專利名稱：一種實(shí)時定量pcr測量樣品中染色體端粒平均長度的絕對值的試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及試劑盒，特別涉及一種實(shí)時定量PCR測量樣品中染色體端粒平均長度的絕對值的試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
端粒(Telomere)是一段DNA重復(fù)序列，位于染色體末端，可以保持染色體的完整性。1990年，Harley等證實(shí)端粒的長度可以隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而逐漸變短。這一發(fā)現(xiàn)在端粒和細(xì)胞衰老之間建立了緊密的聯(lián)系。端粒重復(fù)序列的長度可能起著一種分子鐘(molecular clock)的作用。不同年齡的人的體細(xì)胞的壽命明顯不同,其端粒的長度也不相 同。是隨著年齡的增長而縮短。來自新生兒的體細(xì)胞可在體外傳代培養(yǎng)80—90代，來自70歲老人的體細(xì)胞在體外只能傳代培養(yǎng)20 30代，而且端粒的重復(fù)序列長度也縮短很多。端粒酶(Telomerase)是細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒延長的一種酶,是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，可將端粒DNA加至真核細(xì)胞染色體末端。端粒在不同物種細(xì)胞中對于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，端粒酶能延長縮短的端粒(縮短的端粒其細(xì)胞復(fù)制能力受限)，從而增強(qiáng)體外細(xì)胞的增殖能力。但是，在正常人體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到相當(dāng)嚴(yán)密的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)證明，體細(xì)胞里沒有端粒酶的活性，所以體細(xì)胞每分裂一次，端粒也就縮短一些。隨著細(xì)胞不斷地進(jìn)行分裂，端粒的長度將越來越短，當(dāng)達(dá)到一個臨界長度時，細(xì)胞染色體會失去穩(wěn)定性，使細(xì)胞不能再進(jìn)行分裂而進(jìn)入凋亡(apoptosis)。端粒的長度決定了細(xì)胞的壽命，因此可用丟失的端粒重復(fù)序列的長度來推測細(xì)胞有絲分裂的次數(shù)，所以端粒被稱為分子鐘或有絲分裂鐘(mitotic clock)。端粒除了涉及到染色體穩(wěn)定性,細(xì)胞的衰老和死亡外,還與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在人體內(nèi)的各種細(xì)胞中，生殖細(xì)胞和干細(xì)胞染色體的末端比體細(xì)胞染色體的末端長出幾千個堿基對，并且在這兩類細(xì)胞里能檢測到端粒酶的活性。除此之外，其他所有體細(xì)胞里都未測得端粒酶的活性。惟一的例外是來源于體細(xì)胞的惡性腫瘤細(xì)胞卻又重新出現(xiàn)了端粒酶活性，發(fā)揮其合成端粒重復(fù)序列的功能，以補(bǔ)償正常的端粒序列丟失，使端粒的重復(fù)序列不會達(dá)到導(dǎo)致細(xì)胞死亡的臨界長度，從而獲得細(xì)胞的“永生性”(immortality)。這樣，惡性腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)或體外都能無限制地分裂增殖。上文提到的端粒長度縮短指的是所有染色體末端端粒的平均長度。近年來，很多實(shí)驗(yàn)觀察開始質(zhì)疑端粒的平均長度與衰老之間的聯(lián)系。一些研究小組提出了于端粒相關(guān)的細(xì)胞衰老是由單一或某幾個短端粒引起的觀點(diǎn)。這一觀點(diǎn)的正確性也被越來越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所證明。目前，研究端粒長度主要是應(yīng)用TRF法(mean length of telomere restrictionfragments)。另外,有一些手段可以比較精確的研究染色體中短端粒的情況，例如基于突光原位雜交(Q-FISH)的技術(shù),或者 STELA (single telomere length analysis)技術(shù)等。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本專利涉及一種實(shí)時定量PCR測量樣品中染色體端粒平均長度的絕對值試劑盒及其應(yīng)用。一種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒，其特征在于包括盒體，襯墊，PCR 反應(yīng)液，Taq 酶，136B4 Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, TelomereReverse，84-mer，36B4片段，襯墊上設(shè)有容器空分別放置PCR反應(yīng)液，Taq酶，136B4Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, Telomere Reverse,84-mer ;其中所述的36B4 Forward 的核苷酸序列為5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC 3’，見 Seq NO 1 ；36B4 Reverse 的核苷酸序列為5’ CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA A 3’，見Seq NO 2 ；Telomere Forward 的核苷酸序列為5’CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTTTGG GTT 3’，見 Seq NO 3 ；Telomere Reverse 的核苷酸序列為5’ GGC TTG CCT TAC CCTTAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT 3’，見 Seq NO :4 ;84_mer 的核苷酸序列為(TTAGGG)14的核苷酸序列為含14個TTAGGG重復(fù)序列的核苷酸片段,見Seq NO :5 ;36B4片段的核苷酸序列為5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CCG TCT CCA CAG ACA AGG CCA GGA CTCGTT TGT ACC CGT TGA TGA TAG AAT GGG 3’，見 Seq NO :6。 所述的PCR反應(yīng)液含有PCR緩沖液、I X SYBR Green master mix，dNTPS。引物的濃度為lOOnM，84-mer和36B4片段的濃度為lug/uL;
一種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于按步驟實(shí)
現(xiàn)
A.從人外周血細(xì)胞中獲取基因組DNA;
B.使用權(quán)利要求I所述的試劑盒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用來計算RT-qPCR反應(yīng)中樣品端粒的總長度和反應(yīng)中染色體的總拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線I使用濃度梯度為lao'io^io'KT4，10_5，10_6的人工合成的84-mer寡核苷酸的RT-qPCR反應(yīng)的Ct值繪制；標(biāo)準(zhǔn)曲線2使用人工合成的75 bp 36B4片段RT-qPCR反應(yīng)的CT值繪制，其濃度梯度為1，10—1，10_2，10_3，10_4，1(T5,1(T6 ；
C.使用RT-qPCR擴(kuò)增步驟A中獲得的樣品gDNA中的端粒片段和36B4基因片段，獲得相應(yīng)的Ct值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中端粒的總長度和樣品中36B4基因的拷貝數(shù)。D.計算樣品中端粒平均長度絕對值
端粒平均長度=端粒總長度/ 36B4拷貝數(shù)；
其中PCR反應(yīng)條件為
95°C變性 10 min，然后 95°C 15sec，60°C I min，共 40 個循環(huán)。具體來說
I.引物設(shè)計本專利涉及的PCR引物除了常規(guī)的用于擴(kuò)增端粒片段的引物對，還包括一段84 bp的寡核苷酸片段(84-mer)和一段75 bp的36B4片段。2.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線a)將 84-mer 梯度稀釋:1,10—1,10_2,10_3,10_4,10_5,10_6,84-mer寡核苷酸鏈總長度計算方法如下(假設(shè)每個反應(yīng)需未稀釋84-mer 60pg,即60X 1(T12 g,已知 84-mer 的分子量為 26667. 2)
lmol=6. 02 X IO23 個微粒數(shù) 平均一個 84-mer 的質(zhì)量為2. 6667 X IO4 / ( 6. 02 X IO23)= 0. 44 X l(T19g ;
每個PCR反應(yīng)體系中未稀釋84-mer總量為60 X 1(T12 / (0. 44 X 1(T19 )= I. 36 XIO9 個；由于84-mer的長度為84bp，因此每個PCR反應(yīng)體系中未稀釋84-mer總長度為I. 36 XIO9 X 84 = I. 18 X IO5 kb ；
同理可得不同稀釋濃度84-mer在每個反應(yīng)體系中的總長度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線I。b)繪制75 bp的36B4片 段拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線
將 75 bp 的 36B4 梯度稀釋1，10' 1(T2，1(T3，1(T4，1(T5，1(T6 ；
36B4片斷為75 bp，相對分子量為23268. 1，單個36B4 75 bp片段質(zhì)量為2. 32681 X IO4/ ( 6. 02X IO23) = 0. 38X 10_19 g ；
假設(shè)反應(yīng)體系中最高濃度75 bp的36B4含量為200 pg，那么每個反應(yīng)體系中75 bp36B4的拷貝數(shù)為200 X 1(T12 / 0. 38 X 1(T19 = 5. 26X IO9 ;相當(dāng)于在二倍體的染色體組中含有5. 26 X 109/2=2. 63 X IO9個36B4基因拷貝。同理可得不同稀釋濃度反應(yīng)體系中75 bp 36B4拷貝數(shù)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線2。3. RT-qPCR擴(kuò)增gDNA樣品中端粒和36B4基因；
4.RT-QPCR擴(kuò)增gDNA樣品中端粒和36B4基因(內(nèi)參)，并通過兩個標(biāo)準(zhǔn)曲線計算gDNA樣品中端粒的總長度及樣品中g(shù)DNA總拷貝數(shù)，即可以計算端粒平均長度端粒平均長度=樣品中端粒總長度/ gDNA總拷貝數(shù)。原理說明
I、實(shí)時熒光定量PCR (RT-qPCR)原理
無論是對遺傳病(如地中海貧血和血友病)、傳染病(如肝炎和艾滋病)或腫瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對基因表達(dá)水平的影響，或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量PCR技術(shù)的最新進(jìn)展是實(shí)時熒光定量。該技術(shù)借助于熒光信號來檢測PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另一方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實(shí)時擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對定量和絕對定量兩種。典型的相對定量如比較經(jīng)過不同方式處理的兩個樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。CT值的定義是擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。定量PCR的數(shù)學(xué)原理 理想的PCR反應(yīng)
X=X0 X 2n 非理想的PCR反應(yīng)
X=X0 (1+Et)n ；n:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X :第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0 :初始模板量Ex :擴(kuò)增效率
在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時
Xct=X0 (I+Ex)CT,(I)
其中Xct :為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時所擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值線設(shè)定以后，它為常數(shù)，設(shè)定為M ;方程式(I)兩邊同時取對數(shù)得
IogM=IogX0 (1+Ex)CT(2)
整理方程式(2)得
IogX0=-Iog(1+Ex)*CT+logM(3)
IogX0與CT呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增的CT值可以計算出樣品中的所含的模板量。2,SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理SYBR Green I是ー種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒 光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合吋，發(fā)出熒光JAdna雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在ー個體系內(nèi)，其信號強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是I、開始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性吋，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。
2、RT-qPCR測量端粒長度原理
如圖5所示，緑色區(qū)域?yàn)槎肆^(qū)，S卩(TTAGGG) η重復(fù)序列；藍(lán)色箭頭為與端粒特異性結(jié)合的引物。由干與端粒結(jié)合的引物數(shù)量跟端粒的長度呈正相關(guān)，端粒長，其可結(jié)合的引物數(shù)量多，熒光強(qiáng)度大，可以理解為拷貝數(shù)多；反之則拷貝數(shù)少，熒光強(qiáng)度弱。所以使用RT-qPCR法，得到各個樣品的CT值，即可間接反映每個樣品中端粒的平均長度。有益效果
端粒的縮短被認(rèn)為與細(xì)胞的衰老和癌癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。同時，細(xì)胞內(nèi)每條染色體兩端的端粒并不是以相同的速度縮短，有的端粒因?yàn)槟承┰驎蝗淮蠓茸兌?，形成相對短的端粒。?dāng)這些短端粒達(dá)到或超過某ー極限，就會導(dǎo)致細(xì)胞的衰來死亡，或者如癌癥等的疾病。因此，準(zhǔn)確地檢測細(xì)胞端粒長度，對預(yù)防衰老和預(yù)防癌癥的發(fā)生都能起到非常大的幫助。本發(fā)明采用試劑盒形式可以方便，快捷測定端粒的平均長度的絕對值，適用エ業(yè)生產(chǎn)或檢測。


圖I.標(biāo)準(zhǔn)曲線1，用于計算每個RT-qPCR反應(yīng)中端粒的總長度，橫軸為端粒長度，単位為Kb，PCR反應(yīng)的Ct值與端粒長度在圖I所示的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。通過優(yōu)化樣品的濃度，使其PCR反應(yīng)的CT值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，應(yīng)此使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得數(shù)值等于端粒在每個PCR反應(yīng)中的總長度。圖2.標(biāo)準(zhǔn)曲線2，用于計算36B4在每個反應(yīng)中的拷貝數(shù)，間接計算每個反應(yīng)中染色體的拷貝數(shù)，即每個PCR反應(yīng)中端粒的總拷貝數(shù)。橫軸為36B4的拷貝數(shù)，PCR反應(yīng)的CT值與36B4拷貝數(shù)的LOG值在途中所示范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。圖3.使用RT-qPCR法和TRF法測得的端粒平均長度絕對值的相關(guān)性。圖4為本發(fā)明的示意圖，其中盒體1，襯墊2，PCR反應(yīng)液3，Taq酶4，136B4Forward 5， 36B4 Reverse 6， Telomere Forward 7， Telomere Revers e 9,84-mer 10，36B4片段Io圖5. RT-qPCR法檢測端粒長度的示意圖，其中有圓圈的區(qū)域?yàn)樗{(lán)色，無圓圈區(qū)域?yàn)榫G色。
具體實(shí)施例方式RT-QPCR 使用 PCR 反應(yīng)液購自 Qiagen。實(shí)施例I外周血基因組DNA (gDNA)的提取
I).血液樣品分裝成I mL/管，干-70で儲存。2).將樣品解凍，每管樣品加入O. 8 mL檸檬酸緩沖液，混勻后12000轉(zhuǎn)離心Imin,去上清。 3).加入I mL IX檸檬酸緩沖液，震蕩后12000轉(zhuǎn)離心I min，去上清。4).カロ 入 375 uL O. 2M 的 Na2OAc,震蕩后加入 25 uL 10% 的 SDS 和 5 uLproteinase K (20 mg/mL H2O),震蕩混勻后 55 度孵育 I h。5).加入 120 uL 酚 / 氯仿 / 異戊醇(v/v :25/24/1),震蕩 30 sec 后于 12000 轉(zhuǎn)離心2 min。6).將水相層移至新的I. 5 mL離心管仲，加入I mL，冷的100%こ醇，混勻并于-20度孵育15 min。7). 12000轉(zhuǎn)離心2 min，去上清并烘干。8).加入180 uL 10 1的TE緩沖液，震蕩后于55で孵育10 min。9).加入20 uL，2M的醋酸鈉溶液，混勻后加入500 uL，冷的100%こ醇，混勻后于12000轉(zhuǎn)離心I min,去上清。10).用I mL，80%的こ醇洗滌沉淀，之后于12000轉(zhuǎn)離心I min，去上清。11).真空干燥沉淀10 min。12).將沉淀重新溶解于200 uL TE緩沖液中，55 °C孵育過夜，獲得gDNA。實(shí)施例2 RT-QPCR法測端粒平均長度的絕對值
I、ー種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒，包括盒體1，襯墊2，PCR反應(yīng)液3，Taq 酶 4, 136B4 Forward 5, 36B4 Reverse 6, Telomere Forward 7, TelomereRevers e 9,84-mer 10，36B4片段11，襯墊2上設(shè)有容器空腔分別放置PCR反應(yīng)液3，Taq酶 4, 136B4 Forward 5, 36B4 Reverse 6, Telomere Forward 7, Telomere Reverse 8,84-mer 10，36B4 片段 11 ；
其中所述的 36B4 Forward 的核苷酸序列為5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC
3，；
36B4 Reverse 的核苷酸序列為5’ CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA A 3’ ；Telomere Forward 的核苷酸序列為:5，CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGGGTT TGG GTT 3’ ；
Telomere Reverse 的核苷酸序列為5，GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TACCCT TAC CCT 3，；
84-mer的核苷酸序列為(TTAGGG) 14的核苷酸序列為含14個TTAGGG重復(fù)序列的核苷酸片段；
36B4片段的核苷酸序列為5’ CAG CM GTG GGA AGG TGT AAT CCG TCT CCA CAG ACAAGG CCA GGA CTC GTT TGT ACC CGT TGA TGA TAG AAT GGG 3’。2、利用84-mer繪制總長度標(biāo)準(zhǔn)曲線1)>84-mer的RT-qPCR反應(yīng)條件RT_qPCR反應(yīng)體系為20 uL，以84-mer為模板，取84-mer I uL, 100 nM 引物 Telomere Forward I uL, 100 nM引物Telomere ReverseluL,余量為 PCR 反應(yīng)液。RT-qPCR 反應(yīng)條件95°C 10 min, 40 個循環(huán)(95°C 15 sec, 60 °C I min)
2)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
A)將 84-mer 梯度稀釋1，10ィ，1(Γ2，1(Γ3，1θΛ 1(Γ5，10'84-mer寡核苷酸鏈總長度計算方法如下
假設(shè)姆個反應(yīng)需未稀釋84-mer 60pg,即60X 1(T12 g,已知84-mer的相對分子量為26667. 2 ；
平均ー個 84-mer 的質(zhì)量為2.6667 X IO4 / 6. 02 X IO23 = O. 44 X 1(Γ19 ;
每個PCR反應(yīng)體系中未稀釋84-mer總量為60 X 1(Γ12 / O. 44 X 1(Γ19 = I. 36X 109，因此每個PCR反應(yīng)體系中未稀釋84-mer總長度為1.36 X IO9X 84= I. 18 X105kb ；
同理可得不同稀釋濃度84-mer在每個反應(yīng)體系中的總長度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線I (圖1)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為log (TL) =-4. 86CT+40. 14，其中TL為總長度。3、利用36B4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
O 36B4 75 bp的RT-qPCR反應(yīng)條件RT-qPCR反應(yīng)體系為20 uL，以36B4為模板，取 36B4 IuL , 100 nM 36B4 Forward IuL, 100 nM 36B4 Reverse luL，余量為 PCR 反應(yīng)液。RT-qPCR 反應(yīng)條件95 °C 10 min, 40 個循環(huán)(95°C 15 sec, 60 °C I min)
將 75 bp 的 36B4 梯度稀釋1，ΚΓ1，1(Γ2，1(Γ3，1θΛ 1(Γ5，1(Γ6 ；
36Β4為75 bp，相對分子量為23268. I ；
平均ー個 36B4 75 bp 質(zhì)量為 2. 32681 X IO4 / 6. 02 X IO23 = 0. 38 X 1(T19 g ；
假設(shè)反應(yīng)體系中最高濃度75 bp 36B4含量為200 pg，那么每個反應(yīng)體系中75 bp 36B4的拷貝數(shù)為:200 X 10ィ2 / 0. 38 X 10ィ9 /2= 2. 63 X IO9 ；
同理可得不同稀釋濃度反應(yīng)體系中75 bp 36B4拷貝數(shù)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線2 (圖2)。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為log (TC) =-5. llCT+39. 57 ，其中TC為36B4基因的拷貝數(shù)。因?yàn)?6B4基因是單拷貝基因，是做RT-qPCR常用的內(nèi)參基因之一，所以知道了 gDNA中36B4的拷貝數(shù)就等于知道了樣品中染色體的拷貝數(shù)，才可以計算端粒平均長度的絕對值。4、RT-qPCR擴(kuò)增gDNA樣品中端粒和75 bp的36B4 (內(nèi)參)
實(shí)施例I所獲得gDNA樣品中端粒的RT-qPCR反應(yīng)條件RT_qPCR反應(yīng)體系為20 uL，gDNA I uL, 100 nM Telomere Forward I uL, 100 nM Telomere Reverse I uL (這里的引物跟84mer的引物是ー樣的)，余量為PCR反應(yīng)液；PCR反應(yīng)條件為95°C 10 min, 40個循環(huán)(95で 15 sec, 600C I min)。步驟gDNA樣品中75 bp的36B4的RT-qPCR反應(yīng)條件RT-qPCR反應(yīng)體系為20 uL，其中36B4 I uL ,100 nM 引物36B4 Forward I uL，100 nM 引物36B4 Reverse I uL，余量為PCR反應(yīng)液。RT-qPCR反應(yīng)條件95°C 10 min, 40個循環(huán)(95°C 15 sec,60°C I min)。將步驟(4)獲得的gDNA樣品中端粒和36B4的Ct值，分別代入兩個標(biāo)準(zhǔn)曲線方程， 即 log (TL) = (CT (telomere)-40. 14) / -4. 86，其中 TL 為樣品中端?？傞L度；L0G (TC) = (CT(36b4)-39. 57) / -5. 11，其中TC為樣品中端?？截悢?shù)，即可以計算端粒平均長度=端?？傞L度/端粒拷貝數(shù)。
因?yàn)?4mer是(TTAGGG)14，相當(dāng)于人工合成的端粒重復(fù)序列，與細(xì)胞中的端粒序列并無區(qū)別，所以用人工合成的端粒序列做標(biāo)準(zhǔn)曲線是可以用于計算樣品中真正的端粒的長度的；同理人工合成的36B4片段也可用于計算樣品中的36B4拷貝數(shù)。另外，計算平均長度的公式只是ー個簡單的數(shù)學(xué)計算，比如一輛汽車行駛的日平均里程=總的行駛里程/天數(shù)，這樣的公式是不用詳細(xì)推導(dǎo)的，同理，樣品中端粒的平均長度、端粒的總長度和端粒的拷貝數(shù)(即染色體拷貝數(shù))之間的關(guān)系也是顯而易見的，無需推導(dǎo)。對比例TRF法測端粒的平均長度(參考Aubert等，Telomere lengthmeasurement—しaveats ana a critical assessment of tne available technologiesand tools. Mutat Res. 2012 Feb I; 730 (1-2) : 59-67.)
1).將0.5ug gDNA樣品用Hae III (購自NEB)酶完全消化； 2).消化后的gDNA片段由瓊脂糖凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至尼龍膜上；
3).使用放射性32P標(biāo)記的探針32P-(TTAGGG) 7與尼龍膜上的端粒片段雜交；
4).通過放射自顯影檢測各個樣品端粒片段的長度。將TRF法測得的端粒長度取對數(shù)，然后將其與RT-qPCR法測得的樣品端粒平均長度絕對值做圖，可得如圖3所示，各數(shù)據(jù)點(diǎn)的趨勢線為一條直線，顯示本專利涉及的RT-qPCR法所測得的端粒平均長度絕對值與經(jīng)典的TRF法所測得的結(jié)果有很強(qiáng)的相關(guān)性，是可信賴的結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒，其特征在于包括盒體，襯墊，PCR 反應(yīng)液，Taq 酶，136B4 Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, TelomereReverse，84-mer，36B4片段，襯墊上設(shè)有容器空分別放置PCR反應(yīng)液，Taq酶，136B4Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, Telomere Reverse,84—mer ; 其中所述的36B4 Forward的核苷酸序列為Seq NO :1 ; 36B4 Reverse的核昔酸序列為Seq NO 2 ； Telomere Forward的核昔酸序列為見Seq NO 3 ； Telomere Reverse 的核昔酸序列為 Seq NO -A ； 84-mer的核苷酸序列為Seq NO 5 ； 36B4片段的核苷酸序列為見Seq NO :6。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒，其特征在于所述的PCR反應(yīng)液含有PCR緩沖液、I X SYBR Green master mix, dNTPs。
3.一種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于按步驟實(shí)現(xiàn) 從人外周血細(xì)胞中獲取基因組DNA ； 使用權(quán)利要求I所述的試劑盒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用來計算RT-qPCR反應(yīng)中樣品端粒的總長度和反應(yīng)中染色體的總拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線I使用濃度梯度為LIO'IO^IO'IO^KT5，10_6的人工合成的84-mer寡核苷酸作為模板，RT-qPCR反應(yīng)的Ct值繪制；標(biāo)準(zhǔn)曲線2使用人工合成的36B4片段作為模板，RT-qPCR反應(yīng)的CT值繪制，其濃度梯度為1，10—1，10_2，10_3，10_4，10_5，10_6 ;使用RT-qPCR擴(kuò)增步驟A中獲得的樣品gDNA中的端粒片段和36B4基因片段，獲得相應(yīng)的Ct值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中端粒的總長度和樣品中36B4基因的拷貝數(shù)；計算樣品中端粒平均長度絕對值端粒平均長度=端?？傞L度/ 36B4拷貝數(shù)；其中PCR反應(yīng)條件為95°C變性10 min，然后95°C 15sec，60°C I min，共40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及試劑盒，特別涉及一種實(shí)時定量PCR測量樣品中染色體端粒平均長度的絕對值的試劑盒及應(yīng)用；一種用RT-qPCR法測量端粒平均長度絕對值的試劑盒，其特征在于包括盒體，襯墊，PCR反應(yīng)液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer，36B4片段，襯墊上設(shè)有容器空分別放置PCR反應(yīng)液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer；端粒的縮短被認(rèn)為與細(xì)胞的衰老和癌癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。同時，細(xì)胞內(nèi)每條染色體兩端的端粒并不是以相同的速度縮短，有的端粒因?yàn)槟承┰驎蝗淮蠓茸兌?，形成相對短的端粒。?dāng)這些短端粒達(dá)到或超過某一極限，就會導(dǎo)致細(xì)胞的衰來死亡，或者如癌癥等的疾病。因此，準(zhǔn)確地檢測細(xì)胞端粒長度，對預(yù)防衰老和預(yù)防癌癥的發(fā)生都能起到非常大的幫助。本發(fā)明采用試劑盒可以方便，快捷測定端粒的平均長度的絕對值，使用工業(yè)生產(chǎn)或檢測。
文檔編號G01N21/64GK102660650SQ20121016516
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者全利, 葉亞東, 葉汝章, 張娟, 朱兆云, 朱文華, 滕凌, 潘鸝, 胡娟, 路易斯伊格納羅, 郝小江 申請人:云南路易斯中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心