專利名稱：一種用于快速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的膠體金試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及一種醫(yī)用檢測耗材，具體涉及一種用于快速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的膠體金試紙條。
背景技術(shù)：
登革熱是登革熱病毒引起、伊蚊傳播的一種急性傳染病。臨床特征為起病急驟，高熱，全身肌肉、骨髓及關(guān)節(jié)痛，極度疲乏，部分患者有皮疹、出血傾向和淋巴結(jié)腫大。登革熱為全球最嚴(yán)重的由蚊蟲傳播的病毒性疾病。該病毒主要是通過埃及伊蚊傳播,超過100個國家報告過登革熱爆發(fā)，有2. 5億人生活在登革高感染區(qū)，每年會發(fā)生5000萬到I億例登革出血熱，200000-500000例登革感染者最終發(fā)展為登革出血熱，平均有5%的登革出血熱患者會死亡。登革熱病毒是小型黃病毒,屬于黃熱病毒屬,按流行病學(xué)分類屬蟲媒病毒B組,血清學(xué)上分為1，2，3，4共四個血清型。登革熱病毒能夠引起一系列臨床癥狀，包括有生命危險的失血性休克綜合征和較少見的伴有肝衰與腦病的急性肝炎。感染登革熱病毒輕則突然發(fā)熱、劇烈肌肉疼痛、骨關(guān)節(jié)痛，重則廣泛出血、迅速休克。免疫膠體金技術(shù)(Immunogold labelling techique)是上世紀(jì)80年代繼突光素、放射性同位素和酶三大標(biāo)記技術(shù)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。該技術(shù)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，形成肉眼可見的紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中?？焖僭\斷試紙條是20世紀(jì)90年代以來在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新型層析材料基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型體外診斷技術(shù)，近年來發(fā)展迅速，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是醫(yī)學(xué)檢驗中得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)主要是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在硝酸纖維膜上，膠體金標(biāo)記試劑吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待測樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體區(qū)域時，待測物金標(biāo)試劑復(fù)合物與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，膠體金標(biāo)記聚集在檢測帶上，可通過目測得到直觀的顯色結(jié)果。而游離的標(biāo)記物則越過檢測帶，從而達到與檢測物自動分離的目的。抗體捕獲法(亦稱反向間接法)ELISA，主要用于血清中某種抗體亞型成分的測定。其原理是將抗原固化在基質(zhì)上，加入含抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清，洗去未結(jié)合的抗體，結(jié)合于抗原上的抗體可由標(biāo)記有熒光素、放射性核素或一些酶的兔抗小鼠免疫球蛋白抗體識別。常用的抗體檢測方法有=ELISA法和RT-PCR法。但這些檢測技術(shù)需要特殊的儀器設(shè)備，并且需要專業(yè)技術(shù)人員在專業(yè)的實驗室進行檢測，操作復(fù)雜，耗時長，不適宜于現(xiàn)場即使檢測。目前，現(xiàn)有技術(shù)中還沒出現(xiàn)能實現(xiàn)血清型為1，2，3，4的登革熱病毒IgG和IgM抗體同時檢測并且具有簡便、快捷、準(zhǔn)確特點的儀器，因此對于登革熱病毒IgG和IgM抗體的檢測，耗時較長，檢測過程繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述領(lǐng)域的需求和空白，本發(fā)明旨在提供一種用于快速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的膠體金試紙條，本發(fā)明試紙條采用抗體捕獲法原理和免疫膠體金技術(shù)相結(jié)合快速檢測人血清、血漿或全血中的登革熱病毒IgG、IgM型抗體，能定性檢測血清型I、2、3，4型四種登革病毒的IgG、IgM抗體，用于臨床實驗室對具有持續(xù)發(fā)燒的登革感染癥狀或接觸史的患者的輔助性診斷。本發(fā)明試紙條操作簡單，拿來即用，能夠滿足不同層次人員的需要，容易普及到基層社區(qū)醫(yī)院，以符號顯示結(jié)果，擺脫了對設(shè)備、儀器、人員及貯存和運輸環(huán)境的特殊要求，并且具有快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確、特異的特點，同時本發(fā)明用樣量少，節(jié)省資源，儲存條件寬泛，可同時一次性判讀出登革熱病毒IgG或IgM型抗體的陽性結(jié)果。一種用于快速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的膠體金試紙條，在高度方向上包括基板支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層，所述反應(yīng)試劑載體吸附層固定在所述基板支撐層 上；所述反應(yīng)試劑載體吸附層從加液端到手持端依次設(shè)有樣品纖維墊，金標(biāo)纖維結(jié)合墊，纖維素藥膜，手持端吸水材料墊；在所述樣品纖維墊、金標(biāo)纖維結(jié)合墊和手持端吸水材料墊上覆蓋有保護膜層，所述纖維素藥膜從加液端到手持端依次設(shè)有質(zhì)控線C、檢測線T1, T2，所述質(zhì)控線C和檢測線T1, T2相互平行且與所述膠體金試紙條長度方向相垂直，其特征在于，在所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊上包被有I種至4種抗原，所述抗原選自膠體金標(biāo)記的四個亞型的登革熱病毒的抗原；所述質(zhì)控線C上包被有抗登革熱病毒抗原多克隆抗體，所述檢測線T1上包被有抗μ鏈單抗,所述檢測線T2上包被有抗人IgG單抗。所述兩條檢測線1\、T2從加液端到手持端依次設(shè)置。在所述樣品纖維墊上對應(yīng)的保護膜層上表面標(biāo)有與所述檢測線T1, T2平行的可視的MAX標(biāo)志線。所述樣品纖維墊的材料是玻璃纖維棉，所述吸水材料墊的材料是粗纖維吸水紙，所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊的材料是吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。所述保護膜層為膠帶。所述基板支撐層為不吸水的塑料基板。還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對應(yīng)于樣品纖維墊及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。一種用于快速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的試劑盒，其特征在于包括有上述權(quán)利要求1-7中任一膠體金試紙條和樣品稀釋用具。技術(shù)效果根據(jù)膠體金檢測的原理，將本發(fā)明的膠體金試紙條水平放置，取I μ I待測液滴加到試紙條加液端的樣品纖維層，再滴加2滴(約80-100 μ I)樣品稀釋液。待測液中的物質(zhì)在纖維層材料的毛細作用下沿著試紙條從加液端向手持端移動，待測液中的登革抗體經(jīng)過金標(biāo)纖維層時與膠體金標(biāo)記登革抗原粘附在一起并向吸水紙墊方向移動，待測液中的登革抗體經(jīng)過檢測線時，與檢測線上包被的抗μ鏈單抗、抗人IgG單抗由于特異性結(jié)合導(dǎo)致膠體金在檢測線上聚集，使檢測線顯色。其余膠體金標(biāo)記蛋白繼續(xù)遷移，到對照線時，由于采用的膠體金標(biāo)記登革抗原與對照線上包被的抗登革熱病毒抗原多克隆抗體能特異結(jié)合，因此，膠體金在對照線上聚集使對照線顯色。即若檢測線T1和對照線都顯色，表明待測液為登革熱病毒IgM抗體陽性；若檢測線T2和對照線都顯色，表明待測液為登革熱病毒IgG抗體陽性；若檢測線1\、T2和對照線都顯色，表明待測液為登革熱病毒IgG抗體和IgM抗體陽性；如果，待測液中不存在登革抗體，那么，待測液遷移至檢測線時，待測液中沒有與檢測線上包被的物質(zhì)能夠結(jié)合的成分，從而導(dǎo)致膠體金不會聚集于檢測線，因此，檢測線不會顯色，但是對照線處仍然顯色。即僅僅有對照線顯色，表明待測液為陰性。無論靶標(biāo)物質(zhì)是否存在于樣本中，一條紅色條帶都會出現(xiàn)在對照區(qū)(C)內(nèi)。對照區(qū)(C)內(nèi)所顯現(xiàn)的紅色條帶是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的膠體金試紙條不同于現(xiàn)有的試紙條之處在于在所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的四個亞型的登革熱病毒的抗原的14種抗原，所述質(zhì)控線C上包被有抗登革熱病毒抗原多克隆抗體，所述檢測線T1上包被有抗μ鏈單抗，所述檢測線T2上包被有抗人IgG單抗。本發(fā)明試紙條采用抗體捕獲法原理快速檢測血清型1、2、3及4型的登革熱病毒IgG、IgM型抗體。所述檢測線Tl上包被有抗μ鏈單抗，所述檢測線Τ2上包被有抗人IgG單抗。單抗，即單克隆抗體，其只識別一種表位(抗原決定簇)的抗體，來自單個B淋巴細胞的克隆或一個雜交瘤細胞的克隆。因此，它只對一種抗原起反應(yīng)，所以效率很高，不會跟別的抗原反應(yīng)，其特異性高。即抗人IgG抗體只會與IgG抗體反應(yīng),抗μ鏈抗體也只會與IgM抗體反應(yīng)，適合于檢測線Tl、Τ2上包被。而多抗則是是對特定抗原所產(chǎn)生的一組免疫球蛋白混合物，每種免疫球蛋白能識別抗原分子上的一個表位。因此，抗登革病毒抗原多克隆抗體，可以是IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等抗體，其特異性相對要低，并且會與標(biāo)記中的登革病毒抗原反應(yīng)，故適合于質(zhì)控線C上包被。IgM抗體陽性意味著被測者是登革熱病毒的初次感染或近期感染；IgG抗體陽性意味著被測者是有過登革熱病毒感染史或遠期感染；IgM和IgG抗體均為陽性意味著被測者是被登革熱病毒二次感染或者處于恢復(fù)期狀態(tài)。本發(fā)明產(chǎn)品在檢測時候，是通過待測液經(jīng)毛細作用，從加液端往手持端遷移，先經(jīng)過T1,再經(jīng)過T2,如此順序，可使T1位置顯色快，反應(yīng)時間短。若是登革抗體陽性的時候，則可使包被的抗μ鏈單抗比抗人IgG單抗先行與待測液中的靶標(biāo)物質(zhì)反應(yīng)，提高反應(yīng)速率，顯色速度也會提高。若IgM為陽性，即可立即判斷出被測者被登革熱病毒感染。這對于在臨床判讀結(jié)果上有更重要的意義。所述兩條檢測線1\、T2從加液端到手持端依次設(shè)置。本發(fā)明可通過在金標(biāo)纖維結(jié)合墊處理方式上，即在所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的四個亞型的登革熱病毒的其中I種抗原，從而實現(xiàn)對血清型1、2、3及4型的登革熱病毒IgG、IgM型抗體的快速檢測。若在所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊上包被有膠體金標(biāo)記的四個亞型的登革熱病毒的4種抗原，則可檢測出總的登革熱病毒IgG、IgM型抗體的快速檢測。本發(fā)明，優(yōu)選在所述樣品纖維墊上對應(yīng)的保護膜層上表面標(biāo)有與所述檢測線T1, T2平行的可視的MAX標(biāo)志線。用于提醒操作人員，操作時待測液不要超過標(biāo)志線，以免引起假陽性。、
本發(fā)明，優(yōu)選所述樣品纖維墊的材料玻璃纖維棉，所述吸水材料墊的材料是粗纖維吸水紙，所述纖維素藥膜墊的材料是硝酸纖維素膜，所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊的材料是吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。這些材料配合使用，其吸水性及毛吸作用配合良好，保證本發(fā)明檢測試紙條的檢測速度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明，優(yōu)選保護膜層為膠帶，使試紙條免受污染，成本低且效果好。本發(fā)明，優(yōu)選基板支撐層為不吸水的塑料基板，不吸水的材料，避免支撐材料吸收待測液從而影響水平方向的遷移。本發(fā)明，優(yōu)選還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對應(yīng)于樣品纖維層及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。便于攜帶和保存。本發(fā)明試紙條采用抗體捕獲法和免疫膠體金技術(shù)相結(jié)合快速檢測人血清、血漿或 全血中的登革熱病毒IgG、IgM型抗體，能定性檢測血清型1、2、3，4型四種登革病毒的IgG、IgM抗體，用于臨床實驗室對具有持續(xù)發(fā)燒的登革感染癥狀或接觸史的患者的輔助性診斷；本發(fā)明試紙條操作簡單，使用方便，拿來即用，不需要本領(lǐng)域的專業(yè)人員，能夠滿足不同層次人員的需要，并且保證檢測的靈敏性、準(zhǔn)確性和高效率。


圖I本發(fā)明試紙條的俯視圖；其中1-手持端，2-質(zhì)控線C線，3-檢測線T2線，4-檢測線T1, 5-MAX標(biāo)志線，6-加液端，7-纖維素藥膜，8-樣品纖維墊，9-手持端吸水材料墊，10-金標(biāo)纖維結(jié)合墊，14-膠帶邊緣線。圖2本發(fā)明試紙條的縱向剖面圖其中7_纖維素藥膜,8-樣品纖維墊，9-手持端吸水材料墊，10-金標(biāo)纖維結(jié)合墊，11-手持端膠帶，12-箭頭膠帶，13-基板支撐層。
具體實施例方式提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實施方式，不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明旨在提供一種用于快速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的膠體金試紙條，本發(fā)明試紙條采用抗體捕獲法和免疫膠體金技術(shù)相結(jié)合快速檢測人血清、血漿或全血中的登革熱病毒IgG、IgM型抗體，能定性檢測血清型1、2、3，4型四種登革病毒的IgG、IgM抗體，用于臨床實驗室對具有持續(xù)發(fā)燒的登革感染癥狀或接觸史的患者的輔助性診斷；本發(fā)明試紙條操作簡單，使用方便，拿來即用，不需要本領(lǐng)域的專業(yè)人員，能夠滿足不同層次人員的需要，容易普及到基層社區(qū)醫(yī)院，以符號顯示結(jié)果，擺脫了對設(shè)備、儀器、人員及貯存和運輸環(huán)境的特殊要求，并且具有快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確、特異的特點。
根據(jù)膠體金檢測的原理，將本發(fā)明的膠體金試紙條水平放置，取I μ I待測液滴加到試紙條加液端的樣品纖維層，再滴加2滴(約80-100 μ I)樣品稀釋液。待測液中的物質(zhì)在纖維層材料的毛細作用下沿著試紙條從加液端向手持端移動，待測液中的登革抗體經(jīng)過金標(biāo)纖維層時與膠體金標(biāo)記登革抗原粘附在一起并向吸水紙墊方向移動，待測液中的登革抗體經(jīng)過檢測線時，與檢測線上包被的抗P鏈單抗、抗人IgG單抗由于特異性結(jié)合導(dǎo)致膠體金在檢測線上聚集，使檢測線顯色。其余膠體金標(biāo)記蛋白繼續(xù)遷移，到對照線時，由于采用的膠體金標(biāo)記登革抗原與對照線上包被的抗登革熱病毒抗原多克隆抗體能特異結(jié)合，因此，膠體金在對照線上聚集使對照線顯色。即若檢測線T1和對照線都顯色，表明待測液為登革熱病毒IgM抗體陽性；若檢測線T2和對照線都顯色，表明待測液為登革熱病毒IgG抗體陽性；若檢測線1\、T2和對照線都顯色，表明待測液為登革熱病毒IgG抗體和IgM抗體陽性；如果，待測液中不存在登革抗體，那么，待測液遷移至檢測線時，待測液中沒有與檢測線上包被的物質(zhì)能夠結(jié)合的成分，從而導(dǎo)致膠體金不會聚集于檢測線，因此，檢測線不會顯色，但是對照線處仍然顯色。即僅僅有對照線顯色，表明待測液為陰性。無論靶標(biāo)物質(zhì)是否存在于樣本中，一條紅色條帶都會出現(xiàn)在對照區(qū)(C)內(nèi)。對照區(qū)(C)內(nèi)所顯現(xiàn)的紅色條帶是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。、本發(fā)明用于快速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的膠體金試紙條，在高度方向上包括基板支撐層13、反應(yīng)試劑載體吸附層，所述反應(yīng)試劑載體吸附層固定在所述基板支撐層13上；所述反應(yīng)試劑載體吸附層從加液端6到手持端I依次設(shè)有樣品纖維墊8，金標(biāo)纖維結(jié)合墊10，纖維素藥膜7，手持端吸水材料墊9 ;在所述樣品纖維墊8、金標(biāo)纖維結(jié)合墊10和手持端吸水材料墊9上覆蓋有保護膜層。所述纖維素藥膜7上從加液端6到手持端I依次設(shè)有質(zhì)控線C-2、檢測線 \-4，T2-3，所述質(zhì)控線C-2和檢測線 \-4，T2_3相互平行且與所述膠體金試紙條長度方向相垂直。本發(fā)明的膠體金試紙條不同于現(xiàn)有的試紙條之處在于在所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊10上包被有I種至4種抗原，所述抗原選自膠體金標(biāo)記的四個亞型的登革熱病毒的抗原；所述質(zhì)控線C-2上包被有抗登革熱病毒抗原多克隆抗體，所述檢測線 \-4上包被有抗μ鏈單抗，所述檢測線Τ2-3上包被有抗人IgG單抗。本發(fā)明試紙條采用抗體捕獲法原理快速檢測血清型1、2、3及4型的登革熱病毒IgG、IgM型抗體。IgM抗體陽性意味著被測者是登革熱病毒的初次感染或近期感染；IgG抗體陽性意味著被測者是有過登革熱病毒感染史或遠期感染；IgM和IgG抗體均為陽性意味著被測者是被登革熱病毒二次感染或者處于恢復(fù)期狀態(tài)。本發(fā)明產(chǎn)品在檢測時候，是通過待測液經(jīng)毛細作用，從加液端往手持端遷移，先經(jīng)過!\-4，再經(jīng)過T2-3，如此順序，可使 \-4位置顯色快，反應(yīng)時間短。若是登革抗體陽性的時候，則可使包被的抗μ鏈單抗比抗人IgG單抗先行與待測液中的靶標(biāo)物質(zhì)反應(yīng)，提高反應(yīng)速率，顯色速度也會提高。若IgM為陽性，即可立即判斷出被測者被登革熱病毒感染。這對于在臨床判讀結(jié)果上有更重要的意義。所述兩條檢測線 \-4、Τ2-3從加液端6到手持端I依次設(shè)置。本發(fā)明可通過在金標(biāo)纖維結(jié)合墊10處理方式上，即在所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊10上包被有膠體金標(biāo)記的四個亞型的登革熱病毒的其中I種-4種抗原，從而實現(xiàn)對血清型1、2、3及4型的登革熱病毒IgG、IgM型抗體的快速檢測。若在所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊10上包被有膠體金標(biāo)記的四個亞型的登革熱病毒的4種抗原，則可檢測出總的登革熱病毒IgG、IgM型抗體的快速檢測。本發(fā)明，優(yōu)選在樣品纖維墊8上對應(yīng)的保護膜層上表面標(biāo)有與所述檢測線！\-4，T2-3平行的可視的MAX標(biāo)志線5。用于提醒操作人員，操作時待測液不要超過MAX標(biāo)志線5，以免引起假陽性。本發(fā)明，優(yōu)選所述樣品纖維墊8的材料是玻璃纖維棉，所述吸水材料墊9的材料是粗纖維吸水紙，所述纖維素藥膜7的材料是硝酸纖維素膜，所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊10的材料是吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。這些材料配合使用，其吸水性及毛吸作用配合良好，保證本發(fā)明檢測試紙條的檢測速度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明，優(yōu)選保護膜層為膠帶，使試紙條免受污染，成本低且效果好。本發(fā)明，優(yōu)選基板支撐層15為不吸水的塑料基板，不吸水的材料，避免支撐材料吸收待測液從而影響水平方向的遷移。本發(fā)明，優(yōu)選樣品纖維墊8的上表面及所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊10的下表面設(shè)一層無紡布。用于適量吸取液體，起到一定的緩沖作用。 本發(fā)明，優(yōu)選還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層15形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對應(yīng)于樣品纖維墊8及纖維素藥膜7的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。便于攜帶和保存。實驗例I.本發(fā)明試紙條的制備方法試劑四個亞型的登革病毒的4種抗原和抗登革熱病毒抗原多克隆抗體，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所；抗μ鏈單抗和抗人IgG單抗，購于加拿大 Artron BioResearch Inc.進口。試紙條的制備程序如下纖維素藥膜的包被步驟I.將抗登革病毒抗原作為對照線C，抗μ鏈單抗作為檢測線Tl、抗人IgG單抗作為檢測線Τ2，三個試劑分別按照所需的濃度(范圍I. 5-2mg/ml)，用20mM的PBS進行稀釋。步驟2.將配制好的上述三個試劑，安裝C、Tl、T2位置分別包被到硝酸纖維素膜上，然后干燥6小時，溫度為30°C，濕度< 35%，從而制得纖維素藥膜。步驟3.金標(biāo)纖維層的標(biāo)記I、取40nm的膠體金溶液，按終濃度8-12 μ I/ml加入O. 2M K2CO3,加入一定濃度的登革病毒I型抗原，放置室溫反應(yīng)15-30分鐘，然后按照濃度20 μ 1/ml加入20%BSA的溶液，用于飽和游離的膠體金。最后lOOOOrpm，離心30分鐘，去除上清液中未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用等體積的O. 5m硼酸溶液(含l%Tween、5%蔗糖、1%水解BSA、1%水解酪蛋白、O. 1%PVA)復(fù)溶沉淀的膠體金標(biāo)記原液。2、按照上述步驟，將登革病毒2型抗原、登革病毒3型抗原、登革病毒4型抗原，分別制備成相應(yīng)的膠體金標(biāo)記原液。3、最后，將這四種膠體金標(biāo)記原液分別按照10-20%濃度，用O. 5m硼酸溶液進行稀釋，從而配制成標(biāo)記后的膠體金工作液。然后再將該工作液鋪于30*30cm玻璃纖維墊上，干燥6小時,溫度為30°C,濕度彡35%,從而制得金標(biāo)墊。4、將1-4型的膠體金標(biāo)記原液混合配制的所制得的金標(biāo)墊，可以檢測出登革熱病毒1-4型的樣本。若是使用其中一種類型的膠體金標(biāo)記原液配制所制得的金標(biāo)墊，則僅能檢測出相對應(yīng)的類型的樣本。步驟4.試紙條的組裝I、將塑料板平放在操作臺上，貼上雙面膠帶。2、撕掉雙面膠帶襯紙，在距塑料板上端30mm處貼上已包被有抗μ鏈單抗、抗人IgG單抗和抗鼠IgG多克隆抗體的硝酸纖維素膜。3、將粗纖維吸水紙壓硝酸纖維素膜上端2mm貼上 ，上端與塑料板上端取齊。4、將金標(biāo)墊壓于硝酸纖維素藥膜下端2mm。5、將玻璃纖維墊壓于金標(biāo)墊上約一半,下端與塑料板下端取齊貼上。6、將箭頭膠帶壓硝酸纖維素膜I. 5-2mm貼上。7、將手持端膠帶壓粗纖維吸水紙貼上。實施例2.使用方法及方法學(xué)對比實驗本產(chǎn)品使用方法取待測樣本1μ 1，滴加到水平試紙條的加液端MAX線以下部分的樣品纖維層上，再滴加2滴(80-100 μ I)樣本稀釋液于樣品纖維層上。對比I :產(chǎn)品對比本發(fā)明產(chǎn)品與現(xiàn)有技術(shù)速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的產(chǎn)品相比具有快速，準(zhǔn)確，特異，便捷的特點，并且能定性檢測血清型I、2、3，4型四種登革病毒的IgG、IgM抗體，在速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體前、后都不需要做必要的儀器清洗及保養(yǎng)工作，并且不要求本領(lǐng)域的專業(yè)人員來操作。對照產(chǎn)品I :中山生物工程有限公司的《登革病毒IgM抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)》國藥準(zhǔn)字S20060103對照產(chǎn)品2 :中山生物工程有限公司的《登革病毒IgG抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)》國藥準(zhǔn)字S20060101對照產(chǎn)品I和對照產(chǎn)品2的使用方法如下I、將檢測樣本用樣品稀釋液做I : 50稀釋。(先將10 μ I血清加入到90 μ I的樣品稀釋液中混勻，再將I : 10的稀釋血清用樣品稀釋液做I : 5稀釋充分混勻。標(biāo)本稀釋后應(yīng)在2小時內(nèi)使用。)2、將25倍濃縮洗滌液加入到720ml (96T)蒸餾水或去離子水中混勻備用。3、取出已包被板，加入已稀釋好的樣本100 μ I/孔，同時設(shè)陰、陽性對照及空白對照各二孔(陰、陽性對照孔分別直接加入相應(yīng)對照血清100 μ I/孔，空白對照加入洗滌液100 μ I/孔)，振蕩均勻后，于37°C水浴箱溫育40分鐘。4、溫育后，甩去板內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置一分鐘后甩干，重復(fù)洗滌五次，扣干。5、加入酶標(biāo)記物50 μ I/孔(空白孔不加)，振蕩均勻后，于37°C水浴箱溫育30分鐘。6、溫育后，甩去板內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置一分鐘后甩干，重復(fù)洗滌五次，扣干。7、每孔加入底物A、B液各50 μ 1，37°C避光顯色10分鐘，再加入終止液50 μ I/孔，于450nm測OD值。
對照產(chǎn)品3 申請?zhí)枮?00510086853. 2發(fā)明專利公開一種檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的膠體金檢測試紙條對照產(chǎn)品3使用方法取150-200 μ I血清滴加至加樣區(qū)，樣品中的液體上行，若30秒內(nèi)未見液體爬行，則再加1-2滴生理鹽水或PBS緩沖液。對比結(jié)果如表I :
權(quán)利要求
1.一種用于快速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的膠體金試紙條，在高度方向上包括基板支撐層、反應(yīng)試劑載體吸附層，所述反應(yīng)試劑載體吸附層固定在所述基板支撐層上； 所述反應(yīng)試劑載體吸附層從加液端到手持端依次設(shè)有樣品纖維墊，金標(biāo)纖維結(jié)合墊，纖維素藥膜，手持端吸水材料墊； 在所述樣品纖維墊、金標(biāo)纖維結(jié)合墊和手持端吸水材料墊上覆蓋有保護膜層， 所述纖維素藥膜從加液端到手持端依次設(shè)有質(zhì)控線C、檢測線T1, T2，所述質(zhì)控線C和檢測線T1, T2相互平行且與所述膠體金試紙條長度方向相垂直， 其特征在于，在所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊上包被有I種至4種抗原，所述抗原選自膠體金標(biāo)記的四個亞型的登革熱病毒的抗原；所述質(zhì)控線C上包被有抗登革熱病毒抗原多克隆抗體，所述檢測線T1上包被有抗y鏈單抗,所述檢測線T2上包被有抗人IgG單抗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金試紙條，其特征在于，所述兩條檢測線I\、T2從加液端到手持端依次設(shè)置。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金試紙條，其特征在于，在所述樣品纖維墊上對應(yīng)的保護膜層上表面標(biāo)有與所述檢測線T1, T2平行的可視的MAX標(biāo)志線。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金試紙條，其特征在于，所述樣品纖維墊的材料是玻璃纖維棉，所述吸水材料墊的材料是粗纖維吸水紙，所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊的材料是吸附金標(biāo)蛋白的玻璃纖維棉。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金試紙條，其特征在于，所述保護膜層為膠帶。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金試紙條，其特征在于，所述基板支撐層為不吸水的塑料基板。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膠體金試紙條，其特征在于，還包括外殼，所述外殼具有中空位，所述中空位與所述反應(yīng)試劑載體吸附層及所述基板支撐層形成的簡易膠體金試紙條的形狀大小相匹配，用于裝載所述反應(yīng)試劑載體吸附層，所述外殼上表面對應(yīng)于樣品纖維墊及纖維素藥膜的位置分別設(shè)有加樣窗和視窗。
8.一種用于快速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的試劑盒，其特征在于包括有上述權(quán)利要求1-7中任一膠體金試紙條和樣品稀釋用具。
全文摘要
本發(fā)明“一種用于快速檢測登革熱病毒IgG、IgM型抗體的膠體金試紙條”，屬于醫(yī)用檢測耗材，其特征在于，在所述金標(biāo)纖維結(jié)合墊上包被有1種至4種抗原，所述抗原選自膠體金標(biāo)記的四個亞型的登革熱病毒的抗原，所述質(zhì)控線C上包被有抗登革熱病毒抗原多克隆抗體，所述檢測線T1上包被有抗μ鏈單抗，所述檢測線T2上包被有抗人IgG單抗。本發(fā)明試紙條采用抗體捕獲法和免疫膠體金技術(shù)相結(jié)合能快速檢測血清型1、2、3及4型的登革熱病毒IgG、IgM型抗體，具有簡便、靈敏、特異、準(zhǔn)確的優(yōu)點，并且本發(fā)明用樣量少，節(jié)省資源，儲存條件寬泛，可同時一次性判讀出登革熱病毒IgG或IgM型抗體的陽性結(jié)果。
文檔編號G01N33/577GK102707057SQ20121016523
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者孫茜, 張瑩, 秦成峰 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 藍十字生物藥業(yè)(北京)有限公司