專利名稱：穩(wěn)定的固定化酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定化技術(shù)，涉及一種對(duì)諸如環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)、葡糖淀粉酶(GA)、β-淀粉酶、β-葡糖苷酶(GD)和β-半乳糖苷酶對(duì)碳水化合物的作用而能增加至一定程度穩(wěn)定性的固定化酶。
如今對(duì)碳水化合物作用的酶廣泛地用于化學(xué)工業(yè)上。例如CGTase是一般用于商業(yè)規(guī)模上從淀粉中生產(chǎn)環(huán)糊精的酶。環(huán)糊精是生產(chǎn)籠形包含的化合物所必需的物質(zhì)。以改善藥物的穩(wěn)定性或掩蓋發(fā)出氣味的物質(zhì)。因此，將CGTase穩(wěn)定化的技術(shù)是具有極高的工業(yè)意義。
GA和β-淀粉酶系日常使用的用于從淀粉中生產(chǎn)葡萄糖或麥芽糖，因此，使GA和β-淀粉酶穩(wěn)定化也有極大的意義。
此外，β-葡糖苷酶是一種在木材糖化中起重要作用的酶并已試圖得到穩(wěn)定的產(chǎn)物等級(jí)。
最近在酶反應(yīng)技術(shù)中已取得了顯著的進(jìn)展，得到了“載然相反”的感覺(jué)，特別與較早的包括酶解反應(yīng)在溶液相內(nèi)進(jìn)行的常規(guī)方法相比較，固化酶技術(shù)已成為可能且可帶來(lái)較好的效果，使酶反應(yīng)有效地進(jìn)行且酶用量可以減少。
許多專利申請(qǐng)已公開了關(guān)于在固定酶方法中使用聚氨基葡糖珠。例如，日本公開專利Kokai Tokkyo Koho第63-196290號(hào)揭示了包括在多孔聚氨基葡糖珠上固定環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，然后再用交聯(lián)劑處理珠的技術(shù)。
人們對(duì)上述酶的有效使用已作了大量的研究。但是，就酶本身穩(wěn)定性而言，研究總是不能令人滿意。在酶被使用時(shí)它們逐漸失去了它們的活性。例如，在普通條件下CGTase在幾天后失去了其一半的最初活性，在相當(dāng)于幾個(gè)二十天后幾乎變得無(wú)活性了。
甚至對(duì)固定化酶而言，一旦它們失去了活性就沒(méi)有辦法只得補(bǔ)充新鮮部分。同時(shí)，本發(fā)明者以前已發(fā)現(xiàn)在相當(dāng)少量能穩(wěn)定酶的特定物質(zhì)(下面稱為“穩(wěn)定劑”)存在下進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)，該技術(shù)問(wèn)題可得到較好的解決(日本專利申請(qǐng)第033481/1989)。
上述技術(shù)確實(shí)認(rèn)識(shí)到了酶的穩(wěn)定性，但由于在酶反應(yīng)中穩(wěn)定劑必須以能與酶呈接觸的狀態(tài)進(jìn)量，故要求這類穩(wěn)定劑的進(jìn)料量相當(dāng)大。此外，在反應(yīng)完全后必須從反應(yīng)混合物中回收穩(wěn)定劑。
本發(fā)明的目的是解決上述的技術(shù)問(wèn)題。
本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的固化酶，它包括一種載體，對(duì)碳水化合物作用且可固定于所述載體上的酶，以及一種能與所述酶一起固定在所述載體上的酶穩(wěn)定劑。
本發(fā)明者首次制備了有上述構(gòu)成的固定化酶。
下面詳細(xì)闡述本發(fā)明的構(gòu)成。
在本發(fā)明中使用的載體可以是任何適合于使對(duì)碳水化合物作用的酶固定的載體，在這之中包括聚氨基葡糖珠(它一般是當(dāng)今用來(lái)生產(chǎn)固定化酶)、瓊脂糖樹脂和多孔的剛性合成樹脂。所述的樹脂可呈珠或扁平膜狀組成的形式。
作為可用于本發(fā)明的聚氨基糖珠的典型品位，可提及的是Chitopeael BCW-1000系列的聚氨基糖珠(從Fuji Spinning Co.買到)。
本發(fā)明中使用的瓊脂糖樹脂，可提及的是瓊脂糖凝膠6B(Pharmacia)。
能用于本發(fā)明的剛性合成的多孔樹脂的例子可提及從日本Organo Co.中買到的稱為EF-4611和EF-4612的親水性多孔聚合物。
在本發(fā)明的實(shí)際使用中，首先使載體與交聯(lián)劑反應(yīng)使在載體表面形成活性連接位點(diǎn)，然后使這里特定的酶固定在所述載體的所述位點(diǎn)上，即在交聯(lián)劑的末端上。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，穩(wěn)定劑和酶可同時(shí)被固定在載體的交聯(lián)劑末端上。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，也可以首先使酶固定在載體的交聯(lián)劑末端，然后再使穩(wěn)定劑固定在載體的交聯(lián)劑末端，反過(guò)來(lái)也可以。
所采用的交聯(lián)劑是環(huán)氧乙烷和其它含有環(huán)氧化物的碳鏈以及其它一般用來(lái)制備固定酶的交聯(lián)劑，例如戊二醛等。
當(dāng)CGTase作為酶的例子時(shí)，例如，通過(guò)在適當(dāng)溫度下(例如室溫)將適當(dāng)載體(例如聚氨基糖珠)加至適當(dāng)?shù)膲A性溶液內(nèi)(例如0.6N氫氧化鈉)，然后使適當(dāng)交聯(lián)劑(例如環(huán)氧乙烷)加至適當(dāng)濃度(例如與堿等當(dāng)量)，在適當(dāng)溫度(例如8-50℃)下使所得混合物輕搖適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如1-4小時(shí))，過(guò)濾混合物，用水洗滌載體，在水中或適當(dāng)?shù)木彌_液內(nèi)(例如0.025M乙酸鹽緩沖液，pH6.0)的載體中加入有適當(dāng)濃度(例如1-500mg/ml)的CGTase溶液和同時(shí)加入適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑(例如葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇)加至適當(dāng)濃度(例如0.9-1g/ml)，使所得混合物輕搖一段適當(dāng)時(shí)間(例如1-48小時(shí))，然后使混合物過(guò)濾，固相用水洗滌，這樣可產(chǎn)生本發(fā)明的穩(wěn)定的固定化酶。
本發(fā)明者首先建立了上述方法。
作為特別適用于本發(fā)明中的穩(wěn)定劑例子，可提及下式化合物及其葡萄糖低聚物衍生物
其中R是氫、低級(jí)烷基、羥基烷基、苯烷基、苯鏈烯基、苯炔基、苯氧基烷基、苯氧基鏈烯基或苯氧基炔基，這里每個(gè)苯基部分可以是取代苯基或未取代的苯基，X是氫或?yàn)檩S向或平展的羥基。
例如用日本專利公開第56-099195、60-2038、61-2076和62-242691號(hào)揭示的方法可制備現(xiàn)有技術(shù)已知的式[Ⅰ]化合物。
上述的葡萄糖低聚物衍生物可由下列代表
其中R的定義同上，n是0-24的整數(shù)，式[Ⅰ]和式[Ⅱ]中R表示的低級(jí)烷基是，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。
羥烷基中的烷基部分可含有1-5個(gè)碳原子。
苯烷基的烷基部分可含有1-5個(gè)碳原子，其苯基部分可以是取代苯基或未取代苯基，苯鏈烯基的鏈基部分可含有2-5個(gè)碳原子，其苯基部分可是取代苯基或未取代苯基。
苯炔基的炔基部分可含有2-5個(gè)碳子，其苯基部分可是取代苯基或未取代苯基。
苯氧烷基的烷基部分可含有1-5個(gè)碳原子，其苯基部分可以是取代苯基或未取代苯基。
苯氧鏈烯基的鏈烯基部分可含有2-5個(gè)碳原子，其苯基部分是取代苯基或未取代苯基。
苯氧基炔基的炔基部分可含有2-5個(gè)碳原子，其苯基部分是取代苯基或未取代苯基。
除了上述的α-環(huán)糊精外，本發(fā)明所使用的穩(wěn)定劑也可包括半乳糖氧化酶試劑(galactostatin)及其衍生物等。
根據(jù)本發(fā)明為了酶的穩(wěn)定化，可以提出的固定化可這樣進(jìn)行，例如使每克載體吸附1-50mg酶，且相對(duì)于每克載體，穩(wěn)定劑的存在量是10μg。穩(wěn)定劑的適當(dāng)用量視預(yù)期的目的而定。
作為下面給出的實(shí)施例中，本發(fā)明中穩(wěn)定劑的用量比常規(guī)方法中的用量要少得多，這是本發(fā)明的一個(gè)特征。


圖1表示試驗(yàn)實(shí)施例1中所得的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果[●，本發(fā)明實(shí)施例1中所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，是用相同的方法但未加入脫二氧亞胺基葡糖醇制備的物質(zhì)的數(shù)據(jù)(作為比較);縱軸，溶液的光密度;橫軸，時(shí)間(小時(shí))]。
圖2表示試驗(yàn)實(shí)施例2所得的結(jié)果。[●，本發(fā)明實(shí)施例1中所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同方法但未加入脫二氧亞胺基葡糖醇制備所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，殘留活性百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖3表示試驗(yàn)實(shí)施例3中所得的結(jié)果。[●，本發(fā)明實(shí)施例2中所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同的方法但未入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇比制備所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);(作用比較);縱軸，溶液的光密度;橫軸，時(shí)間(小時(shí))]。
圖4表示試驗(yàn)實(shí)施例4中所得的結(jié)果。[●，本發(fā)明實(shí)施例2中所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同的方法但未加入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇而制備所得物質(zhì)的數(shù)據(jù)，縱軸，殘留活性百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖5表示試驗(yàn)實(shí)施例5所得的結(jié)果。[●，本發(fā)明實(shí)施例3中所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇制備所得的物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，溶液的光密度;橫軸，時(shí)間(小時(shí))]。
圖6表示試驗(yàn)實(shí)施例6所得的結(jié)果。[●，本發(fā)明實(shí)施例4所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇制備所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，溶液的光密度;橫軸，時(shí)間(小時(shí))]。
圖7表示試驗(yàn)實(shí)施例7的所得的結(jié)果[●，本發(fā)明實(shí)施例5所得的物質(zhì)的數(shù)據(jù)，○，用相同方法但未加入N-(2-羥乙基)脫二氧亞胺基葡糖醇所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，溶液的光密度;橫軸，時(shí)間(小時(shí))]。
圖8表示試驗(yàn)實(shí)施例8所得的結(jié)果。[●，本發(fā)明實(shí)施例6所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同方法但不加入α-環(huán)糊精所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，溶液的光密度;橫軸，時(shí)間(小時(shí))]。
圖9表示試驗(yàn)實(shí)施例9所得的結(jié)果。[●，本發(fā)明實(shí)施例6所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同方法但不加入α-環(huán)糊精所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，殘留活性百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖10表示試驗(yàn)實(shí)施例10所得的結(jié)果。[●，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例7所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，殘留活性百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖11表示試驗(yàn)實(shí)施例11所得的結(jié)果。[●，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例8所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，殘留活性百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖12表示試驗(yàn)實(shí)施例12所得的結(jié)果。[●，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例9所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同的方法但不加入1-脫氧半乳糖氧化酶試劑(1-deoxggalactostatin)所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，溶液的光密度;橫軸，時(shí)間(小時(shí))]。
圖13表示試驗(yàn)實(shí)施例13所得的結(jié)果。[●，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例9所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同的方法但不加入1-脫氧半乳糖氧化酶試劑所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，殘留活性的百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖14表示試驗(yàn)實(shí)施例14所得的結(jié)果。[●，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例10所得的物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相似的方法但不加入1，4-dideoxy galaetosatin 1，4-二脫氧半乳糖氧化酶試劑所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，溶液的光密度;橫軸，時(shí)間(小時(shí))]。
圖15表示試驗(yàn)實(shí)施例15所得的結(jié)果。[●，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例10所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同方法但不加入1，4-二脫氧半乳糖氧化酶試劑所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，殘留活性的百分率;橫軸，溫度(℃)]。
圖16表示試驗(yàn)實(shí)施例16所得的結(jié)果。[●，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例11所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相似方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，溶液的光密度;橫縱，時(shí)間(小時(shí))]。
圖17表示試驗(yàn)實(shí)施例17所得的結(jié)果。[●，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例11所得物質(zhì)的數(shù)據(jù);○，用相同方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得物質(zhì)的數(shù)據(jù);縱軸，殘留活性的百分率;橫縱，時(shí)間(小時(shí))]。
下列實(shí)施例進(jìn)一步闡述了本發(fā)明的穩(wěn)定化的方法。
參比實(shí)施例1環(huán)氧活化的瓊脂糖珠將瓊脂糖6B放在玻璃濾器內(nèi)并抽吸過(guò)濾，使濾器上的物質(zhì)抽吸干燥。向10克這樣干燥的瓊脂糖內(nèi)加入10毫升環(huán)氧乙烷(Alolrich)和10ml 0.6N氫氧化鈉。在室溫下使混合物輕輕振搖16小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)?；厥罩椴⒂盟浞窒礈?。這樣所得的珠可用作環(huán)氧活化的瓊脂糖珠。
參比實(shí)施例2環(huán)氧活化的聚氨基糖珠將聚氨基糖珠(ψ1.5mm，10ml)放在玻璃濾器內(nèi)并用水充分洗滌。將環(huán)氧乙烷(10ml)和10ml 0.6N氫氧化鈉加至珠內(nèi)，在室溫下使混合物輕輕振搖16小時(shí)。用該方法進(jìn)行反應(yīng)后，珠用水充分洗滌，它可用作環(huán)氧活化的聚氨基糖珠。
實(shí)施例1向3克環(huán)氧活化的瓊脂糖珠中加入15ml 0.1N氫氧化鈉并再加入60mg脫二氧亞胺基葡糖醇。在40℃下使混合物輕輕振搖1小時(shí)，然后在玻璃濾器用水充分洗滌珠并使之分散于15ml水中，加入60mg粉末狀β-葡糖苷酶(從杏仁中獲得，δ)，在40℃下使混合物輕輕振搖20小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)。最后所得的結(jié)合有脫二氧亞胺基葡糖醇和β-葡糖苷酶瓊脂糖珠充分用水洗滌。
實(shí)施例2將環(huán)氧活化的瓊脂珠(2克)分散于10ml水中，向分散液中加入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇(2克)和40mg β-葡糖苷酶(δ)，在40℃下使混合物輕輕振搖20小時(shí)。用玻璃濾器通過(guò)過(guò)濾回收珠并用水充分洗滌。
實(shí)施例3將環(huán)氧活化的瓊脂糖珠(2克)分散于10ml水中，向分散液中加入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇(500mg)，和30mg葡糖苷酶(由酒曲菌雪白根霉菌中獲得的;Seikagku Kogyo)，在室溫下使混合物輕搖20小時(shí)，然后在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
實(shí)施例4
使環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(15ml)分散于10ml水中。向分散液中加入葡糖淀粉酶(從曲霉菌中獲得;Glncozyme NL-3，Amano Pharmaceutical)(50μl)和500mg脫二氧亞胺基葡糖醇。在室溫下使混合物輕搖20小時(shí)。反應(yīng)后，在玻璃濾器上收集珠并用水充分洗滌。
實(shí)施例5使環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(5ml)分散于5ml 0.1N氫氧化鈉中，將1gN-(2-羥乙基)脫二氧亞胺基葡糖醇加至分散液內(nèi)，在40℃下使混合物輕輕振搖20小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)。在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。將這些珠分散于5ml水中，向分散液中加入1ml葡糖淀粉酶(Amano Pharmaceutical)，在室溫下使混合物輕輕振搖16小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)，在玻璃濾器上收集珠并用水徹底洗滌。
實(shí)施例6向5克環(huán)氧活化的瓊脂糖珠內(nèi)加入50ml 0.1N氫氧化鈉以分散珠，使3克α-環(huán)糊精溶于分散液中，在40℃下使所得的分散液輕輕振搖24小時(shí)。在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌，然后分散于10ml水中。將葡糖淀粉酶(30mg;Seikgaku Kogyo)溶于分散液中，在40℃下使混合物再輕輕振搖20小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)，然后在玻璃濾器上收集并用水充分洗滌。
實(shí)施例7將環(huán)氧活化聚氨基葡糖珠(10ml)加至10ml 1N氫氧化鈉中，使10克葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇溶于分散液中，在40℃下使混合物輕輕振搖16小時(shí)。珠在玻璃濾器上充分洗滌并分散于氫氧化鈉水溶液調(diào)至pH10的10ml水中，加入10ml CGTase(從芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌中獲得，Hayashibara Biochemical Labs)，在40℃下使混合物輕輕振搖6小時(shí)。反應(yīng)后，在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
實(shí)施例8
將環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(10ml)加入至10ml水中，將2.5克葡糖基-N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇溶于該分散液中，再加入0.3毫升CGTase，在40℃下使所得的混合物輕輕振搖16小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)。然后在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
實(shí)施例9將環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(3ml)加入5ml水中，使250mg 1-脫氧半乳糖氧化酶試劑(l-deoxygalclostatin)和20mg β-半乳糖苷酶(從酒曲菌中獲得;Toyobo)溶于分散液中。在250℃下使混合物輕輕振搖16小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)。然后在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
實(shí)施例10將環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(3ml)加入至5ml水中，使500mg1，4-二脫氧半乳糖氧化酶試劑(1，4 dideoxyalaetostatin)和20mgβ-半乳糖苷酶(Toyobo)溶于分散液中。在250℃下使混合物輕輕振搖16小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)。然后在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
實(shí)施例11將環(huán)氧活化的聚氨基葡糖珠(3ml)加入至5ml 0.1N氫氧化鈉中進(jìn)行分散。使葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇溶于分散液中，在370℃下使所得的混合物輕輕振搖16小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)。在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。向珠內(nèi)加入β-淀粉酶萃取液[5ml;用70ml水萃取10g β-淀粉酶＃500而制得(Amano Pharmaceutical)]，在室溫下使混合物再輕輕振搖16小時(shí)以進(jìn)行反應(yīng)。然后在玻璃濾器上回收珠并用水充分洗滌。
用如下的方法來(lái)評(píng)估本發(fā)明的穩(wěn)定的效果。本發(fā)明的珠和對(duì)照珠的各自用量是這樣的，即在一般被推薦用來(lái)分析酶活力的樣品在37-40℃溫度下進(jìn)行測(cè)定，兩種珠顯示出基本相同程度的活性，同時(shí)再將珠轉(zhuǎn)移至高溫環(huán)境中后，和相應(yīng)的珠樣品比較各自活性損失情況。
試驗(yàn)實(shí)施例1將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1所得的物質(zhì)(50mg)和用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的200mg物質(zhì)(對(duì)照)各自放在相應(yīng)的試管中并各自分散在10ml 0.12M水楊苷溶液1在0.1M乙酸鹽緩沖液，pH5.0)。在58℃下培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間重復(fù)取樣，用葡萄糖氧化酶方法分析釋放出來(lái)的葡萄糖。所得的結(jié)果如圖1所示。它表明本發(fā)明的物質(zhì)的熱穩(wěn)定性優(yōu)于對(duì)照物質(zhì)的熱穩(wěn)定性。
試驗(yàn)實(shí)施例2將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1所得的物質(zhì)(25mg)和用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的40mg物質(zhì)(對(duì)照)各自放在相應(yīng)的試管中，向每個(gè)試管中加入750 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液，pH5.0)。使試管加熱到40℃-75℃范圍內(nèi)幾個(gè)特定溫度中的一個(gè)溫度并加熱30分鐘。加熱后，讓試管冷卻到室溫，向每個(gè)試管中加入250 μl 0.12M水楊苷(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)。在30℃下反應(yīng)30分鐘后，用葡萄糖氧化酶方法分析釋放出來(lái)的葡萄糖，以及在40℃下加熱處理后所得顏色強(qiáng)度的百分率稱為“殘留活性的百分率”。這樣所得的數(shù)據(jù)制成如圖2所示的圖。它表示本發(fā)明的物質(zhì)對(duì)熱是穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例3將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2所得的物質(zhì)(20mg)和用相似方法但不加入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的120mg物質(zhì)(對(duì)照)各自放在相應(yīng)的試管中且各自分散于10ml 0.12M水楊苷溶液中(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)。在58℃下進(jìn)行培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間重復(fù)取樣，用葡萄糖氧化酶方法來(lái)分析釋放出來(lái)的葡萄糖。所得的結(jié)果制成如圖3所述的圖。它表明本發(fā)明的物質(zhì)在熱穩(wěn)定性方面比對(duì)照的優(yōu)越。
試驗(yàn)實(shí)施例4將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2所得的物質(zhì)(6mg)和用相同方法但不加入N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的60mg物質(zhì)(對(duì)照)各自放在相應(yīng)的試管中，向每個(gè)試管中加入750 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH5.0)，使每個(gè)混合物在40℃-75℃范圍內(nèi)幾個(gè)特定溫度中的一個(gè)溫度下加熱30分鐘，然后冷卻到室溫。向每個(gè)試管中加入250 μl 0.12M水揚(yáng)苷溶液(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)，讓反應(yīng)在30℃下進(jìn)行30分鐘，用葡萄糖氧化酶方法分析釋放出來(lái)的葡萄糖，在40℃下熱處理后所得的顏色強(qiáng)度百分率作為“殘留活性的百分率”。所得的數(shù)據(jù)制成如圖4所示的圖。它表明本發(fā)明物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例5將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3所得的物質(zhì)(60mg)和用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇而制備的1mg物質(zhì)(對(duì)照)各自放在相應(yīng)的試管中，向每個(gè)試管中加入200 μl 0.021M對(duì)-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6.0)，在55℃下進(jìn)行培養(yǎng)。過(guò)了一定時(shí)間后，向每個(gè)試管中加入2ml 0.1M碳酸鈉，將混合物在2，000rpm下離心1分鐘，在400nm下測(cè)定上清液的光密度。這樣所得的結(jié)果如圖5所示。它表示本發(fā)明物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例6將本發(fā)明實(shí)施例4所得的物質(zhì)(100格令)和用相同方法但不加入脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的物質(zhì)(對(duì)照)(1格令)各自放在相應(yīng)的試管中，向每個(gè)試管中加入200 μl 0.021M對(duì)-硝基苯基α-D-吡喃(型)葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6.0)，在60℃下進(jìn)行培養(yǎng)。過(guò)了一定時(shí)間后，向每個(gè)試管中加入2ml 0.1M碳酸鈉并在400nm下測(cè)量光密度。這樣所得的數(shù)據(jù)制成如圖6所示的圖。它表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例7將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5所得的物質(zhì)(3格令)和用相同方法但不加入N-(羥乙基)脫二氧亞胺基葡糖醇而制得的物質(zhì)(對(duì)照)(2格令)各自放在相應(yīng)的試管中，向每個(gè)試管中加入200 μl 0.021M對(duì)-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH5.5)并在63℃下進(jìn)行培養(yǎng)。過(guò)了一定時(shí)間后，向每個(gè)試管中加入2ml 0.1M碳酸鈉，上清液用水適度稀釋，并在400nm下測(cè)量光密度。用該方法所得的數(shù)據(jù)制成如圖7所示的圖。它表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例8將本發(fā)明實(shí)施例6所得的物質(zhì)(1.5mg)和用相同方法但不加入α-環(huán)糊精而制得的3mg物質(zhì)(對(duì)照)各自放在相應(yīng)試管內(nèi)，向每個(gè)試管中加入200 μl 0.021M-對(duì)硝基苯基α-D-吡喃(型)葡萄糖苷和800 μl 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH6.0)并在55℃下進(jìn)行培養(yǎng)。過(guò)了一定時(shí)間后，向每個(gè)試管中加入20ml 0.1M碳酸鈉，所得的混合物在2，000rpm下離心1分鐘。在400nm下測(cè)定上清液的光密度。這樣所得的結(jié)果制成如圖8所示的圖。它表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例9將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例6所得的物質(zhì)(10mg)和用相同方法但不加入α-環(huán)糊精而制得的20mg物質(zhì)(對(duì)照)各自放入相應(yīng)試管內(nèi)，向每個(gè)試管內(nèi)加入1ml 0.05M乙酸鹽緩沖液(pH4.6)，使每個(gè)混合物在40-70℃范圍里幾個(gè)特定溫度中一個(gè)溫度下加熱30分鐘，然后冷卻到室溫。向每個(gè)試管中加入1ml 10%麥芽糖溶液。讓反應(yīng)在40℃下進(jìn)行20分鐘，然后加入2ml 0.1氫氧化鈉，從所得溶液中取出100 μl部分，用葡萄糖氧化酶方法分析釋放出來(lái)的葡萄糖，在40℃下熱處理后所得的顏色強(qiáng)度的百分率作為“殘留活性百分率”。這樣所得的數(shù)據(jù)如圖9所示。這表明本發(fā)明物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例10
將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例7所得的物質(zhì)(2格令)和用相同方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇來(lái)制得的物質(zhì)(對(duì)照)(10格令)各自放入相應(yīng)的試管中，向每個(gè)試管中加入500 μl 0.05M磷酸鹽緩沖液(pH6.2)。使每個(gè)試管在幾個(gè)特定溫度(60℃-75℃)的一個(gè)溫度下加熱30分鐘，然后冷卻至室溫。向試管中加入250 μl α-環(huán)糊精溶液(20mM)和蔗糖(100mM)在0.2M乙酸鹽緩沖液中的溶液(pH4.5)以及加入250 μl葡萄糖淀粉酶[通過(guò)使10mg葡萄糖淀粉酶(Seikagaku Kogyo)溶于1.5ml 0.2M乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中而制得]。使反應(yīng)在40℃下進(jìn)行30分鐘，用葡萄糖氧化酶方法來(lái)分析釋放出來(lái)的葡萄糖。在40℃下熱處理后所得的顏色強(qiáng)度的百分率被作為“殘留活性的百分率”。這樣所得的數(shù)據(jù)被制成如圖10所示的圖。它表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例11將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例8所得的物質(zhì)(500格令)和用相同方法但不加入葡糖基-N-甲基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得的物質(zhì)(50格令)各自放相應(yīng)的試管中，向每個(gè)試管中加入500 μl 0.05M磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，使每個(gè)試管在幾個(gè)特定溫度(60℃-75℃)下的一個(gè)溫度下熱加30分鐘。然后冷至室溫。向每個(gè)試管中加入250 μl α-環(huán)糊精(20mM)溶液和蔗糖(100mM)在0.2M乙酸鹽緩鹽液(pH4.5)中的溶液250 μl以及250 μl葡萄糖淀粉酶溶液[通過(guò)使10mg葡萄糖淀粉酶(Seikagaku Kogyo)溶于1.5ml 0.2M乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中而制得了]。讓反應(yīng)在40℃下進(jìn)行30分鐘，用葡萄糖氧化酶方法分析釋放出來(lái)的葡萄糖。在40℃下熱處理后所得的顏色強(qiáng)度百分率被稱為“殘留活性百分率”。這樣所得的數(shù)據(jù)如圖11所示。這表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例12
將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例9所得的物質(zhì)(1格令)和用相同方法但不加入1-脫氧半乳糖氧化酶試劑，所制得的物質(zhì)(對(duì)照)(1格令)各自放在相應(yīng)的試管內(nèi)，向每個(gè)試管中加入1.5ml 0.02M鄰-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)使每個(gè)混合物在65℃下培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，向每個(gè)試管中加入2ml 0.2M碳酸鈉。根據(jù)所形成的顏色強(qiáng)度，使對(duì)照混合物進(jìn)一步用水稀釋10倍。在420nm處測(cè)定光密度。這樣所得的結(jié)果如圖12所示。它表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例13將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例9所得的物質(zhì)(1格令)和用相同方法但不加入1-脫氧基半乳糖氧化酶試劑。所制得的物質(zhì)(對(duì)照)(1格令)各自放入相應(yīng)的試管中，向每只試管中加入1.5ml 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH5.0)，使每只試管在(50-70℃)的幾個(gè)特定溫度中的一個(gè)溫度下加熱30分鐘，然后冷至室溫。向每個(gè)試管中加入500 μl 0.02M鄰-硝基苯基 β-吡喃半乳糖苷溶液(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)，讓反應(yīng)在37℃下進(jìn)行15分鐘。向每個(gè)試管中加入0.2M碳酸鈉(2ml)在420nm處測(cè)定其光密度。在50℃下熱處理后所得的顏色強(qiáng)度的百分率作為“殘留活性的百分率”。所得的結(jié)果如圖13所示。它表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例14將本發(fā)明實(shí)施例10所得的物質(zhì)(8格令)和用相似方法但不加入1，4-二脫氧半乳糖氧化酶試劑所制得的物質(zhì)(對(duì)照)(1格令)各自放入相應(yīng)的試管內(nèi)，向每個(gè)試管中加入500 μl 0.02M鄰-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷溶液(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)和15ml 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH5.0)。使每個(gè)試管在65℃下培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，向試管內(nèi)加入2ml 0.2M的碳酸鈉，在420nm處測(cè)定其光密度。在光密度測(cè)量前根據(jù)所產(chǎn)生的顏色深度，用水使對(duì)照樣品稀釋10倍。這樣所得的結(jié)果如圖14所示。它表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例15將本發(fā)明實(shí)施例10所得的物質(zhì)(8格令)和用相似方法但不加入1，4-二脫氧基半乳糖氧化酶試劑所制得的物質(zhì)(對(duì)照)(1格令)各自放入相應(yīng)的試管中，向每個(gè)試管加入1.5ml 0.1M乙酸鹽緩沖液(pH5.0)，使每個(gè)試管在(50-70℃)的幾個(gè)特定溫度中的一個(gè)溫度下加熱30分鐘，然后冷卻至室溫，向每個(gè)試管中加入500 μl 0.02M鄰-硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷溶液(在0.1M乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)。讓反應(yīng)在37℃下進(jìn)行15分鐘后，向試管中加入2 μl 0.M磷酸鈉，在420nm處測(cè)量其光密度。在50℃下熱處理后所得的顏色強(qiáng)度的百分率被作為“殘留活性百分率”。所得的結(jié)果如圖15所示。它表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例16將本發(fā)明實(shí)施例11所得的物質(zhì)(2格令)和用相同的方法但不加入葡糖基二氧亞胺基葡糖醇所制得的物質(zhì)(10格令)(對(duì)照)各自放在相應(yīng)的試管中，向每個(gè)試管中加入2.5ml 0.02M乙酸鹽緩沖液(pH4.8)和2.5ml 10%可溶性淀粉溶液。在65℃下進(jìn)行培養(yǎng)，每間隔一定時(shí)間取出50 μl部分的樣品，向每個(gè)樣品中加入3，5-二硝基水楊酸溶液(500 μl)使混合物在沸水浴中加熱5分鐘，用水冷卻，接著再加入5ml水。經(jīng)充分?jǐn)嚢韬螅?35mm處測(cè)量所得混合物的光密度。這樣所得的結(jié)果如圖16所示。它表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
試驗(yàn)實(shí)施例17將本發(fā)明實(shí)施例11所得的物質(zhì)(5格令)和用相似方法但不加入葡糖基脫二氧亞胺基葡糖醇所制得的物質(zhì)(對(duì)照)(10格令)各自放入相應(yīng)試管內(nèi)，向每個(gè)試管中加入250 μl 0.02M乙酸鹽緩沖液(pH4.8)在(50-75℃)的幾個(gè)特定溫度中的一個(gè)溫度下加熱30分鐘，然后冷卻至室溫。向每個(gè)試管中加入250 μl 1%可溶性淀粉溶液，然后再在30℃下加熱30分鐘以進(jìn)行反應(yīng)。然后向混合物中加入1ml 3，5-二硝基水楊酸溶液，使混合物在沸水浴上加熱5分鐘。用水冷卻后，加入4.5ml水，充分?jǐn)嚢杷玫幕旌衔?，?3mm處測(cè)量光密度。在50℃下顏色強(qiáng)度的百分率是被作為“殘留活性的百分率”。這樣所得的數(shù)據(jù)制成如圖17所示的圖。它表明本發(fā)明的物質(zhì)是熱穩(wěn)定的。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定的固定化酶，其特征在于它包括載體、對(duì)碳水化合物作用且固定在所述載體上的酶以及能穩(wěn)定所述的酶的物質(zhì)，共同地固定在所述載體上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定的固定化酶，其特征在于其中的穩(wěn)定物質(zhì)是下式化合物或其葡萄糖低聚物衍生物
其中R是氫、低級(jí)烷基、羥烷基、苯烷基、苯烯基、苯炔基、苯氧基烷基、苯氧基烯基或苯氧基炔基，這里每個(gè)苯基部分可以是取代的苯基或未取代苯基，X是氫或是軸向的或平展的羥基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種穩(wěn)定的固定化酶，其特征在于其中的酶穩(wěn)定物質(zhì)是α-環(huán)糊精。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定的固定化酶，它包括載體、對(duì)碳水化合物作用且固定在所述載體上的酶以及能穩(wěn)定所述酶的物質(zhì)，共同地固定在所述載體上，其中的穩(wěn)定化合物是下式化合物或其葡萄糖低聚物衍生物。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1051587SQ9010888
公開日1991年5月22日 申請(qǐng)日期1990年10月31日 優(yōu)先權(quán)日1989年11月1日
發(fā)明者丸尾重昭, 宮崎克憲, 山田直義, 江連洋治 申請(qǐng)人:日本新藥株式會(huì)社