一種制備登革熱病毒ns1蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種制備登革熱病毒NS1蛋白的方 法。 技術(shù)背景
[0002] 登革熱病毒廣泛流行于熱帶，亞熱帶的100多個國家和地區(qū)，近年來由于全球人 口快速增長，人群的旅游增多和城市化進程的加快，氣候變暖，病毒流行株變化等因素，使 得登革熱病毒的感染成為全球尤其是熱帶，亞熱帶地區(qū)的重要傳染病之一。每年超過一億 人受感染，25億W上的人受到威脅，其中特別是年老體弱，幼兒感染者常常面臨生命威脅。 每年大約2. 2萬人死亡，由此構(gòu)成美洲，東南亞，西太平洋地區(qū)的主要疾病經(jīng)濟負擔，給人 類健康構(gòu)成了極大威脅。登革熱病毒的傳播已經(jīng)成為熱帶，亞熱帶地區(qū)的嚴重的公共衛(wèi)生 問題。
[0003] 登革熱病毒是小型黃病毒，屬于黃熱病毒屬，能引起登革熱急性傳染病，通常由叮 咬人的埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，登革熱病毒能夠引起一系列臨床癥狀，包括有生命危險 的失血性休克綜合癥和較少見的伴有肝衰與腦病的急性肝炎。感染登革熱病毒輕則突然發(fā) 熱，劇烈肌肉疼痛，骨關(guān)節(jié)痛，重則會出現(xiàn)內(nèi)臟大出血。高達50%的感染者會死亡。登革熱 的早期診斷，及時治療及登革熱疫苗的開發(fā)成為提高登革熱患者存活率的關(guān)鍵。
[0004] 登革熱病毒是登革熱，登革出血熱/登革休克綜合癥的病原體，其染色體RNA為單 股正向核糖核酸，由核小蛋白包被，外面由膜蛋白，外套膜蛋白兩個表面蛋白及磯脂的外套 膜蛋白包圍而成。病毒顆粒大小約為50nm，染色體RNA全長為llkilobases。登革熱病毒 核也為RNA與蛋白質(zhì)組成的20面立體對稱的病毒顆粒，外層為兩種糖蛋白組成的包膜，包 膜含有型和群特異性抗原，用中和試驗可鑒定其型別。病毒基因編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個 非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS化、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。3個結(jié)構(gòu)蛋白分別為E蛋白（包膜 蛋白）、C蛋白（核也殼蛋白）和M蛋白（胺蛋白）。E蛋白含有中和抗原和病毒的種、屬、型等 特異性表位，可誘導機體產(chǎn)生中和抗體、血凝抑制抗體。此外，E蛋白還可能引起抗體依賴 的增強感染作用（ADE)。C蛋白可能在蛋白質(zhì)和RNA的相互作用中發(fā)揮作用。M蛋白與病毒 感染能力的強弱有關(guān)。登革病毒可分為4個血清型（DEN-1，2, 3, 4)，與其他B組蟲媒病毒如 己型腦炎病毒可交叉免疫反應。I型登革熱病毒引起的登革熱感染主要見于亞洲國家。
[0005] 登革熱病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中的NSUNS3和NS5都可作為誘導登革熱病毒特異性抗體 應答的免疫抗原。NS1抗體應答主要通過合成多膚，重組蛋白和來自病毒接種的鼠腦或病毒 感染的細胞上清制備的天然抗原進行免疫獲得。NS1血清特異性化ISA對鑒別登革熱病毒 感染，登革熱NS1特異性IgG是登革熱病毒初次感染的早期診斷的重要指標。近年來，通過 對世界各地收集到的血清進行的回顧性流行病學研究證明，NS1型特異性IgGELISA可W 用于替代中和實驗同于鑒別日本己型腦炎病毒和登革熱病毒感染的血清流行病學研究W 及登革熱病毒初次感染的血清型鑒定。此外，從即發(fā)感染急性期的血清中可W檢測到最初 呈現(xiàn)的是NS1特異性IgG免疫應答，而多次感染后的感染期呈現(xiàn)增強的IgG免疫應答。因 此，NSl特異性IgG抗體也可用于多次登革熱病毒感染的早期診斷。
[0006] 大腸桿菌作為一種使用方便，操作簡單，傳代迅速，遺傳背景清楚，易于大量培養(yǎng) 的一種基因工程的工具，目前被廣為應用于基因蛋白重組和表達中。外源性重組基因在大 腸桿菌中表達，常常會面臨一些問題，例如一些外源性蛋白會有表達量低，外源性細胞毒性 蛋白可能會W包涵體的形式存在，增加了蛋白純化的難度和步驟，導致了蛋白產(chǎn)量降低，尤 其是蛋白純度的下降。目前制備登革熱病毒NS1蛋白的方法，大多數(shù)使用的是W質(zhì)粒祀T 系列為代表的T7瞻菌體表達系統(tǒng)，具有表達效率高的優(yōu)點，即使在沒有誘導的條件下，也 有低水平的目的基因表達，但是目的基因主要會W包涵體的形式存在于菌體中，需在蛋白 純化后經(jīng)過復雜耗時的蛋白復性過程，才可能成為具有生物活性的蛋白，既費時耗材又因 為增加的步驟而降低了蛋白的產(chǎn)量。
[0007] 因此，迫切需要一種簡便、高效且能大量表達登革熱病毒NS1蛋白的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明首先提供了一種質(zhì)粒載體，其是在質(zhì)粒pTrc99A的基礎(chǔ)上用基因定點突變(sitedirectedmutagenesis)的方法在多克隆位點Hindlll之后加上9His-tag而成；其 含有啟動子trc。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種重組質(zhì)粒載體，其含有登革熱病毒NS1蛋白基因。
[0010] 本發(fā)明還提供了制備上述重組質(zhì)粒載體的方法，其是由登革熱病毒NS1蛋白基因 與pTrc99H載體融合而成，其中登革熱病毒NS1蛋白基因的C末端帶有9His-tag。
[0011] 其中所述登革熱NS1蛋白基因，為登革熱NS1蛋白的全長基因（NS1蛋白基因為 GenBank中的序列號為DVU88536的基因。），其構(gòu)建成的重組表達質(zhì)粒表示為pTrD。
[0012] 其中所述的連接可W采用本領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法進行，例如；所述的連接可 W是利用內(nèi)切酶處理含有在登革熱病毒NS1蛋白基因兩側(cè)帶有限制性內(nèi)切酶識別位點 的克隆質(zhì)粒得到的登革熱病毒蛋白NS1的基因，與經(jīng)相同酶切處理的表達載體pTrc99H 連接，構(gòu)建重組表達載體pTrcD。所述的內(nèi)切酶可W是本領(lǐng)域通常使用的內(nèi)切酶，例如 BamHI'Hindlll。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化體，其由重組質(zhì)粒載體pTrD轉(zhuǎn)化大腸桿菌而得。
[0014] 所述的轉(zhuǎn)化可W按照本領(lǐng)域的常規(guī)或已知的方法進行。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種制備登革熱病毒NS1蛋白的方法，該方法為：
[0016] 登革熱病毒NS1蛋白基因與載體pTrc99H連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒載體pTrD;
[0017] 重組表達質(zhì)粒載體pTrD轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建轉(zhuǎn)化體；
[0018] 轉(zhuǎn)化體克隆并表達登革熱病毒NS1蛋白。
[0019] 得到的蛋白還可經(jīng)過進一步的純化，達到作為抗原的要求。
[0020] 本發(fā)明的一種制備登革熱病毒NS1蛋白的方法，能夠大量表達登革熱蛋白并提高 了蛋白的可溶性，從根本上簡化了登革熱蛋白的制備步驟，有效提高了登革熱蛋白的可溶 性及純度，做到經(jīng)濟，快捷，高效。
[0021] 本發(fā)明在不改變登革熱病毒NS1蛋白基因的罕見密碼子的條件下，通過選擇適合 的表達載體的方式，有效提高了登革熱病毒NS1蛋白基因的表達水平和可溶性。本發(fā)明使 用的表達質(zhì)粒是WpTrc99A為基礎(chǔ)制備的質(zhì)粒載體pTrc99H，啟動子是trc，trc表達系統(tǒng)對 于外源性基因的表達具有嚴密的調(diào)控性，即對外源性基因具有表達效率高的特點的同時， 又對于外源性的基因的表達有著嚴密的調(diào)控作用，使外源性基因蛋白不會在菌體內(nèi)聚合成 為不溶性的包涵體。因此在表達可能會對大腸桿菌產(chǎn)生毒性的蛋白時有其他表達系統(tǒng)不具 備的優(yōu)勢。本發(fā)明利用trc啟動子的調(diào)控優(yōu)勢，構(gòu)建了重組質(zhì)粒載體用W表達登革熱NS1 蛋白。
[0022] 本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒載體，其含有登革熱NS1蛋白的基因，是由登革熱病毒 NS1蛋白基因與經(jīng)過改建的原核表達載體pTrc99A即pTrc99H構(gòu)建而成的新質(zhì)粒pTrD, 其特征是含有pTrc99A的框架，并在登革熱病毒NS1蛋白基因的C末端引入9Histag。該 種特制的重組表達質(zhì)粒，有效的提高了登革熱NS1基因蛋白的表達效率和可溶性，并極大 簡化了提純的步驟和純化效率。之所W在表達質(zhì)粒中加入9His-tag，而不是細is-tag或 7His-stag，因為該樣可W增加登革熱病毒蛋白和Ni-NTA柱的親和性，有效提高了登革熱 病毒蛋白的純度。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合優(yōu)化培養(yǎng)條件的方法，有效提高了登革熱病毒蛋白的產(chǎn) 量。用本發(fā)明提供的方法制備的登革熱病毒蛋白，從根本上做到了登革熱病毒蛋白的高效 表達，表達量達30%W上，和高可溶性(可溶性達90%)，無須經(jīng)過耗時的蛋白復性過程，即可 得到高純度的登革熱病毒蛋白，為登革熱病毒抗原及其他重組蛋白的制備，登革熱早期診 斷試劑的開發(fā)，登革熱疫苗的開發(fā)，提供了良好的基礎(chǔ)。
【附圖說明】：
[0023] 圖1，質(zhì)粒pTrc99A示意圖
[0024] 圖2,質(zhì)粒載體pTrc99H的結(jié)構(gòu)示意圖 [00巧]圖3,重組質(zhì)粒載體pTrD構(gòu)建示意圖
[0026] 圖4,重組質(zhì)粒載體pTrD結(jié)構(gòu)示意圖
[0027] 圖5,登革熱病毒蛋白的制備流程圖
[002引 圖6，RTPCR產(chǎn)物凝膠電泳圖，其中M是plusDNAladder，l是其中的一個陽性克隆
[0029] 圖7，重組質(zhì)粒載體pTrD經(jīng)BamHI、HindllI酶切后的凝膠電泳圖，其中M是 plusDNAladder, 1是質(zhì)粒載體pTrc99H, 2是其中的一個陽性克隆
【具體實施方式】
[0030] 下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的描述，該些描述并不是要對本發(fā)明作進一步 的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應理解，對本
【發(fā)明內(nèi)容】
的技術(shù)特征所做的等同替換，或相應的改 進，仍屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0031] 本發(fā)明提供的登革熱病毒NS1蛋白可W由W下方法制備：培養(yǎng)登革熱病毒，接種 于含有15%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液的C6/36細胞中培養(yǎng)。培養(yǎng)72小時后，收集病毒 感染的C6/36細胞，用RT-PCR法擴增出登革熱病毒NS1蛋白基因，純化RT-PCR產(chǎn)物。將純 化的登革熱病毒NS1蛋白基因用限制性內(nèi)切酶BamHI、Hindlll處理，與經(jīng)相同酶切處理得 表達載體連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌的感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定得 到陽性克隆。表達目的基因片段，獲得重組蛋白登革熱病毒蛋白。
[0032]實施例1，質(zhì)粒表達載體pTrc99H的構(gòu)建 [003引 （l)PCR反應引入變異
[0034]W大腸桿菌質(zhì)粒表達載體pTrc99A(Addgene，結(jié)構(gòu)見圖1。）為模板，在多克 隆位點和終止子中間加入9Histag。使用市場上出售的位點特異性變異引入試劑盒 (QiagenQuikChange11Site-DirectedMutagenesisKit)弓|入變異。
[003引用于上述氨基酸殘基取代的正向引物的序列為SEQNOl和SEQN02。反向引物的 序列形成正向引物的完全互補鏈。
[0036] 對于PCR反應而言，用W下的反應組成，在95°C、30砂后，重復18次95°C、30砂； 55°C、1分鐘；68C、8分鐘的循環(huán)，在68C進