專利名稱：家蠶微孢子蟲孢壁蛋白swp32基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種來(lái)自于家蠶微孢子蟲孢壁上的與家蠶相互 作用的孢壁蛋白基因SWP32。
技術(shù)背景微孢子蟲(必'cro邵oric/i's)隸屬于原生生物界(尸rot/"a)、微孢子蟲門(#icrospora) (Levine and Corliss 1980)，近期研究表明微孢子蟲在進(jìn)化上與真菌有著緊密的親緣關(guān) 系。微孢子蟲近150個(gè)屬1300余種，是專營(yíng)細(xì)胞內(nèi)寄生，具有抗性極強(qiáng)的孢子，通過(guò)極 管刺入宿主組織細(xì)胞后將其孢原質(zhì)注入細(xì)胞，完成感染并大量增殖，最終破壞宿主組織。 它能廣泛寄生感染無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，尤其是極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的昆蟲、魚類、嚙齒類、 兔類、皮毛動(dòng)物、靈長(zhǎng)類以及家庭寵物如狗和鳥，引發(fā)疾病甚至死亡。其中家蠶微孢子蟲 (/fese/ag 60/^.KCi's)，能經(jīng)食下和胚種途徑寄生于家蠶，引發(fā)嚴(yán)重的傳染性微粒子病，最 終導(dǎo)致家蠶大規(guī)模死亡，給世界蠶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為近100年來(lái)影響蠶業(yè)生產(chǎn) 的難題。另外新發(fā)現(xiàn)，許多屬的微孢子蟲與人類疾病有關(guān)，如角膜病、角膜結(jié)膜炎、呼吸 疾病、前列腺肥大和擴(kuò)散感染、肝炎、腦炎、痢疾、肌炎、膽管炎等等，甚至還能機(jī)會(huì)性 地感染艾滋病(AIDS)患者、器官移植病人、服用免疫抑制劑藥物病人和先天性免疫機(jī)能 不健全者，引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和皮膚潰爛等惡性疾病，加劇病情，加速病人的死亡。 對(duì)于微孢子的治療已有報(bào)道，如煙曲霉素及它的衍生物抑制甲硫氨酸氨基肽酶2的活 性，阿苯達(dá)唑和苯丙咪唑能夠抑制微管蛋白形成，它們被鑒定為治療微孢子的有用藥劑， 然而，對(duì)于治療感染人類的多種微孢子仍沒(méi)有找到有效、安全的藥物。微孢子蟲能夠產(chǎn)生一種感染性的，能夠抵制環(huán)境的孢子，孢子彈出內(nèi)部極絲并將其內(nèi) 含物接種到臨近宿主細(xì)胞。孢子發(fā)芽機(jī)制一直吸引著微孢子蟲研究者們。近年來(lái)的研究表 明，在微孢子蟲受到外界刺激發(fā)芽之前，存在一個(gè)微孢子蟲孢子與宿主細(xì)胞相互接觸，以 提高宿主細(xì)胞感染率的過(guò)程，而微孢子蟲的孢壁蛋白在此過(guò)程中起著與宿主細(xì)胞相互識(shí)別 和粘附的作用，如果抑制了微孢子蟲孢子與宿主細(xì)胞的粘附作用，就可能降低了宿主細(xì)胞 的感染率甚至控制宿主細(xì)胞的感染，因此近年來(lái)微孢子蟲孢壁蛋白已成為該領(lǐng)域的研究焦 點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究和基因組數(shù)據(jù)分析，克隆分析和免疫學(xué)鑒定家蠶微孢子蟲 孢壁蛋白蛋白基因SWP32，通過(guò)對(duì)家蠶微孢子蟲孢壁蛋白基因的克隆，得到了孢壁蛋白 SWP32的編碼序列，具體方法如下(1) 引物設(shè)計(jì)根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法以及家蠶微孢子蟲的6倍基因組數(shù)據(jù)，獲得 孢壁蛋白SWP32編碼序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，在正向引物加入 BamHI酶切位點(diǎn)，在反向引物加入XhoI酶切位點(diǎn)。引物序列分別為SWP32-primer-F: 5， GCGGATCCATGAAAACTTCAGTGGTTATCC 3' SWP32-primer-R: 5， CCGCTCGAGGCATTGATAAGAACAGACC 3'(2) NbSWP32基因PCR擴(kuò)增由于微孢子蟲基因組的高度簡(jiǎn)化特點(diǎn)，內(nèi)含子很少， 基因組序列數(shù)據(jù)顯示SWP32基因不含內(nèi)含子，故利用提取的微孢子基因組直接作為模板， 采用基因組PCR擴(kuò)增目的片段。SWP32基因長(zhǎng)度為948 bp;(3) NbSWP32基因克隆NbSWP32擴(kuò)增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)載體上， 然后進(jìn)行序列測(cè)定，從而獲得NbSWP32的全長(zhǎng)編碼序列；(4) 序列分析將家蠶微孢子蟲NbSWP32與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)所登錄的蛋白質(zhì)庫(kù)同源比 對(duì)分析，表明NbSWP32無(wú)同源序列存在。序列分析結(jié)果見下表。ProteinSP/Lth (Aa)ESTNCBI homologueTMD Predicted N-glycosylat ion sitesPredicted phosphoryla tion sitespl/MM (闊HBM numberSWP32腦16Yesnono YesYes7.25/37.4(5)蛋白的鑒定將克隆的SWP32基因進(jìn)行原核表達(dá)，制備抗血清，利用免疫學(xué)的 手段免疫印跡、間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)和免疫電鏡對(duì)SWP32蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明SWP32 蛋白質(zhì)在家蠶微孢子蟲孢壁上特異性表達(dá)，而且為孢壁蛋白。上述方法獲得的NbSWP32基因編碼序列及其推斷的氨基酸序列如下 SWP32的序列1 atgaaaacttcagtggttatccttgcaatgeigctatattacatceiatctttgccaat組 MKTSVVILAMSYITSIFANNSYDFCDGEFAISEKDDKCGF 121 tcatttaatcc8tgtaccct3tataaacagatacaga肌gaatattcaa8ictgcgteata181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901SFNPCTLYKQIQKEYSNCVI ctcagattttaccttaaagcgattagtaacatgttagaaagtatctgtgacaacaacaaa LRFYLKAISNMLESICDNNKRCLPFSIDSLYRPLYNREOF aagcacaaacaccaccatactttgtacgctctcttcagaaattgcttatatcttgtcaacKHKHHHTLYALFRNCLYLVN ccaatttatttcaaagaataccaagatgctcttgcatgtaatcaattagatgtctgctacPIYFKEYQDALACNQLDVCY tttttaattagaagaacagtatgccctaagtatggagttacgaaatacatcgaatgtcttFLIRRTVCPKYGVTKYIECL aaaaagagatgtgaagataggtttgatgaaaaagaacttgctatctttatctgtgattcaKKRCEDRFDEKELAIFICDS gagacatttgtcaatatcaaacttgaaattgatgcttgcagaaaaatatgccccgctgatETFVNIKLEIDACRKICPAD tgtacacttgatatttgtaaaatatacagtcttgatttctgggagagaagagatttattgCTLDICKIYSLDFWERRDLL aaagcaatttttgattatcattactgccatgttttatcttctgacaatacaageigatgaaKAIFDYHYCHVLSSDNTRDE ataattaaaaagattgaagagatctatctaaatggaactgaaagagatataaaattcactIIKKIEEIYLNGTERDIKFT tcattcattatataccaacttttcactgatttagttgcatgcaaatcaagtgataaaaatSFIIYQLFTDLVACKSSDKNIKRILDLICLYEKKDKCPSG gtgatggttatgattgaattcttcgtaaaggtctgttcttatcaatgctaa VMVMIEFFVKVCSYQC本本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1) 微孢子蟲孢壁蛋白在孢子與宿主細(xì)胞相互粘附的過(guò)程中起著起要的作用，抑制 了孢子與宿主細(xì)胞之間的粘附能有效控制微孢子蟲的感染。孢壁蛋白SWP32基因具有與宿 主細(xì)胞結(jié)合的潛在基序。(2) 序列分析結(jié)果顯示孢壁蛋白SWP32基因均是家蠶微孢子蟲物種所特有的基因， 實(shí)驗(yàn)證明針對(duì)SWP32蛋白的抗體與其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，可以用于家蠶微孢子蟲的免疫 學(xué)檢測(cè)，為蠶業(yè)生產(chǎn)上微粒子病檢測(cè)手段帶來(lái)革命性的改變。
具體實(shí)施方式
-實(shí)施例根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法以及家蠶微孢子蟲的6倍基因組數(shù)據(jù)，通過(guò)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以及一系列的克隆與亞克隆，獲得了家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32基因編碼序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，在正向引物加入BamH I酶切位點(diǎn)，在反向引物加入 Xhol酶切位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)如下引物SWP32-primer-F: 5' GCGGATCCATGAAAACTTCAGTGGTTATCC 3, SWP32-primer-R: 5， CCGCTCGAGGCATTGATAAGAACAGACC 3' 從家蠶微孢子蟲基因組DNA上擴(kuò)增SWP32基因編碼序列，擴(kuò)增片段克隆到pMD18-T (TaKaRa)載體上，然后進(jìn)行序列測(cè)定，從而獲得SWP32基因的全長(zhǎng)編碼序列。將SWP32 基因不含信號(hào)肽的序列克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4Tl上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，純化表達(dá)產(chǎn)物； 將純化的表達(dá)產(chǎn)物作為抗原免疫小鼠制備抗血清；利用免疫學(xué)的手段免疫印跡、間接熒光 免疫實(shí)驗(yàn)和免疫電鏡對(duì)SWP32蛋白或家蠶微孢子蟲進(jìn)行鑒定、診斷。
權(quán)利要求
1、家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32基因，其特征在于其序列如下ATGAAAACTT CAGTGGTTAT CCTTGCAATG AGCTATATTA CATCAATCTT TGCCAATAAT60TCTTATGATT TCTGTGACGG AGAATTTGCT ATAAGTGAGA AAGATGATAA ATGTGGTTTC120TCATTTAATC CATGTACCCT ATATAAACAG ATACAGAAAG AATATTCAAA CTGCGTAATA180CTCAGATTTT ACCTTAAAGC GATTAGTAAC ATGTTAGAAA GTATCTGTGA CAACAACAAA240AGATGTTTAC CATTTTCTAT TGACTCCTTA TATCGTCCAC TTTACAACCG TGAACAATTT300AAGCACAAAC ACCACCATAC TTTGTACGCT CTCTTCAGAA ATTGCTTATA TCTTGTCAAC360CCAATTTATT TCAAAGAATA CCAAGATGCT CTTGCATGTA ATCAATTAGA TGTCTGCTAC420TTTTTAATTA GAAGAACAGT ATGCCCTAAG TATGGAGTTA CGAAATACAT CGAATGTCTT480AAAAAGAGAT GTGAAGATAG GTTTGATGAA AAAGAACTTG CTATCTTTAT CTGTGATTCA540GAGACATTTG TCAATATCAA ACTTGAAATT GATGCTTGCA GAAAAATATG CCCCGCTGAT600TGTACACTTG ATATTTGTAA AATATACAGT CTTGATTTCT GGGAGAGAAG AGATTTATTG660AAAGCAATTT TTGATTATCA TTACTGCCAT GTTTTATCTT CTGACAATAC AAGAGATGAA720ATAATTAAAA AGATTGAAGA GATCTATCTA AATGGAACTG AAAGAGATAT AAAATTCACT780TCATTCATTA TATACCAACT TTTCACTGAT TTAGTTGCAT GCAAATCAAG TGATAAAAAT840ATTAAAAGAA TCTTGGACTT GATTTGTCTT TACGAGAAAA AGGATAAATG TCCTTCTGGT900GTGATGGTTA TGATTGAATT CTTCGTAAAG GTCTGTTCTT ATCAATGCTA A 951。
2、家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于其序列如下:MKTSVVILAMSYITSIFANNSYDFCDGEFAISEKDDKCGFSFNPCT國(guó)IQKEYSNCVI60LRFYLKAISNMLESIC酬KRCLPFSIDSLYRPLYN卿FK服HHHTLYALFRNCLYLVN120PIYFKEYQDALA國(guó)LDVCYFLIRRTVCPKYGVTKYIECLKKRCEDRFDEKELAIFICDS180ETFVNIKLEID織KICPADCTLDICKIYSL訓(xùn)E,LLKAIFDYHYCHVLSSDNTRDE240I腦EEIYLNGTERDIKFTSFIIYQLFTDLVACKSSDKNIKRILDLICLYEKKDKCPSG300VMVMIEFFVKVCSYQC3160
全文摘要
一種家蠶微孢子蟲孢壁蛋白基因SWP32，依據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)的方法和家蠶微孢子蟲的6倍基因組數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)克隆與亞克隆得到編碼家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32編碼序列，并經(jīng)一系列生物技術(shù)克隆以及免疫學(xué)手段證實(shí)。本發(fā)明所獲得的家蠶微孢子蟲孢壁蛋白SWP32基因?yàn)榧倚Q微孢子蟲物種所特有，免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)表明針對(duì)NbSWP32蛋白的抗體與其他蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。該基因可用于家蠶微孢子蟲病的分子生物學(xué)、免疫學(xué)檢測(cè)，為蠶業(yè)生產(chǎn)上微粒子病的檢測(cè)帶來(lái)革命性的改變。
文檔編號(hào)C07K14/435GK101250538SQ20081006941
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日
發(fā)明者向仲懷, 周澤揚(yáng), 夏慶友, 潘國(guó)慶 申請(qǐng)人:重慶拓桑生物科技有限公司