專利名稱：一種抑制端粒酶活性的肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。發(fā)明涉及一種高效抑制端粒酶活性的蛋白肽段及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
端粒酶(Telomerase)是一種合成和延伸細(xì)胞染色體端粒的核糖核蛋白，它包含兩種基本成分逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基hTERT和RNA組分hTR。端粒酶能以自身RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成端粒重復(fù)列，加到染色體的末端，以彌補(bǔ)細(xì)胞分裂時(shí)端粒DNA的丟失，維持端粒的長(zhǎng)度。研究表明在正常人體細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性幾乎檢測(cè)不到，因此，人正常體細(xì)胞分裂次數(shù)是有限的，細(xì)胞每分裂一次，端粒便丟失50-200bp，當(dāng)端?？s短到一定程度時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，即稱為細(xì)胞衰老，并走向死亡。然而，在絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞(85%)中普遍可以檢測(cè)到端粒酶活性且活性較強(qiáng)，端粒酶對(duì)端粒的重新合成補(bǔ)償了它在細(xì)胞繁殖過程中的持續(xù)丟失，從而使得細(xì)胞可以不斷的分裂，這是細(xì)胞永生化和癌變的一個(gè)重要機(jī)制。Kim等分析總結(jié)了大量研究結(jié)果，檢測(cè)了 100多種惡性腫瘤標(biāo)本，指出端粒酶診斷腫瘤的敏感性為85%，特異性為91%，陽性預(yù)測(cè)值為91%，陰性預(yù)測(cè)值為81%，充分表明端粒酶在腫瘤診斷中的價(jià)值(Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 1994 Dec 23 ；266 (5193) :2011-5.)。端粒酶的激活被認(rèn)為是發(fā)生惡性腫瘤的主要因素之一，其激活及表達(dá)程度與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制端粒酶并使端?？s短被認(rèn)為是抑制癌細(xì)胞的一種機(jī)制，因此端粒酶成為腫瘤靶向治療的理想靶點(diǎn)。有許多公司正在開發(fā)端粒酶抑制劑治療腫瘤，其中GRN163L已經(jīng)開始了臨床2期實(shí)驗(yàn)，幾個(gè)端粒酶疫苗也即將完成臨床試驗(yàn)進(jìn)入市場(chǎng)。LPTS (Liver Putative Tumor Suppressor)是本發(fā)明人利用定位克隆的方法從人的正常肝cDNA文庫中得到的一個(gè)肝相關(guān)的候選抑癌新基因[C.Liao，Μ. J. Zhao, H. Song，K.Uchida，K.K. Yokoyama，T.P.Li，Identification of the gene for a novel liver-related putative tumor suppressor at a high-frequency loss of heterozygosity region of chromosome 8p23 in human hepatocellular carcinoma. Hepatology 2000，32721-727]。LPTS基因定位于人第8號(hào)染色體區(qū)段，該區(qū)段在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高頻缺失。研究表明LPTS在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中表達(dá)量極低或檢測(cè)不到，將LPTS基因?qū)敫伟┘?xì)胞，能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、最后引起死亡 [Liao C，Zhao MJ ；Mutation analysis of novel human liver-related putative tumor suppressor gene in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol，2003，9 89-93]]。LPTS基因于2004年已獲得中國發(fā)明專利授權(quán)(趙慕鈞等“一種肝癌相關(guān)基因及其應(yīng)用”，專利號(hào)ZL 00115395. 1，專利權(quán)人中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所；授權(quán)公告日2004年10月13日)。2001年Lu博士的實(shí)驗(yàn)室報(bào)導(dǎo)了 LPTS基因的另一個(gè)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本PinXl，發(fā)現(xiàn)PinXl編碼的蛋白可以結(jié)合端粒酶催化亞基hTERT并抑制端粒酶活性BhouΧ. Z. ,Lu K. P ； The Pin2/TRFl_interacting protein PinXl is a potent telomerase inhibitor. Cell，2001，107，347-359]，從機(jī)制上第一次證明了 LPTS/PinXl 作為一種天然的端粒酶抑制蛋白可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，為腫瘤的靶向治療提供了新的途徑。本發(fā)明人在2005年申請(qǐng)了一項(xiàng)有關(guān)制備LPTS蛋白的發(fā)明專利(趙慕鈞等“端粒酶活性抑制蛋白的制備和純化”，專利申請(qǐng)?zhí)?200510030526. 5，申請(qǐng)日:2005年10月14日；專利權(quán)人中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)。在該專利中提供了 LPTS蛋白(LPGENE1)和LPTS抑制端粒酶的活性片段LPTS133-328(LPGENE》的制備方法，并提供了 LPTS抑制端粒酶的活性片段位于其C端的133-3 氨基酸殘基。本發(fā)明人在2008年申請(qǐng)的專利揭示了 TAT與LPTS133-328 的融合蛋白(專利申請(qǐng)?zhí)?008100413 . 4)，經(jīng)證實(shí)該融合蛋白可穿透細(xì)胞膜的且具有極其優(yōu)異的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。鑒于LPTS蛋白是一種與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)的重要的蛋白，因此非常需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步地深入研究，以開發(fā)出更為有效的腫瘤抑制藥物，滿足臨床應(yīng)用所需。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高效抑制端粒酶活性的蛋白肽段及其制備和應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽(蛋白)，所述多肽是(a)包含SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的多肽；(b) SEQ ID NO 1氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)(如1_10個(gè)；較佳地1_5個(gè)；更佳地 1-3個(gè))氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(C)與(a)限定的多肽序列有90% (較佳地95%，更佳地98%，最佳地99% )以上相同性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽不具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列(LPTS全長(zhǎng)序列)，SEQ ID NO 2中第133-328位所示氨基酸序列(LPTSm8)和SEQ ID NO 2中第 2討-3觀位所示氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽包含SEQ ID NO 2中第255 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第256 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 257 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第258 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第259 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 260 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第261 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第262 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 263 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第264 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第265 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 266 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第267 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第268 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 269 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第270 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第271 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 272 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第273 3 位所示氨基酸序列，或
包含SEQ ID NO 2中第274 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 275 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第276 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第277 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 278 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第279 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第280 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 281 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第282 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第283 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 284 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第285 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第286 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 287 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO :2中第288 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第289 3 位所示氨基酸序列，或包含SEQ ID NO 2中第 290 3 位所示氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，它含有一核苷酸序列，該核苷酸序列編碼所述的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有所述的載體。在本發(fā)明的另一方面，提供一種所述的多肽的制備方法，該方法包括(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出所述的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制備抑制細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于防治端粒酶異常激活相關(guān)疾病。在另一優(yōu)選例中，所述的端粒酶異常激活相關(guān)疾病是腫瘤。在本發(fā)明的另一方面，提供一種復(fù)合物，所述的復(fù)合物包含所述的多肽，以及與該多肽相容的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)合物是融合蛋白，所述的多肽與至少一條功能性蛋白相連接(較佳地通過肽鍵連接)，所述的功能性蛋白有5-500個(gè)(較佳地5-300個(gè)；更佳地 10-250個(gè))氨基酸。在另一優(yōu)選例中，所述的功能性蛋白選自穿膜蛋白(如反式激活蛋白TAT)，標(biāo)簽蛋白(如GST蛋白)，報(bào)告蛋白(如GFP蛋白)，人血清白蛋白(延長(zhǎng)半衰期)，人IgGl =Fc 片段(延長(zhǎng)半衰期)。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽與所述的功能性蛋白直接相連，或通過連接肽連接。 所述連接肽的長(zhǎng)度為1-20個(gè)氨基酸，更佳為2-10個(gè)氨基酸。如所述連接肽的氨基酸序列為GGS。在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白不具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列(LPTS全長(zhǎng)序列)，SEQ ID NO 2中第133-328位所示氨基酸序列(LPTS133_328)和SEQ ID NO 2中第 2討-3觀位所示氨基酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)合物包含選自以下的物質(zhì)蛋白活性促進(jìn)劑、蛋白活性穩(wěn)定劑、延長(zhǎng)蛋白半衰期的制劑(如PEG，PEG-脂質(zhì)體)。
在本發(fā)明的另一方面，提供一種組合物，它含有安全有效量的所述的多肽或所述的復(fù)合物，以及藥學(xué)上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于抑制細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于防治端粒酶活性增高腫瘤。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備組合物的方法，所述組合物抑制細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性，所述方法包括將安全有效量的所述的多肽或所述的復(fù)合物與藥學(xué)上可接受的載體混合。在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥盒，所述藥盒中含有所述的多肽；或含有所述的復(fù)合物；或含有所述的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的藥盒用于抑制細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性。在另一優(yōu)選例中，所述的藥盒用于防治端粒酶活性增高腫瘤。在本發(fā)明的另一方面，提供一種(優(yōu)選體外，優(yōu)選非治療性地)抑制細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的方法，包括給予受試者有效量的所述的多肽；或所述的復(fù)合物；或所述的組合物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、SDS-PAGE顯示GST_LPTS29(1_328融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化。泳道1為IPTG誘導(dǎo)前的GST-LPTS29ch328基因工程菌表達(dá)的蛋白；泳道2為IPTG誘導(dǎo)后該工程菌表達(dá)的蛋白；泳道3-5為純化后收集到的3管GST-LPTS29ch328蛋白。圖2、GST-LPI^29Q_328，GST-LPTS133I8以及GST-LPTS抑制端粒酶活性的檢測(cè)與比較。A、GST-LPTS29ch328，GST_LPTS133_328 以及 GST-LPTS 融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；B,TRAP 法檢測(cè) GST-LPI^29ch328，GST-LPTS133I8 以及 GST-LPTS 蛋白抑制端粒酶的活性。蛋白的用量分別為5、10、25、50、100、200、250nM，如圖所示。GST蛋白作為對(duì)照。檢測(cè)樣品經(jīng)10% PAGE非變性膠電泳后銀染結(jié)果。圖3、LPTS290^328對(duì)肝癌BEL7404細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。A、Western Blot 檢測(cè) GFP、GFP-LPTS, GFP-LPTS29ch328 在其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 GFP/7404, GFP-LPTS/7404 和 GFP_LPTS29(1_328/7404 中的表達(dá)。兔源 anti_GFP 抗體作為雜交探針；B、MTT法繪制各穩(wěn)定細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線圖；C、GFP/7404, GFP-LPTS/7404 和 GFP_LPTS29(1_328/7404 等細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞狀態(tài)圖。圖中箭頭所指為處于危機(jī)期、衰老癥狀的細(xì)胞，D、為脫壁死亡后的 GFP-LPI^29Q_328/7404 細(xì)胞。圖4、Southern Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LPTS和LPTS29ch328對(duì)肝癌BEL7404細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的影響。A、轉(zhuǎn)染GFP或GFP-LPTS的BEL7404細(xì)胞經(jīng)FACS分選后持續(xù)培養(yǎng)，選取不同的培養(yǎng)代數(shù)(PD)細(xì)胞如圖所示，抽取其基因組DNAJSHinf I和Afa I內(nèi)切酶消化后與單鏈端粒重復(fù)序列(TTAGGG) 6探針雜交； B、轉(zhuǎn)染GFP或GFP-LPTS29ch328的BEL7404細(xì)胞經(jīng)FACS流式細(xì)胞儀分選后倍增8代，抽取其基因組DNA，經(jīng)Hinf I和Afa I內(nèi)切酶消化后與單鏈端粒重復(fù)序列32p_ (TTAGGG) 6探針雜交。本圖為放射自顯影后的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次分離到LPTS蛋白(全長(zhǎng)序列如SEQ ID NO 2)的抑制端粒酶的活性區(qū)域，該活性區(qū)域位于LPTS蛋白的第290-3 位(LPTS29ch328)。該活性區(qū)域的活性超過全長(zhǎng)LPTS蛋白及LPTS上的其它片段，并能更快地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。本發(fā)明為腫瘤的靶向治療提供了更為有效的抑制端粒酶活性的蛋白。術(shù)語如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用，“對(duì)象”、“個(gè)體”、或“患者”指需要進(jìn)行診斷或治療的任何目標(biāo)，尤其是哺乳動(dòng)物對(duì)象，特別是人，其它對(duì)象包括牛、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等。特別受關(guān)注的是那些端粒酶異常激活的對(duì)象。如本文所用，“核酸”和“核酸序列”指聚合形式的任意長(zhǎng)度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)。它包括(但不限于)單鏈、雙鏈的DNA或RNA，基因組DNA和cDNA。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑或稀釋劑。如本文所用，“有效量”或“安全有效量”指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個(gè)體的量對(duì)治療或預(yù)防是有效的。該用量根據(jù)所治療個(gè)體的健康狀況和生理狀況、所治療個(gè)體的類別 (如非人靈長(zhǎng)類等)、治療醫(yī)師對(duì)醫(yī)療狀況的評(píng)估、及其它的相關(guān)因素而定。預(yù)計(jì)該用量將在相對(duì)較寬的范圍內(nèi)，可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)
成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。本發(fā)明的多肽及其編碼基因LPTS是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)可以直接和人端粒酶催化亞基hTERT結(jié)合并抑制端粒酶催化活性的蛋白。本發(fā)明人以全長(zhǎng)的LPTS蛋白為基礎(chǔ)，預(yù)測(cè)并篩選了多種LPTS序列片段，經(jīng)過反復(fù)研究比較，發(fā)現(xiàn)LPTS蛋白抑制端粒酶的活性區(qū)域可以縮小到該蛋白的第四0-3觀位氨基酸序列區(qū)域內(nèi)，該位置才是抑制端粒酶催化活性的最關(guān)鍵區(qū)域，其足以發(fā)揮抑制端粒酶催化活性的作用，從而獲得了本發(fā)明的多肽。為了驗(yàn)證所述的多肽的功能，本發(fā)明人在體外通過基因工程技術(shù)表達(dá)了 GST-LPTS29ch328融合蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用測(cè)定端粒酶活性的 TRAP(telomeric repeat amplification protocol)實(shí)驗(yàn)技術(shù),檢測(cè)了 GST_LPI^29(I_328 融合蛋白在體外抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶的活性。該方法是一種基于PCR技術(shù)的端粒酶活性檢測(cè)方法，端粒酶來源于一種肝癌細(xì)胞裂解液。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)GST-LPTS29ch328有很強(qiáng)的抑制端粒酶
7的活性。為此，本發(fā)明人進(jìn)一步比較了 GST-LPTS2H與GST-LPTS和GST-LPTS133,蛋白的活性。檢測(cè)結(jié)果表明GST-LPTS和GST-LPTS133I8蛋白在50nM的時(shí)候顯示有抑制端粒酶的活性，IOOnM的時(shí)候抑制活性較強(qiáng)，但不能完全抑制反應(yīng)體系中的端粒酶；而LPTS29ch328在 50ηΜ的時(shí)候抑制活性已很強(qiáng)，在IOOnM的時(shí)候可完全抑制體系中的端粒酶活性。以上結(jié)果說明LPTS29ch328具有比全長(zhǎng)LPTS和LPTS133_328更強(qiáng)的端粒酶抑制活性，是LPTS蛋白抑制端粒酶活性的功能域。為了檢測(cè)LPTS29c^8在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞的活性，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，構(gòu)建了 LPTS29ch328、LPTS與綠色熒光蛋白GFP融合的真核表達(dá)質(zhì)粒，GFP-LPTS29ch328和GFP-LPTS。 在肝癌BEL7404細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染GFP-LPTS29ch328，GFP-LPTS以及對(duì)照GFP表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)2周的G418篩選之后，分別采用流式細(xì)胞儀FACS分選出有綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞，然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。分選得到的GFP-LPTS29Q_328/7404，GFP-LPTS/7404, GFP/7404細(xì)胞，利用兔源 anti-GFP多克隆抗體進(jìn)行western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)都可以穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)的蛋白。在細(xì)胞傳代培養(yǎng)的過程中，GFP-LPTS290_328/7404細(xì)胞的生長(zhǎng)較GFP-LPTS/7404和GFP/7404的要慢。本發(fā)明人選取FACS分選后倍增5代的上述穩(wěn)定細(xì)胞株，進(jìn)行了 MTT試驗(yàn)，并繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果證明，與對(duì)照GFP/7404細(xì)胞相比較，GFP-LPTS29Q_328/7404細(xì)胞生長(zhǎng)最慢，GFP-LPTS/7404 漸次。說明LPTS29c^8抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能力較其全長(zhǎng)蛋白LPTS要強(qiáng)。在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)LPTS蛋白，可以導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)變慢、變扁平、進(jìn)入危機(jī)期，最終死亡。但這是一個(gè)較長(zhǎng)期的效應(yīng)，一般需要培養(yǎng)6周后出現(xiàn)。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染LPTS29ch328后，很快發(fā)生死亡，經(jīng)2周的G418篩選之后只能獲得少量細(xì)胞進(jìn)行FACS分選，分選獲得的LPTS29(i_328/7404細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)10天左右，就相繼出現(xiàn)衰老癥狀，并且很快就全部變圓后脫壁死亡。結(jié)果說明過表達(dá) LPTS29c^8導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的能力很強(qiáng)，可能比LPTS全長(zhǎng)蛋白抑制腫瘤的效率要高，更有應(yīng)用價(jià)值。為了證明LPTS29c^8抑制腫瘤細(xì)胞是靶向抑制細(xì)胞端粒的合成，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用 Southern Blot 方法檢測(cè)了 GFP_LPTS29(1_328/7404，GFP-LPTS/7404，GFP/7404 細(xì)胞端粒的長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照GFP/7404細(xì)胞傳代過程中端粒保持穩(wěn)定，長(zhǎng)度在 4. 5kb左右；GFP-LPTS/7404細(xì)胞在傳代過程中端粒逐漸縮段，在培養(yǎng)第5代時(shí)端?？s短至 3. 8kb左右，第25代的時(shí)候端?？s短到2. 8kb左右；GFP-LPTS29(1_328/7404細(xì)胞傳代時(shí)間短， 培養(yǎng)過程中細(xì)胞死亡多，在第8代時(shí)端粒已經(jīng)縮短至2. 5kb左右了。結(jié)果說明，LPTS29ch328有著非常強(qiáng)的端粒酶抑制活性，其在細(xì)胞體內(nèi)能抑制端粒的合成和延伸，是一種靶向抑制端粒酶的腫瘤抑制肽。由于本發(fā)明揭示了抑制端粒酶催化活性的最關(guān)鍵區(qū)域，因此可以理解，一些蛋白 (比如一些包含有本發(fā)明的多肽的融合蛋白)，只要它們包含有該最關(guān)鍵區(qū)域、且不包含影響該關(guān)鍵區(qū)域結(jié)構(gòu)或活性的因素(可通過有限次實(shí)驗(yàn)方便地驗(yàn)證)，也將具有抑制端粒酶催化活性的作用，這些蛋白也被包含在本發(fā)明中。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主， 本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括所述多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明所述多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。本發(fā)明還包括具有與所述多肽相同功能的、SEQ ID NO :1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-10個(gè)，較佳地1-5個(gè)，更佳地1-3個(gè)， 最佳地1-2個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為10個(gè)以內(nèi)，較佳地為5個(gè)以內(nèi)，更佳地為3個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中， 用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和 /或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括所述多肽的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與所述多肽雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗所述多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含所述多肽或其片段的融合蛋白。發(fā)明還提供所述多肽或多肽的類似物。這些類似物與天然所述多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“所述多肽保守性變異多肽”指與SEQ ID NO 1的氨基酸序列相比， 有至多10個(gè)，較佳地至多5個(gè)，更佳地至多3個(gè)，最佳地至多2個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表 權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽是(a)包含SEQID NO 1所示氨基酸序列的多肽；(b)SEQID NO :1氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)與(a)限定的多肽序列有90%以上相同性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，該核苷酸序列編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
3.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
4.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的載體。
5.一種權(quán)利要求1的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包括(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出權(quán)利要求1的多肽。
6.權(quán)利要求1所述的多肽的用途，用于制備抑制細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的組合物。
7.如權(quán)利要求6所述的多肽的用途，所述的組合物用于防治端粒酶異常激活相關(guān)疾病。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的端粒酶異常激活相關(guān)疾病是腫瘤。
9.一種復(fù)合物，所述的復(fù)合物包含權(quán)利要求1所述的多肽，以及與該多肽相容的物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9所述的復(fù)合物，其特征在于，所述的復(fù)合物是融合蛋白，權(quán)利要求1所述的多肽與至少一條功能性蛋白相連接，所述的功能性蛋白有5-500個(gè)氨基酸。
11.如權(quán)利要求9所述的復(fù)合物，其特征在于，所述的復(fù)合物包含選自以下的物質(zhì)蛋白活性促進(jìn)劑、蛋白活性穩(wěn)定劑、延長(zhǎng)蛋白半衰期的制劑。
12.—種組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽或權(quán)利要求 9所述的復(fù)合物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
13.一種制備組合物的方法，所述組合物抑制細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性，所述方法包括將安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽或權(quán)利要求9所述的復(fù)合物與藥學(xué)上可接受的載體混合O
14.一種藥盒，其特征在于，所述藥盒中含有權(quán)利要求1所述的多肽；或含有權(quán)利要求9 所述的復(fù)合物；或含有權(quán)利要求12所述的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抑制端粒酶活性的肽及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的肽具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性的功能。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的肽可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本發(fā)明的肽能夠?qū)Ｒ恍砸种贫肆Ｃ?，在腫瘤的靶向治療中具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102311493SQ20111018460
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者馮劍, 李載平, 答亮, 趙慕鈞, 趙靜, 陳光明, 陳國元 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院