(yǎng)物。當(dāng)培養(yǎng)物中70-90％的哺乳動物細(xì)胞已被感染時，Tachyzoite一般傳代給未被感染的單層培養(yǎng)物，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過顯微鏡可以測定。通過使用允許tachyzoite保持活力的任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)裂解宿主細(xì)胞，并通過例如過濾或者離心收集tachyzoite，可從被感染的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中收集到tachyzoite。疫苗的制備和使用本發(fā)明提供了抗新孢子蟲病的疫苗，它含有免疫有效量的得自新孢子蟲種病原親本株的一株的活細(xì)胞和獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，所述細(xì)胞與那些親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但當(dāng)它作為活疫苗施用給哺乳動物時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答。本發(fā)明進(jìn)一步提供了保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的疫苗的制備方法，該方法包括修飾得自新孢子蟲種病原親本株的細(xì)胞；選擇并克隆繁殖那些與親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但當(dāng)其在活疫苗中被施用時可激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答的修飾細(xì)胞；并以適于作為活疫苗施用給哺乳動物的形式將免疫有效量的減毒細(xì)胞與獸醫(yī)學(xué)可接受的載體相組合。本發(fā)明進(jìn)一步提供了給哺乳動物接種以抗新孢子蟲病的方法，所述方法包括給哺乳動物施用免疫有效量的疫苗，該疫苗含有得自新孢子蟲種病原親本株的一株的活細(xì)胞和獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，所述細(xì)胞與那些親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但是當(dāng)作為活疫苗施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的疫苗含有新孢子蟲減毒株的活細(xì)胞，或作為單個抗原成分，或與一種或多種其他抗原組合，所述其它抗原可激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗與新孢子蟲病可能相關(guān)或不相關(guān)的疾病或病原狀態(tài)的免疫應(yīng)答。因此本發(fā)明進(jìn)一步提供了組合疫苗，它含有免疫有效量的得自新孢子蟲種病原親本株的一株的活細(xì)胞，該細(xì)胞與那些親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但是當(dāng)作為活疫苗施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答；一種或多種可激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗病或病原狀態(tài)的免疫應(yīng)答的其他抗原；和獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。組合疫苗可進(jìn)一步含有一種或多種其他成分，包括例如佐劑。疫苗一般經(jīng)腸胃外途徑施用，例如皮下或肌內(nèi)注射。然而疫苗也可經(jīng)腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射或通過其他途經(jīng)施用，包括口服、鼻內(nèi)、直腸或陰道施藥，可根據(jù)疫苗施用的位置選擇適當(dāng)?shù)墨F醫(yī)學(xué)可接受的載體。疫苗可簡單地含有以培養(yǎng)物液體形式存在的減毒細(xì)胞，它可直接施予哺乳動物?；蛘撸呙缫部珊信c獸醫(yī)學(xué)或藥學(xué)可接受的載體組合的減毒細(xì)胞，所述載體是根據(jù)施藥途徑及其維持細(xì)胞活力的能力從那些現(xiàn)有技術(shù)已知的載體中選擇出來的。這類載體的非限制性例子包括水、鹽水、緩沖的載體等等。適當(dāng)?shù)钠渌呙巛d體和添加物對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的，或者說是顯而易見的。例見Remington的PharmaceuticalScience，18thed.，1990，MackPublishing(并入本文作參考)。疫苗可進(jìn)一步含有一種或多種其他成分，例如，包括例如白介素-1的免疫調(diào)節(jié)劑，或者另一種免疫增強(qiáng)物質(zhì)，如獸醫(yī)學(xué)可接受的佐劑。佐劑的非限制性例子包括弗氏完全和不完全佐劑，礦物凝膠，包括例如氫氧化鋁和水包油或油包水的制劑?？筛鶕?jù)其維持減毒的新孢子蟲細(xì)胞活力的能力以及細(xì)胞在被接種的哺乳動物體內(nèi)激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力來選擇免疫調(diào)節(jié)劑?？勺鳛楸景l(fā)明疫苗中的佐劑的水包油制劑的非限制性例子包括以下乳劑1-3。乳劑1的組成是(a)ME6201(5％V/V角鯊烯，0.1％V/V維生素E和0.8％V/V吐溫TM80分散劑)；(b)QuilA(QA)皂草苷制品(Superfos)(200μg/ml)；和(C)膽固醇(chol.)(100μg/ml)。乳劑2的組成是(a)ME6201；和(b)Avridinelipoidalamine(1mg/ml)。乳劑3的組成是ME6210(5％V/V角鯊烯，1.0％V/V維生素E和0.8％V/V吐溫TM80分散劑)。通過常規(guī)方法可確定有效劑量，開始時給予低劑量的減毒細(xì)胞，然后加大劑量，同時監(jiān)測效果并系統(tǒng)地改變劑量。當(dāng)確定每只動物的最適劑量時需考慮多種因素，最先考慮的是種，動物的大小，年齡，動物的一般狀況，其他藥物的存在，動物被接種的新孢子蟲特殊株的毒力等等。考慮其他動物研究的結(jié)果之后即可優(yōu)選出實際的劑量。根據(jù)上述因素也可選擇出疫苗的施用方案?？稍谌魏螘r間給動物接種，包括在生育前片刻或在生育時接種。為了完備的保護(hù)，需要補(bǔ)充施用疫苗，或需要加強(qiáng)免疫。確定是否已達(dá)到足夠的免疫保護(hù)的一種方法是在接種后測定動物中血清轉(zhuǎn)變和抗體滴度。因此，依據(jù)幾種因素，包括例如其他動物中新孢子蟲病爆發(fā)的時間等，可在欲接種的特殊動物生命中的任一時間施用本發(fā)明的疫苗?？蓪⒁呙缡┯钄嗄唐诨蚋〉膭游铮蚴┯韪墒斓膭游?，例如以生育前疫苗形式施用可抵抗與新孢子蟲相關(guān)的先天疾病或流產(chǎn)。有效的接種僅需要初次接種，或初次接種與一次或多次加強(qiáng)接種相組合。加強(qiáng)接種可在初次接種后的任何時間給予，這取決于例如初次接種后的免疫反應(yīng)，疾病爆發(fā)的嚴(yán)重性，導(dǎo)致疾病爆發(fā)的新孢子蟲株的毒力，接種動物的健康狀況等等。接種時間的選擇和加強(qiáng)免疫的次數(shù)(如果有的話)優(yōu)選由獸醫(yī)根據(jù)所有相關(guān)因素(有些在上文有述)的分析來決定。用于疫苗的新孢子蟲細(xì)胞優(yōu)選為tachyzoite，但也可由bradyzoite或卵囊或其某些組合來代替。疫苗中減毒細(xì)胞的濃度優(yōu)選范圍約為1×103/ml至1×108/ml，更優(yōu)選約為2×106/ml至2×107/ml。適當(dāng)?shù)膭┝看笮≡诩s0.5ml至約1.0ml之間變化。一般對每個劑量而言，施予動物的減毒細(xì)胞數(shù)目優(yōu)選約為2×104至2×108；更優(yōu)選約2×105至2×107；最優(yōu)選約1×106至1×107。本發(fā)明的疫苗可保護(hù)哺乳動物抗由新孢子蟲引起的感染或疾病。此疫苗可用于保護(hù)懷孕和未懷孕的哺乳動物，包括但不限于牛、綿羊、公山羊、狗和馬以抗由新孢子蟲病引起的感染、臨床疾病或流產(chǎn)。術(shù)語“保護(hù)”是廣義的，它不局限于完全防止由新孢子蟲引起的感染，但包括感染性的降低，或由感染引起的疾病或狀況嚴(yán)重性的降低，包括一種或多種由感染引起的病理效果或癥狀的可觀察到的減輕，或一種或多種這類病理效果或癥狀進(jìn)展速率的可觀察到的延緩。本發(fā)明的疫苗也是安全的，即它不會導(dǎo)致被接種哺乳動物的疾病或明顯的副作用。下列實施例將進(jìn)一步闡明而不是限制本發(fā)明的組合物和方法。實施例1犬新孢子蟲溫度敏感型株的建立及在BALB/c小鼠中分析病原性此研究的目的是建立犬新孢子蟲的溫度敏感型株(NCTS)，并通過在已知對新孢子蟲病高度易感的BALB/c小鼠中分析血清抗體反應(yīng)，組織包囊和腦損傷的產(chǎn)生以及臨床癥狀的進(jìn)展來檢測這些溫度敏感型株的病原性。材料和方法按Lindsay和Dubey所述(1989，見上文)，通過有限稀釋將犬新孢子蟲NC-1株的tachyzoite(Dubey等.，1988，見上文)克隆兩次并維持在37℃。在25cm2燒瓶中繁殖tachyzoite并克隆于含有人包皮成纖維細(xì)胞Hs68(ATCC入藏登記號CRL-1635)單層的96-孔培養(yǎng)板中(Lindsay等.，1993，見上文)。Hs68細(xì)胞預(yù)先已在含有2％(V/V)胎牛血清，1.0mM丙酮酸鈉，1×104U/ml青霉素，1×104μg/ml鏈霉素，5×10-2mM2-巰基乙醇和0.3mg/mlL-谷氨酰胺的RPMI1640(維持培養(yǎng)基)中生長。在同一培養(yǎng)基中維持被感染的細(xì)胞培養(yǎng)物單層，只是其中胎牛血清增加到10％(V/V)(生長培養(yǎng)基)。分離一個克隆，在實驗室中將之命名為NC-1-2C系，但下文簡稱為NC-1株。通過暴露于含0.5μMN-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(Sigma)的生長培養(yǎng)基中達(dá)24小時使NC-1株的tachyzoite誘變，然后在32.5℃下在于維持培養(yǎng)基中的Hs68細(xì)胞中培養(yǎng)3mos，再通過有限稀釋克隆tachyzoite。最初分離了12個克隆。在32.5℃下，在維持培養(yǎng)基中將克隆維持于連續(xù)培養(yǎng)物中的Hs68細(xì)胞內(nèi)達(dá)8mos以上，然后選擇三個克隆以進(jìn)一步研究，它們被命名為NCTS-4，NCTS-8和NCTS-12(NCTS＝犬新孢子蟲，溫度敏感型)。按下述進(jìn)行小鼠的血清學(xué)試驗。使用間接的免疫熒光抗體試驗(IFAT)(Dubey等.，1988，見上文)以分析小鼠的血清中抗犬新孢子蟲抗體的存在。在免疫接種研究中，在攻擊接種前片刻得到小鼠血清，還從在病原性實驗中存活的所有小鼠中得到血清。從1∶50開始雙倍稀釋以檢測血清并終點滴定之，tachyzoite被用作抗原。陽性樣品出現(xiàn)完全的tachyzoite表面熒光，陰性樣品未出現(xiàn)熒光或僅有前面的殘余熒光。按下述測定被犬新孢子蟲不同株攻擊的小鼠腦損傷的存在。對每只小鼠進(jìn)行尸檢以取出腦，先取一半在10％V/V的中性緩沖的福爾馬林溶液中固定以作組織病理學(xué)檢查。使用常規(guī)的組織學(xué)技術(shù)制備組織切片，用蘇木精和伊紅染色以在顯微鏡下檢測損傷的存在。按照Lindsay等.，1995，J.Parasitol.81313-315所述的標(biāo)準(zhǔn)對蘇木精-和伊紅-染色的腦組織切片的損傷進(jìn)行評分。炎癥/壞死的病灶的數(shù)目評分無病灶11-5病灶26-10病灶3＞10病灶4病灶的平均大小評分無1100-200μm2200-500μm3＞500μm4損傷的嚴(yán)重程度評分無損傷1輕微2輕度3中度4重度5使用上述列出的三個值可得到平均的損傷評分。正常的未被感染的小鼠腦平均損傷評分為3.0。使用Kruskal-Wallis非參數(shù)測驗以及無分布的多重對比法評價平均損傷得分。使用Fisher氏精確測驗檢查每組中帶損傷的小鼠數(shù)目。以截斷值P＜0.05來確定統(tǒng)計學(xué)意義。使用特異于犬新孢子蟲的鼠單克隆抗體6G7與親和素-生物素過氧化物酶復(fù)合物(ABC)免疫組化試驗相聯(lián)合檢查每只小鼠的腦切片以檢測犬新孢子蟲時相(Cole等.，1993，J.VetDiag.Invest.5574-589)。將每只小鼠腦的另一半在酸性-胃蛋白酶中消化并用來接種哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物以檢測犬新孢子蟲組織包囊的存在。為了消化，將小鼠腦的另一半置于3mlHank平衡鹽溶液(HBSS)中，并兩次通過具有23孔徑針頭的注射器。在勻漿中加入3ml酸性-胃蛋白酶溶液(0.52g胃蛋白酶，0.50gNaCl，98.6mldH2O，1.4ml濃HCl，pH0.8)，并在37℃水浴中保溫10分鐘。離心除去酸性胃蛋白酶溶液，將代表完整的另一半腦的沉淀物接種于單個25cm2組織培養(yǎng)瓶中，該瓶中含有按上述培養(yǎng)的人包皮成纖維細(xì)胞Hs68的單層。30分鐘后，除去接種物，洗滌Hs68細(xì)胞單層，并在如上所述的新鮮維持培養(yǎng)基中保溫，然后檢查細(xì)胞培養(yǎng)物達(dá)30天以檢測犬新孢子蟲的存在(LindsayandDubey，1989，見上文)。按下述測定犬新孢子蟲的NC-1和三個選定的NCTS株，即NCTS-4，NCTS-8和NCTS-12的病原性。用HBSS(對照)，或用于HBSS中的犬新孢子蟲的NC-1，NCTS-4，NCTS-8或NCTS-12株中任一種的5×105tachyzoite(總體積為0.5至1.2ml)皮下接種BALB/c小鼠(8周齡，雌性)(HarlanSpragueDawley(HSD))。接種后(PI)42或56天尸檢以檢查存活小鼠(見表1)。對存活小鼠尸檢以收集血清。檢查這些小鼠腦的損傷評分和免疫組織學(xué)，如上所述將每只腦的一半用于酸性胃蛋白酶消化以測定組織包囊的存在。表1用犬新孢子蟲的NCTS-4，NCTS-8，NCTS-12或NC-1株的tachyzoite接種BALB/c小鼠的結(jié)果表2被犬新孢子蟲不同株接種的BALB/c小鼠的平均損傷評分a＝與對照(HBSS)顯著不同(p＜0.05)b＝與NCTS-4，NCTS-8和NCTS-12明顯不同(p＜0.05)。表3小鼠血清相互的抗體滴度結(jié)果僅在被NC-1株接種的BALB/c小鼠中出現(xiàn)臨床新孢子蟲病和死亡(表1)。受NC-1株感染后，10只BALB/c小鼠只有3只存活。NCTS-4，NCTS-8和NCTS-12株不會引起B(yǎng)LAB/c小鼠的死亡。平均的損傷評分示于表2。在被NCTS株接種的一些小鼠的腦中發(fā)現(xiàn)有損傷，但是當(dāng)與對照(HBSS)相比，平均的損傷評分沒有統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)將被NC-1株接種的小鼠與被HBSS(對照)或被犬新孢子蟲NCTS株中任一種接種的小鼠相比即可發(fā)現(xiàn)平均損傷評分和具損傷的小鼠數(shù)目的顯著差異。血清抗體滴度示于表3。在所有被NCTS株攻擊的小鼠中(30/30)檢測到顯著的IFAT滴度(≥400)。這表明NCTS株能在免疫功能完全但遺傳上易感的動物中刺激B-細(xì)胞應(yīng)答。在受NCTS攻擊的小鼠中IFAT滴度與受NC-1攻擊的小鼠相等，有些時候甚至比后者更高。使用如上所述的酸性胃蛋白酶消化技術(shù)在檢測的任一半腦中都未檢測組織包囊。這表明組織包囊如果存在，在被犬新孢子蟲NCTS或NC-1株接種的小鼠中數(shù)目也很少。實施例2在HSDLCR遠(yuǎn)系繁殖的小鼠中分析犬新孢子蟲NCTS株的病原性本研究的目的是在HSDICR遠(yuǎn)系繁殖的小鼠中測定犬新孢子蟲NCTS株的病原性，所述小鼠有免疫活性，它比近交的BALB/c小鼠對新孢子蟲有更強(qiáng)的抗性。材料和方法該實驗中使用HSDICR小鼠(4周齡，雌性)。除對照外，給所有HSDICR小鼠接種于HBSS中的犬新孢子蟲適當(dāng)株的5×105tachyzoite(總體積為0.5至1.2ml)。給對照小鼠僅接種HBSS。PI56天后處死所有存活的小鼠，收集血清以檢測IFAT。按上述收集這些小鼠的腦，先取一半用作損傷評分和免疫組織學(xué)分析，每只腦的另一半用于酸性-胃蛋白酶消化以檢測組織包囊。結(jié)果在HSDICR小鼠中，所測試的犬新孢子蟲株，包括NC-1，無一引起死亡(表4)，與未被攻擊的對照相比，具損傷的小鼠數(shù)目或平均損傷評分也無顯著差異(表5)。在組織或ABC-染色的切片中未觀察到腦的組織包囊。在細(xì)胞培養(yǎng)物中未分離到寄生蟲。表4用犬新孢子蟲NC-1，NCTS-4，NCTS-8或NCTS-12株的tachyzoite接種HSDICR小鼠的結(jié)果<p>存活小鼠的抗體滴度示于表6。在被NCTS株攻擊的大多數(shù)小鼠中(13/15)檢測到顯著的IFAT滴度(≥400)，這表明這些NCTS株在免疫功能完全但遺傳學(xué)上具抗性的動物中能夠誘導(dǎo)B-細(xì)胞應(yīng)答。在經(jīng)組織學(xué)、免疫組織學(xué)或通過使用酸性-胃蛋白酶消化法檢查的腦部分中未檢測到組織包囊。這些結(jié)果證實了上文實施例1中使用BALB/c小鼠所呈現(xiàn)的結(jié)果。實施例3在免疫抑制的HSDICR小鼠中分析犬新孢子蟲NCTS株的病原性本研究的第一個目的是在免疫抑制的HSDICR小鼠中測定犬新孢子蟲NCTS株的病原性。本研究的第二個目的是測定是否在37℃下將犬新孢子蟲NCTS株體外傳代后會回復(fù)突變到有病原性。材料和方法通過在接種后-7，0和7天肌內(nèi)施用2mg甲基強(qiáng)的松龍乙酸酯(MPA)(Upjohn-Pharmacia)使HSDICR小鼠(4周齡，雌性)受到免疫抑制。見LindsayandDubey，1989，JParasitology75772-779。在第0天用于HBSS中的NC-1，NCTS-4，NCTS-8或NCTS-12株中任一種，或被命名為NCTS-4-37，NCTS-8-37或NCTS-12-37的有潛在回復(fù)突變的對照中的一種的2×105tachyzoite(總體積為0.5至1.2ml)接種免疫抑制的HSDICR小鼠，隨后如上所述對小鼠進(jìn)行血清學(xué)，組織學(xué)和臨床檢查。檢查NCTS-4，NCTS-8和NCTS-12克隆回復(fù)突變至有病原性的情況方法是在37℃下培養(yǎng)88天(25個細(xì)胞培養(yǎng)物傳代數(shù))，接著接種到免疫抑制的HSDICR小鼠中(潛在的回復(fù)突變株被命名為NCTS-4-37，NCTS-8-37，NCTS-12-37)。結(jié)果犬新孢子蟲的NC-1，NCTS-4-37和NCTS-12-37株在免疫抑制的HSDICR小鼠中導(dǎo)致100％死亡(表7)。NCTS-4，NCTS-8，NCTS-12和NCTS-8-37株針對免疫抑制的HSDICR小鼠而言病原性較弱，僅導(dǎo)致0至20％死亡。平均損傷評分示于表8。在PI56天尸檢檢查的任何小鼠的酸性-胃蛋白酶消化物中都未觀察到tachyzoite。存活小鼠的抗體滴度示于表9。攻擊后56天在NCTS-4，-8和-12和NCTS-8-37小鼠中檢測到顯著的IFAT滴度(≥800)，這表明這些株在免疫抑制但遺傳學(xué)上有抗性的動物中能刺激B-細(xì)胞應(yīng)答。表7用犬新孢子蟲的NC-1，NCTS-4，NCTS-8，NCTS-12或其潛在的回復(fù)突變株的tachyzoite接種免疫抑制的HSDICR小鼠的結(jié)果</tables>*＝出于人道主義原因，將因臨床腦炎新孢子蟲病而垂死的小鼠無痛致死。表8被犬新孢子蟲不同株接種的免疫抑制HSDICR小鼠的平均損傷評分a＝與對照(組16)明顯不同(P＜0.05)。表9小鼠血清的相互抗體滴度aa＝所有滴度是在PI56天時測定的。對于免疫抑制的HSDICR小鼠而言，NCTS株比NC-1，NCTS-4-37和NCTS-12-37株的病原性弱。被NCTS-8-37回復(fù)突變株接種的小鼠與被NCTS-4-37或NCTS-12-37回復(fù)突變株接種以致100％死亡的小鼠相比，呈現(xiàn)出相對高的存活率(4/5)，這表明在37℃連續(xù)傳代之后，NCTS-8-37回復(fù)突變株保留了減弱的病原性。基于被闡明的減弱病原性的保留，如下所述選擇犬新孢子蟲NCTS-8株作為有優(yōu)勢的候選疫苗并用作進(jìn)一步研究。實施例4給BALB/c小鼠接種以抗犬新孢子蟲誘導(dǎo)的腦炎本研究的第一個目的是確定用犬新孢子蟲的活的溫度敏感型株接種是否能提供對抗由病原株如犬新孢子蟲NC-1株隨后攻擊引起的疾病的保護(hù)作用。本研究的第二個目的是確定用殺死的(冷凍)NCTS-8tachyzoite接種BALB/c小鼠提供給被犬新孢子蟲NC1株隨后攻擊之小鼠的保護(hù)作用的水平。材料和方法用HBSS(對照)(0.5ml)或于HBSS中的NCTS-8株5×105活tachyzoite(0.5ml)或于HBSS中的2×106殺死的(冷凍)tachyzoite(0.5ml)(表10)皮下注射BALB/c小鼠(9周齡，雌性)以接種。用與初次注射相同的材料在PI21天對接種動物加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后14天，通過皮下施用于HBSS中的犬新孢子蟲NC-1株1×106tachyzoite或只施用HBSS(對照)(總體積為0.5ml)以攻擊小鼠。如上文所述，使用IFAT檢測實驗中存活的小鼠的血清以確定抗犬新孢子蟲抗體的存在。尸檢每只小鼠以取出腦。如上文所述，將一半用于組織病理學(xué)和免疫組織學(xué)研究，另一半用于酸性-胃蛋白酶消化。如上文所述，通過接種人包皮成纖維細(xì)胞Hs68單層培養(yǎng)物以確定冷凍后tachyzoite的活力。結(jié)果初次或加強(qiáng)接種后，所有試驗組中無一只小鼠死亡。經(jīng)NC-1tachyzoite攻擊后，被HBSS(對照)接種的10只小鼠中有2只死亡，被殺死的NCTS-8tachyzoite接種的10只小鼠中有3只死亡。存活小鼠的平均損傷分?jǐn)?shù)示于表11。存活小鼠的相互抗體滴度示于表12。在經(jīng)活的NCTS-8tachyzoite接種又經(jīng)加強(qiáng)免疫的小鼠中檢測到顯著的IFAT滴度(≥800)，這證實了上述結(jié)果。相反，被殺死的NCTS-8tachyzoite接種的任何小鼠在攻擊前沒有顯著的IFAT滴度，這表明殺死的tachyzoite在遺傳易感的宿主中未能誘導(dǎo)顯著的抗體反應(yīng)。用兩只虛假接種、攻擊小鼠(組24，小鼠1號和2號)和一只經(jīng)殺死的NCTS-8tachyzoite接種的小鼠(組31，小鼠5號)的經(jīng)酸性-胃蛋白酶消化的腦組織接種細(xì)胞培養(yǎng)物，從中分離犬新孢子蟲tachyzoite。在被任何其他小鼠腦組織接種的培養(yǎng)物中都未分離到tachyzoite。表10BALB/c小鼠的接種和攻擊方案</tables>表11被接種，攻擊的BALB/c小鼠的平均損傷評分</tables>a＝與組24+25有顯著不同(p＜0.05)b＝與組30+31有顯著不同(p＜0.05)表12攻擊前、后小鼠血清的相互抗體滴度被犬新孢子蟲NCTS-8株活的tachyzoite接種的小鼠沒有死亡，也沒有臨床疾病癥狀出現(xiàn)。被NCTS-8株的活的tachyzoite接種、隨后又被NC-1株的tachyzoite攻擊的小鼠(表11，組28+29)有損傷評分，該分?jǐn)?shù)與被NCTS-8株的活的tachyzoite接種、隨后又施用了HBSS的小鼠(表11，組26+27)的評分幾乎相同。這表明用NCTS-8株活的tachyzoite接種可提供實質(zhì)性的保護(hù)作用以抗由犬新孢子蟲NC-1株感染引起的疾病。用NCTS-8株的死的tachyzoite接種小鼠可提供很少的抗新孢子蟲病的保護(hù)作用(表11，組30+31)。實施例5用低劑量的犬新孢子蟲NCTS-8株接種BALB/c小鼠本研究的目的是測定低劑量的即5×104犬新孢子蟲NCTS-8株的tachyzoite是否可以提供抗繼后攻擊感染的保護(hù)作用。材料和方法用HBSS，或于HBSS中的犬新孢子蟲NCTS-8株的5×104tachyzoite(0.5ml)皮下接種BALB/c小鼠(7周齡，雌性)(表13)。tachyzoite的這一劑量是先前實施例中所用量的十分之一。接種后21天用與初次注射相同的材料加強(qiáng)免疫小鼠，加強(qiáng)免疫后14天用犬新孢子蟲NC-1株的1×106tachyzoite攻擊小鼠。如上所述，使用IFAT檢測實驗中存活的小鼠的血清以確定抗犬新孢子蟲抗體的存在。尸檢每只小鼠以取出腦。如上所述，將一半用于組織病理學(xué)和免疫組織學(xué)研究，另一半用于酸性-胃蛋白酶消化。結(jié)果用犬新孢子蟲NC-1株tachyzoite隨后攻擊后，一只對照小鼠(僅施用HBSS)死亡。用NC-1株的tachyzoite隨后攻擊后，被低劑量的犬新孢子蟲NCTS-8株tachyzoite接種的小鼠中未見有死亡。僅用HBSS虛假接種的對照小鼠與經(jīng)低劑量NCTS-8株接種的小鼠相比，平均損傷評分和具損傷的小鼠數(shù)目都顯著要高(表14)。相互抗體滴度示于表15中。表13低劑量接種和攻擊BALB/c小鼠的方案a＝與組36有明顯不同(P＜0.05)。表15攻擊接種前小鼠血清中相互抗體滴度實施例6含和不含佐劑的疫苗的效力此項研究的目的是確定在經(jīng)修飾的活的新孢子蟲疫苗中加入佐劑的作用，以及由此得到的抗新孢子蟲病的保護(hù)程度。材料和方法在先的體外結(jié)果(數(shù)據(jù)未示)表明，至少一種經(jīng)修飾的活的犬新孢子蟲株即NCTS-8的tachyzoite當(dāng)與幾種不同水包油制劑中的一種共同保溫時，可在體外保留部分活力和感染性?；谶@些體外結(jié)果，選擇三種特殊制劑作為佐劑以作體內(nèi)評價。在第0天(初次接種)和接種后21天(加強(qiáng)接種)，僅用HBSS(對照)，或用于HBSS中的犬新孢子蟲NCTS-8株5×105tachyzoite，或用于下列三種水包油乳劑之一的犬新孢子蟲NCTS-8株的5×105tachyzoite皮下接種(0.2ml)10只15周齡的雌性BALB/c小鼠的各組。乳劑1的組成是(a)ME6201(5％V/V角鯊烯，0.1％V/V維生素E和0.8％V/V吐溫TM80分散劑)；(b)QuilA皂草苷制品(QA)(Superfos)(200μg/ml)；和(C)膽固醇(chol.)(100μg/ml)。乳劑2的組成是(a)ME6201；和(b)Avridinelipoidalamine(1mg/ml)。乳劑3的組成是ME6201(5％V/V角鯊烯，1.0％V/V維生素E和0.8％V/V吐溫TM80分散劑)。表16試驗有和無佐劑的疫苗制劑的方案接種后35天，通過皮下施用于HBSS中的犬新孢子蟲NC-1株的1×106tachyzoite(0.2ml)以攻擊所有小鼠。接種后49和63天處死3至5只小鼠的各組以評價疫苗效力。從第0天開始，基于死亡和皮毛弄皺的外表，不規(guī)則的移動、下肢麻痹和全身虛弱來評價疾病。按下述進(jìn)行組織病理學(xué)分析。在第49天得到肺樣品，在10％(V/V)中性緩沖的福爾馬林中固定，使用常規(guī)的組織學(xué)技術(shù)將組織切片和染色。將經(jīng)蘇木精和伊紅染色的肺切片編碼，以不知道處理組的盲試方式給損傷評分。使用下列系統(tǒng)給肺炎損傷評分0＝無；1＝輕度；2＝中度；3＝顯著的；4＝嚴(yán)重的。結(jié)果經(jīng)含有犬新孢子蟲NCTS-8株tachyzoite和佐劑的制劑接種的小鼠相對于僅用HBSS接種的對照小鼠(56％)相比，用犬新孢子蟲NC-1株攻擊后輕度肺炎的發(fā)生率(33％)顯著較低(p＜0.01)。接種后9周檢查時，經(jīng)NCTS-8接種的未被攻擊的小鼠無一顯示出腦炎疾病或寄生蟲的任何跡象(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明施用NCTS-8不會產(chǎn)生臨床疾病。結(jié)果表明，含有減毒的活的新孢子蟲tachyzoite和佐劑的制劑用作抗新孢子蟲病疫苗至少與不含佐劑的同一制劑一樣有效和安全(表17)。表17施用了含或不含佐劑的疫苗、用犬新孢子蟲NC-1株攻擊后，對小鼠肺組織的組織病理學(xué)分析<實施例7使矮小山羊免受新孢子蟲病的保護(hù)作用本研究的目的是確定給矮小山羊接種犬新孢子蟲減毒的活株是否可以保護(hù)它以抗新孢子蟲病。更具體地說，檢測了含有犬新孢子蟲NCTS-8株活的tachyzoite的疫苗保護(hù)矮雌小雌山羊以抗新孢子蟲-誘導(dǎo)的流產(chǎn)的能力。材料和方法將年齡約為2-5歲的矮小雌山羊隨機(jī)安排到組A-E(表18)。每個非虛假疫苗接種的劑量(組A-C)由所示株的4×106tachyzoite組成。在第0天(初次)和第21天(加強(qiáng)免疫)皮下接種(10ml/劑量)后，在第28和39天，使用LUTALYSETM前列腺素制品(Upjohn-Pharmacia)使雌山羊同步(10mg/山羊，肌內(nèi)途徑)。在第52和56天之間，通過自然交配使雌山羊受孕。用超聲確定懷孕的雌山羊，當(dāng)攻擊發(fā)生時，雌山羊已懷孕41至55天。通過頸靜脈內(nèi)注射于無血清維持培養(yǎng)基中的犬新孢子蟲NC-1株4×106tachyzoite(0.45ml)以攻擊組A-D中的雌山羊。通過超聲，攻擊后的7天每天量體溫和每天肉眼觀察兩次以監(jiān)測雌山羊，攻擊后每周給雌山羊取一次血。表18懷孕的矮小雌山羊處理組結(jié)果接種了活的犬新孢子蟲NC-1株(組A)或活的減毒的犬新孢子蟲NCTS-8株(組B，C)的所有山羊在加強(qiáng)免疫后10天血清發(fā)生了轉(zhuǎn)變并且有可測的IFAT滴度(表19)。這些數(shù)據(jù)表明NC-1和NCTS-8對于懷孕的山羊是免疫原性的。組A的GMT比組B和C的高很多，暗示與減毒的NCTS-8株相比，NC-1株宿主中的復(fù)制有所增強(qiáng)。表20闡明含有活的減毒的新孢子蟲tachyzoite的疫苗保護(hù)矮小雌山羊抗新孢子蟲-誘導(dǎo)的流產(chǎn)的能力。被活的NC-1株接種(A)的所有4只雌山羊經(jīng)NC-1攻擊后都流產(chǎn)了(0％保護(hù))。被虛假接種(D)的6只雌山羊中的5只經(jīng)NC-1攻擊后流產(chǎn)(17％保護(hù))。相比之下，被NCTS-8接種(B)的5只雌山羊中僅有2只經(jīng)NC-1攻擊后流產(chǎn)(60％保護(hù))，被含佐劑的NCTS-8接種(C)的4只雌山羊中只有2只經(jīng)NC-1攻擊后流產(chǎn)(50％保護(hù))。這些結(jié)果闡明，通過接種活的，減毒的犬新孢子蟲NCTS-8株tachyzoite可實質(zhì)性地保護(hù)懷孕的矮小雌山羊以抗新孢子蟲-誘導(dǎo)的流產(chǎn)。這是首次闡明通過接種來自新孢子蟲病原株的活的減毒的tachyzoite可保護(hù)懷孕的哺乳動物以抗新孢子蟲誘導(dǎo)的流產(chǎn)。表19加強(qiáng)免疫后10天矮小雌山羊相互抗體滴度的幾何平均值(GMT)表20矮小山羊中由減毒活疫苗提供的抗由犬新孢子蟲誘導(dǎo)的胎兒流產(chǎn)的保護(hù)作用生物材料的保藏下列生物材料已于1996年11月6日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(12301ParklawnDrive，Rockville，MD.20852，USA)，它們的入藏登記號是1、于MARC145猴腎細(xì)胞中的犬新孢子蟲NC-1株，ATCC入藏登記號為CRL-12231。2、于MARC145猴腎細(xì)胞中的犬新孢子蟲NCTS-8株，ATCC入藏登記為CRL-12230。上文提到的所有專利，專利申請和文獻(xiàn)全部并入本文作參考。本發(fā)明不局限于所述特殊實施方案的范圍，該方案只欲闡明本發(fā)明單獨的方面。功能上等價的組合物和方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實上，根據(jù)前述內(nèi)容，對于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)，獸藥學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，除了本文所示和所描述的那些以外，對本發(fā)明的多種修飾是顯而易見的，這種修飾意欲包括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.得自新孢子蟲(Neospora)種病原親本株的一株的細(xì)胞培養(yǎng)物，該細(xì)胞與親本株的細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但當(dāng)作為活疫苗被施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答。2.權(quán)利要求1所要求的培養(yǎng)物，其細(xì)胞為溫度敏感型。3.權(quán)利要求1或2所要求的培養(yǎng)物，其中親本株的種是犬新孢子蟲。4.權(quán)利要求3所要求的培養(yǎng)物，其中犬新孢子蟲的親本株是NC-1，它存在于MARC145猴腎細(xì)胞中，ATCC入藏登記號為CRL-12231。5.權(quán)利要求4所要求的培養(yǎng)物，其中減毒的細(xì)胞株是NCTS-8，它存在于MARC145猴腎細(xì)胞中，ATCC入藏登記號為CRL-12230。6.保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的疫苗，它含有免疫有效量的來自新孢子蟲種病原親本株的一株的活細(xì)胞和獸醫(yī)學(xué)可接受的載體，所述細(xì)胞與親本株的細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但當(dāng)作為活疫苗被施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答。7.權(quán)利要求6所要求的疫苗，其中細(xì)胞如權(quán)利要求2至5中任一個所限定。8.權(quán)利要求6或7所要求的疫苗，進(jìn)一步含有佐劑。9.權(quán)利要求8所要求的疫苗，其中佐劑是水包油的乳劑。10.制備新孢子蟲種減毒細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，該培養(yǎng)物用于保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的疫苗中，所述方法包括修飾來自新孢子蟲種病原親本株的細(xì)胞；選擇和克隆繁殖一或多個與親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性的經(jīng)修飾細(xì)胞；并選擇和克隆繁殖一或多個當(dāng)在活疫苗中被施用時可激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答的減毒細(xì)胞。11.權(quán)利要求10所要求的方法，其中細(xì)胞如權(quán)利要求2至5中任一個所限定。12.制備保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的疫苗的方法，包括修飾來自新孢子蟲種病原親本株的細(xì)胞；選擇和克隆繁殖那些與親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但當(dāng)在活疫苗中被施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答的修飾細(xì)胞；并以適于作為活疫苗給哺乳動物施用的形式將免疫有效量的減毒細(xì)胞與獸醫(yī)學(xué)可接受的載體組合。13.權(quán)利要求12所要求的方法，其中細(xì)胞如權(quán)利要求2至5中任一個所限定。14.組合疫苗，它含有免疫有效量的來自新孢子蟲種病原親本株的一株的活細(xì)胞，該細(xì)胞與那些親本株細(xì)胞相比表現(xiàn)出減弱的病原性，但當(dāng)作為活疫苗被施用時能夠激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗新孢子蟲病的免疫應(yīng)答；一種或多種可激發(fā)保護(hù)哺乳動物抗疾病或病理狀態(tài)的免疫應(yīng)答的其他抗原；和獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。全文摘要本發(fā)明提供了病原性的原生動物寄生蟲新孢子蟲的減毒活培養(yǎng)物,以及由此制備的抗新孢子蟲病活疫苗,它可用于預(yù)防哺乳動物的臨床疾病和流產(chǎn)。文檔編號A61K39/00GK1190127SQ9712600公開日1998年8月12日申請日期1997年11月11日優(yōu)先權(quán)日1996年11月12日發(fā)明者D·A·布拉克,B·L·布拉本,D·S·林德塞申請人:輝瑞大藥廠,奧本大學(xué)