專利名稱：一種端粒酶活性的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種端粒酶活性的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
端粒酶是一種核糖核蛋白，含有蛋白質(zhì)及與端粒DNA互補(bǔ)的自身RNA模板，催化合成并維持端粒的一定序列。端粒在不同物種細(xì)胞中對(duì)于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，端粒酶能延長(zhǎng)縮短的端粒(縮短的端粒其細(xì)胞復(fù)制能力受限)，從而增強(qiáng)體外細(xì)胞的增殖能力，在保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞長(zhǎng)期活性和潛在的繼續(xù)增殖能力等方面有重要作用。但是，在正常人體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到相當(dāng)嚴(yán)密的調(diào)控，只有在造血細(xì)胞、 干細(xì)胞和生殖細(xì)胞，這些必須不斷分裂克隆的細(xì)胞之中，才可以偵測(cè)到具有活性的端粒酶。 當(dāng)細(xì)胞分化成熟后，必須負(fù)責(zé)身體中各種不同組織的需求，各司其職，于是，端粒酶的活性就會(huì)漸漸的消失。“端粒-端粒酶假說(shuō)”認(rèn)為端粒酶的激活與細(xì)胞永生化和惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都成端粒酶陽(yáng)性，而在癌旁組織和正常組織中端粒酶陽(yáng)性率很低，基于上述原因，端粒酶可以作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床研究和檢驗(yàn)。因此，端粒酶活性的檢測(cè)已經(jīng)成為生物科學(xué)和腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。最早的端粒酶活性檢測(cè)方法是 1985年提出的，該方法通過(guò)細(xì)胞提取物與合成的寡核苷酸保溫，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和進(jìn)行放射自顯影，檢測(cè)寡核苷酸末端加入的端粒重復(fù)片段，并由此在四膜蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)了端粒酶的存在。由于這個(gè)方法的靈敏度較低，檢測(cè)時(shí)需要大量的細(xì)胞抽提物，因此其應(yīng)用受到了很大的限制，只能檢測(cè)少數(shù)種類樣本的端粒酶活性，如低等真核生物或一些永生化細(xì)胞，對(duì)于高等生物端粒酶活性檢測(cè)則無(wú)能為力。TRAP法出現(xiàn)后，端粒酶研究有了飛速發(fā)展，可以大量應(yīng)用到各種臨床樣本檢測(cè)。該方法分為兩步，首先端粒酶延伸非端粒引物TS，生成端粒重復(fù)序列，然后在TS和端粒序列互補(bǔ)引物CX作用下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物再經(jīng)電泳和放射性顯影檢測(cè)。但由于PCR反應(yīng)的反向引物是端粒重復(fù)的互補(bǔ)序列，可結(jié)合在端粒重復(fù)序列的任意部位，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度發(fā)生變化(變長(zhǎng)或變短)，不能如實(shí)反映端粒酶的持續(xù)合成能力。 TRAP法中PCR擴(kuò)增要求在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中，兩個(gè)引物結(jié)合到模板DNA的3'末端，這樣擴(kuò)增產(chǎn)物才能表現(xiàn)為不均一長(zhǎng)度的電泳條帶。在TRAP反應(yīng)中，引物TS是隨機(jī)序列，它與模板專一結(jié)合；引物CX是端?；パa(bǔ)序列，它可結(jié)合在端粒酶延伸產(chǎn)物的任何部位。因此PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度發(fā)生變化，這種變化有一定隨機(jī)性，在擴(kuò)增的每一個(gè)循環(huán)中CX的結(jié)合位點(diǎn)都會(huì)發(fā)生改變。結(jié)果是擴(kuò)增的產(chǎn)物越來(lái)越短。另一方面，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物也可能比原初端粒酶產(chǎn)物長(zhǎng)，因?yàn)镃X引物是4個(gè)CCCTAA構(gòu)成的重復(fù)，在PCR引物退火時(shí)，它可以用其中3個(gè)重復(fù)與模板的3’末端發(fā)生交錯(cuò)退火，最后一個(gè)重復(fù)作為模板延伸端粒酶產(chǎn)物的3'末端。這樣每一個(gè)循環(huán)后，PCR產(chǎn)物將延伸6個(gè)bp，多個(gè)循環(huán)后，將使原初產(chǎn)物的長(zhǎng)度有較大的延長(zhǎng)。因此TRAP法無(wú)法反映端粒酶延伸產(chǎn)物最初的性質(zhì)，包括產(chǎn)物的長(zhǎng)度和含量。
其次，由于在TRAP反應(yīng)中，反向引物CX是端粒重復(fù)互補(bǔ)序列，而端粒酶底物 TS雖然被稱為非端粒序列，但為了實(shí)現(xiàn)端粒酶對(duì)底物的識(shí)別和延伸，TS引物的3'末端 (AGAGTT)實(shí)際上是端粒序列，有5個(gè)與端粒序列一致，只有中間的A不同于端粒序列。因此TS在PCR反應(yīng)中很容易與反向引物CX形成3'末端互補(bǔ)，進(jìn)而形成引物二聚體。這個(gè)二聚體較短，在隨后的PCR擴(kuò)增中很容易形成優(yōu)勢(shì)，干擾真正端粒酶產(chǎn)物的擴(kuò)增。而且引物二聚體還可通過(guò)上面所述與CX交錯(cuò)退火的延長(zhǎng)機(jī)制，形成人工產(chǎn)物(artifact)，人工產(chǎn)物經(jīng) PCR擴(kuò)增后也表現(xiàn)為間隔6個(gè)bp的ladder，與真正的擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)法區(qū)分，造成假陽(yáng)性結(jié)果。再次，利用TRAP法檢測(cè)持續(xù)合成能力較差的端粒酶活性時(shí)由于其末端較短，不利于PCR擴(kuò)增，因而檢測(cè)不到端粒酶活性，限制了 TRAP反應(yīng)的實(shí)際應(yīng)用效果。此外，TRAP技術(shù)檢測(cè)端粒酶活性需要電泳及銀染或者放射性同位素標(biāo)記，方法十分繁雜，比較費(fèi)時(shí)，而且使用放射性同位素，有一定的危害，且污染物處理比較困難，限制了 TRAP法應(yīng)用。因此，提供一種靈敏度更高、特異性更強(qiáng)的端粒酶檢測(cè)方法具有現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種端粒酶活性的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法從待測(cè)樣品中獲得具有活性的端粒酶后，延伸TS引物得到端粒酶延伸產(chǎn)物，將端粒酶延伸產(chǎn)物作為模板， 在四個(gè)引物的存在下，進(jìn)行缺刻連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，將該擴(kuò)增產(chǎn)物與分子信標(biāo)混合反應(yīng)后熒光檢測(cè)或電泳檢測(cè)得到端粒酶活性。該檢測(cè)方法靈敏度高、特異性好，能夠有效檢測(cè)待測(cè)樣品中的端粒酶活性。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一種端粒酶活性的檢測(cè)方法，包括步驟1 從待測(cè)樣品中獲得端粒酶；步驟2 在所述端粒酶的作用下延伸具有如SEQ ID NO=I所示核苷酸序列的TS引物，得到端粒酶延伸產(chǎn)物；步驟3 將所述端粒酶延伸引物作為模板，在引物存在下進(jìn)行缺刻連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；步驟4 對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，得到所述端粒酶活性。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LigaseChain Reaction, LCR)是 Landegren 等人于 1988 年為檢出序列中點(diǎn)突變而設(shè)計(jì)、發(fā)明的。合成一對(duì)引物A、B，它們完成覆蓋了靶序列。經(jīng)退火與靶序列結(jié)合后，A、B間留下一個(gè)缺刻(nick)，加入連接酶封閉缺品，兩引物與靶序列完整的互補(bǔ)鏈。Wu等人又引入PCR的原理，在連接反應(yīng)后，變性、退火、再連接，少量的靶序列就被擴(kuò)增出來(lái)。Barany于1991年報(bào)道了耐熱連接酶-Taq連接酶的發(fā)現(xiàn)及其在LCR中的應(yīng)用， 為L(zhǎng)CR的實(shí)用化奠定了基礎(chǔ)。實(shí)際操作時(shí)引物為4個(gè)，A、A’和B、B’，分別與靶序列的正負(fù)鏈互補(bǔ)。每次連接反應(yīng)的產(chǎn)物又可在下一輪反應(yīng)中當(dāng)模板，靶序列以指數(shù)形式擴(kuò)增出來(lái)。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性首先取決于引物與模板的特異結(jié)合，其次Taq連接酶作用的特異性，即Taq連接酶是否僅連接與靶序列完全互補(bǔ)的引物。實(shí)驗(yàn)表明Taq連接酶的非特異連接活性是較低的(< )。控制模板、酶的濃度，使反應(yīng)在接近Taq酶的溫度下進(jìn)行，還可進(jìn)一步降低非特異連接率。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增效率與PCR相當(dāng)。由于有很高的信噪比，其敏感性也很高，產(chǎn)物檢測(cè)也非常方便、敏感。
本發(fā)明提供的檢測(cè)方法中，設(shè)計(jì)了具有如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的TS引物 (5' AATCCGTCGAGCAGAGTT3')，隨后將端粒酶延伸引物作為模板，在引物存在下進(jìn)行缺刻連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)得到端粒酶活性，避免了 TS在PCR反應(yīng)中很容易與反向引物CX形成3'末端互補(bǔ)，進(jìn)而形成引物二聚體，在隨后的PCR擴(kuò)增中很容易形成優(yōu)勢(shì)，干擾端粒酶產(chǎn)物的擴(kuò)增，同時(shí)避免了引物二聚體通過(guò)與CX交錯(cuò)退火的延長(zhǎng)機(jī)制形成的人工產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增后造成的假陽(yáng)性結(jié)果。為了提高本發(fā)明提供的檢測(cè)方法的特異性，涉及并篩選了大量引物。作為優(yōu)選，步驟3中所述缺刻連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的引物為Ρ”Ρ2、Ρ3和P4，其中P1具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列(5 ‘ -GCAATCCGTCGAGCA-3' )，P2具有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列(5 ‘-AGTTAGGGTTAGGGGCTCTCTTTACTGTG-3' )，P3 具有 SEQ ID NO :4 所示核苷酸序列(5 ‘ -CACAA TGGGCGCACCCCCTAACCCTAAC-3 ‘ )，P4具有SEQ ID NO 5所示核苷酸序列的所示核苷酸序列 (5 ‘ -TCTGCTCGACGGATTGC-3‘)。分子信標(biāo)(molecular beacon)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針， 兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見(jiàn)光形式釋放出來(lái)。分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)一般為15-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并與目標(biāo)序列互補(bǔ)；莖一般5-7個(gè)核苷酸長(zhǎng)，并相互配對(duì)形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團(tuán)標(biāo)記在探針的一端，而淬滅劑則標(biāo)記在另一端。在復(fù)性溫度下，因?yàn)槟０宀淮嬖跁r(shí)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)加熱變性會(huì)互補(bǔ)配對(duì)的莖環(huán)雙鏈解開(kāi)，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對(duì)，與模板配對(duì)后，分子信標(biāo)將成鏈狀而非發(fā)夾狀，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開(kāi)。因此該探針可以靈敏的檢測(cè)目標(biāo)序列，具體到本發(fā)明中，可以靈敏地檢測(cè)步驟3中所述擴(kuò)增產(chǎn)物。與底物相比擴(kuò)增產(chǎn)物為具有較長(zhǎng)莖結(jié)構(gòu)的雙鏈信標(biāo)靶序列，可以在作為信標(biāo)靶序列打開(kāi)信標(biāo)，通過(guò)熒光檢測(cè)，可以獲得端粒酶活性。作為優(yōu)選，本發(fā)明步驟4中所述檢測(cè)為將步驟3中所述擴(kuò)增產(chǎn)物與如SEQ ID NO 6 所示核苷酸序列(5' FAM-CGTTGCACAAAGACCCGGGACACAAGTGCAACG-DABCY3')的分子信標(biāo)混合反應(yīng)后進(jìn)行熒光檢測(cè)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的端粒酶活性檢測(cè)方法具體可以包括步驟1 從待測(cè)樣品中獲得具有活性的端粒酶；步驟2 在所述端粒酶的作用下延伸具有如SEQ ID NO=I所示核苷酸序列的TS引物，得到端粒酶延伸產(chǎn)物；步驟3:將所述端粒酶延伸引物作為模板，在？1、？2、&、？4四個(gè)引物的存在下，進(jìn)行缺刻連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，P1具有如SEQ ID NO :2所示核苷酸序列， P2具有如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列，P3具有如SEQ ID NO 4所示核苷酸序列，P4具有如SEQ ID NO 5所示核苷酸序列。步驟4:將所述擴(kuò)增產(chǎn)物與如SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的分子信標(biāo)混合反應(yīng)后，熒光或電泳檢測(cè)所述端粒酶活性。本發(fā)明提供的端粒酶活性的檢測(cè)方法，先從提取細(xì)胞或者組織的端粒酶產(chǎn)物，然后在端粒酶作用下延伸TS引物，使得TS引物延伸兩個(gè)以上的TTAGGG重復(fù)序列，取部分端粒酶延伸引物作為模板進(jìn)行缺刻連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，與底物相比擴(kuò)增產(chǎn)物為具有較長(zhǎng)莖結(jié)構(gòu)的雙鏈信標(biāo)靶序列，可以在作為信標(biāo)靶序列打開(kāi)信標(biāo)，通過(guò)熒光檢測(cè)，可以獲得端粒酶活性。端粒酶的提取方法2X IO6個(gè)細(xì)胞沉淀/組織0. Img加CHAPS裂解液(lOmmol/ L Tris-HCl, pH 7. 5, lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA，0. lmmol/L PMSF，5mmol/L 巰基乙醇， 0. 5 % w/v CHAPS (3- [ (3-膽酰胺丙 基)-二乙銨]-丙磺酸)，10 % w/v甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期間用移液器反復(fù)抽吸3次，保證充分裂解。HOOOrpm離心20min，吸取上清置-80°C保存?zhèn)溆谩Ｗ鳛閮?yōu)選，所述步驟2中延伸的體系為50 μ L體系中，10XTRAP緩沖液 (200mmol/L Tris-HCl, pH 8. 3,15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl,lOmmol/L EGTA) 5 μ L，dATP、dTTP 和 dGTP 各 50 μ mol/L, TS 引物為 150nmol/L，余量為無(wú)菌 DEPC 水。作為優(yōu)選，所述步驟2中延伸的反應(yīng)條件為25°C保溫20min。優(yōu)選地，所述步驟2中延伸的反應(yīng)條件為48 μ L延伸反應(yīng)體系中加入2 μ L端粒酶抽提物(ι μ g)，25°c保溫20min，反轉(zhuǎn)錄合成端粒酶延伸產(chǎn)物。作為優(yōu)選，所述步驟3中擴(kuò)增的反應(yīng)條件為90°C 30 60s，45 61°C 3 8min， 22 35個(gè)循環(huán)。作為優(yōu)選，所述步驟3中擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10XTaq ligase buffer IOv%, 50% PEG 0. 05 12. 5v%, P1, P2、P3、P4 終濃度分別為 100 500nmol/L，Went (exo-)DNA polymerase 0. 2 0. 5U/20 μ L 體系，9° N ligase 2 4U/20 μ L 體系，所述步驟 2 得到的端粒酶延伸產(chǎn)物0. 05ν%，余量為無(wú)菌水。作為優(yōu)選，所述步驟3中擴(kuò)增的體系為20μ 體系中，IOXTaq ligase buffer 2μ L,50% PEG 1 2· 5 μ I^PpPyPyP4 各 100 500nmol/L，Went (exo_)DNA polymerase 0. 2 0. 5U，9° N ligase 2 4U，所述步驟2得到的端粒酶延伸產(chǎn)物1 μ L，余量為無(wú)菌水。優(yōu)選地，所述步驟3中擴(kuò)增的體系為20yL體系中，IOXTaq ligase buffer 2μ L,50% PEG 2μ L, P1^ P2> P3> P4 # 500nmol/L, Went (exo-)DNA polymerase 0.4U，9° N ligase 4U，所述步驟2得到的端粒酶延伸產(chǎn)物1 μ L，余量為無(wú)菌水。作為優(yōu)選，所述步驟3中擴(kuò)增前，還包括90°C加熱3min滅活端粒酶后補(bǔ)充dGTP 2 8μ mol/L的步驟。優(yōu)選地，所述步驟3中擴(kuò)增前，還包括90°C加熱3min滅活端粒酶后補(bǔ)充dGTP 5 μ mol/L的步驟。優(yōu)選地，反應(yīng)液90°C加熱3min滅活端粒酶，然后補(bǔ)充dGTP 5 μ M0然后進(jìn)行連接酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增，反應(yīng)條件90°C 30s, 48°C 8min,22 24個(gè)循環(huán)。連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程要連續(xù)進(jìn)行，任何中斷將導(dǎo)致反應(yīng)失敗。為了避免銀染或者放射性同位素標(biāo)記操作繁瑣且危害人體，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，步驟4中采用熒光檢測(cè)或電泳檢測(cè)的方法，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。作為優(yōu)選，所述步驟4中熒光檢測(cè)的反應(yīng)條件為61°C水浴鍋溫浴30min，加入所述擴(kuò)增產(chǎn)物平衡5min。作為優(yōu)選，以體積分?jǐn)?shù)計(jì)，所述步驟4中熒光檢測(cè)的反應(yīng)體系為10% 50 IOOmmol/L 的 Tris，0. 04% 1 5μ mol/L 的所述分子信標(biāo)，0. 004 0. 008% 250mmol/L 的 MgCl2，余量為無(wú)菌水。
作為優(yōu)選，所述步驟4中熒光檢測(cè)的反應(yīng)體系為250μ 體系中，25μ 50 IOOmmol/L 的 Tris，10 μ L 1 5 μ mol/L 的所述分子信標(biāo)，1 2 μ L250mmol/L 的 MgCl2,余量為無(wú)菌水。優(yōu)選地，所述步驟4中熒光檢測(cè)的反應(yīng)體系為250μ L體系中，25 μ L 1 OOmmo 1/L 的Tris，10 μ L 1 μ mol/L的所述分子信標(biāo)，1 μ L 250mmol/L的MgCl2，余量為無(wú)菌水。作為優(yōu)選，所述步驟4中熒光檢測(cè)條件為以495nm熒光激發(fā)，510 620nm熒光檢測(cè)。優(yōu)選地，將檢測(cè)體系于61°C水浴鍋溫浴，30min，加入連接產(chǎn)物平衡5min后以 495nm熒光激發(fā)，510 620檢測(cè)熒光。端粒酶活性越強(qiáng)，熒光值越高。端粒酶端粒酶活性越弱則熒光值越低。同時(shí)可以通過(guò)電泳的方式檢測(cè)長(zhǎng)鏈產(chǎn)物的多少印證熒光檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本發(fā)明提供的端粒酶活性檢測(cè)方法，從待測(cè)樣品中獲得具有活性的端粒酶后，延伸TS引物得到端粒酶延伸產(chǎn)物，將端粒酶延伸產(chǎn)物作為模板，在四個(gè)引物的存在下，進(jìn)行缺刻連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，將該擴(kuò)增產(chǎn)物與分子信標(biāo)混合反應(yīng)后，利用擴(kuò)增產(chǎn)物為具有較長(zhǎng)莖結(jié)構(gòu)的雙鏈信標(biāo)靶序列，能夠打開(kāi)信標(biāo)，同時(shí)打開(kāi)信標(biāo)后產(chǎn)生的熒光值也越高，從而通過(guò)熒光檢測(cè)間接反應(yīng)端粒酶活性，或通過(guò)電泳檢測(cè)得到端粒酶活性。該檢測(cè)方法靈敏度高、特異性好，能夠有效檢測(cè)待測(cè)樣品中的端粒酶活性。


圖1示實(shí)施例2中檢測(cè)200個(gè)Hella細(xì)胞端粒酶活性的電泳圖。其中，泳道1為 200個(gè)Hella細(xì)胞端粒酶延伸連接后的條帶，連接后產(chǎn)生一條明顯特異性的大片段條帶；泳道2為沒(méi)有端粒酶延伸的的產(chǎn)物連接擴(kuò)增后的條帶，該條帶無(wú)任何可見(jiàn)的連接大片段，僅僅有未連接的小片段存在；泳道3為連接反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)了一種端粒酶活性的檢測(cè)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容， 適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法中所用的Went(exo_)DNA polymerase、9° N Iigase購(gòu)自 New England biolabs (NEB)，人工核酸序列、dATP、dGTP、dCTP、dGTP、來(lái)自上海生工生物工程(上海)有限公司。PEG6000等化學(xué)試劑購(gòu)自sigma公司。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例12X106個(gè)293T細(xì)胞加CHAPS裂解液(10mmol/L Tris_HCl，pH 7. 5, lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA，0. lmmol/L PMSF，5mmol/L 巰基乙醇，0. 5 % w/v CHAPS (3-[ (3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-丙磺酸)，10% w/v甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期間用移液器反復(fù)抽吸 3次，保證充分裂解。HOOOrpm離心20min，吸取上清置-80°C保存?zhèn)溆?。延伸反?yīng)體系50μ L 體系，包括 10 X TRAP 緩沖液(200mmol/L Tris_HCl，pH 8. 3，15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl, 10mmol/L EGTA) 5 μ L, dATP、dTTP 和 dGTP 各50 μ mol/L, TS引物為150nmol/L,補(bǔ)加無(wú)菌DEPC水至46 μ L，加入2 μ L端粒酶提取物作為陽(yáng)性延伸，加入重蒸水為陰性延伸，在25°C保溫20min，反轉(zhuǎn)錄合成端粒酶延伸產(chǎn)物。吸取延伸產(chǎn)物1 μ L作為缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板進(jìn)行20 μ L體系擴(kuò)增擴(kuò)增體系20 μ L 體系10XTaq ligase buffer 2μ L,50% PEG 2 μ L、P” P2、P3、 卩4各 500nmol/LJent (exo_) DNA polymerase 0. 4U、9° N ligase 4U、延伸產(chǎn)物 1 μ L、無(wú)菌水補(bǔ)充至20 μ L0反應(yīng)液90°C加熱:3min滅活端粒酶，然后補(bǔ)充dGTP 5 μ mol/L。然后進(jìn)行連接酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增，反應(yīng)條件90°C 30s,48°C 8min,24個(gè)循環(huán)。檢測(cè)體系250μ L 體系25 μ L Tris (1 OOmmo 1/L) UO μ L 分子信標(biāo)(1 μ mol/L)、 1 μ L MgCl2(250mmol/L)、214yL 無(wú)菌水。將檢測(cè)體系于61 °C水浴鍋溫浴30min，加入連接產(chǎn)物平衡5min后以495nm熒光激發(fā)，510 620nm檢測(cè)熒光。結(jié)果顯示有端粒酶延伸的連接產(chǎn)物能通過(guò)形成的長(zhǎng)的雙鏈分子信標(biāo)靶序列打開(kāi)分子信標(biāo)，在520nm產(chǎn)生明顯的熒光發(fā)射峰，而沒(méi)有端粒酶延伸的連接產(chǎn)物由于形成的雙鏈靶序列分子的莖較短，因而打不開(kāi)分子信標(biāo)，所以在520nm沒(méi)有任何熒光發(fā)射峰。實(shí)施例22X IO6 個(gè) Hella 細(xì)胞力口 CHAPS 裂解液(10mmol/L Tris-HCl, pH 7. 5，lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA，0. lmmol/L PMSF，5mmol/L巰基乙醇，0. 5% w/v CHAPS (3-[ (3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-丙磺酸)，10% w/v甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期間用移液器反復(fù)抽吸3次，保證充分裂解。HOOOrpm離心20min，吸取上清置_80°C保存?zhèn)溆?。延伸反?yīng)體系50μ L 體系，包括 10 X TRAP 緩沖液(200mmol/L Tris_HCl，pH 8. 3， 15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl, lOmmol/L EGTA) 5 μ L, dATP、dTTP 和 dGTP 各50 μ mol/L, TS引物為150nmol/L,補(bǔ)加無(wú)菌DEPC水至46 μ L，加入2 μ L端粒酶提取物作為陽(yáng)性延伸，加入重蒸水為陰性延伸，在25°C保溫20min，反轉(zhuǎn)錄合成端粒酶延伸產(chǎn)物。吸取延伸產(chǎn)物1 μ L作為缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板進(jìn)行20 μ L體系擴(kuò)增擴(kuò)增體系20 μ L 體系10 X Taq ligase buffer2 μ L，50% PEG2 μ L、P” P2、P3、P4 各 500nmol/L、Went(exo-)DNA polymerase 0. 4U、9° N ligase 4U、延伸產(chǎn)物 1 μ L、無(wú)菌水補(bǔ)充至20 μ L0反應(yīng)液90°C加熱:3min滅活端粒酶，然后補(bǔ)充dGTP 5 μ mol/L。然后進(jìn)行連接酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增，反應(yīng)條件90°C 30s,48°C 8min,22個(gè)循環(huán)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。取10 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PAGE電泳，經(jīng)銀染后結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，200個(gè)Hella細(xì)胞的端粒酶延伸產(chǎn)物就能在擴(kuò)增后產(chǎn)生明顯的特性連接片段，而端粒酶延伸的產(chǎn)物無(wú)任何連接。說(shuō)明該方法具有非常高的靈敏度，可以檢測(cè)到約100左右的Hella細(xì)胞的端粒酶活性，且特異性強(qiáng)，端粒酶活性的延伸產(chǎn)物沒(méi)有任何非特異性連接。實(shí)施例32X106f^3T細(xì)胞加CHAPS裂解液(10mmol/L Tris-HCLpH 7. 5, lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA，0. lmmol/L PMSF，5mmol/L 巰基乙醇，0. 5 % w/v CHAPS (3-[ (3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-丙磺酸)，10% w/v甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期間用移液器反復(fù)抽吸 3次，保證充分裂解。HOOOrpm離心20min，吸取上清置-80°C保存?zhèn)溆谩Ｑ由旆磻?yīng)體系50μ L 體系，包括 10 X TRAP 緩沖液(200mmol/L Tris_HCl，pH 8.3， 15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl, lOmmol/L EGTA) 5 μ L, dATP、dTTP 和 dGTP 各50 μ mol/L, TS引物為150nmol/L,補(bǔ)加無(wú)菌DEPC水至46 μ L，加入2 μ L端粒酶提取物作為陽(yáng)性延伸，加入重蒸水為陰性延伸，在25°C保溫20min，反轉(zhuǎn)錄合成端粒酶延伸產(chǎn)物。吸取延伸產(chǎn)物1 μ L作為缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板進(jìn)行20 μ L體系擴(kuò)增擴(kuò)增體系20 μ L 體系10 X Taq ligase buffer2 μ L, 50% PEG 2· 5 μ L、P”P(pán)2、P3、 P4 各 100nmol/L、Went (exo_) DNApolymerase 0. 2U、9° N ligase 2U、延伸產(chǎn)物 1 μ L、無(wú)菌水補(bǔ)充至20 μ L0反應(yīng)液90°C加熱3min滅活端粒酶，然后補(bǔ)充dGTP 8 μ mol/L。然后進(jìn)行連接酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增，反應(yīng)條件90°C 60s,45°C 8min,35個(gè)循環(huán)。檢測(cè)體系250μL 體系25μ L Tris (50mmol/L)、10 μ L 分子信標(biāo)(5 μ mol/L)、 2μ L MgCl2(250mmol/L)、214yL 無(wú)菌水。將檢測(cè)體系于61 °C水浴鍋溫浴30min，加入連接產(chǎn)物平衡5min后以495nm熒光激發(fā)，510 620nm檢測(cè)熒光。結(jié)果顯示有端粒酶延伸的連接產(chǎn)物能通過(guò)形成的長(zhǎng)的雙鏈分子信標(biāo)靶序列打開(kāi)分子信標(biāo)，在520nm產(chǎn)生明顯的熒光發(fā)射峰，而沒(méi)有端粒酶延伸的連接產(chǎn)物由于形成的雙鏈靶序列分子的莖較短，因而打不開(kāi)分子信標(biāo)，所以在520nm沒(méi)有任何熒光發(fā)射峰，僅有分子信標(biāo)本身在520nm的背景熒光。實(shí)施例4結(jié)腸癌組織0. Img,在液氮中研磨成粉末，(癌旁組織作為對(duì)照)加預(yù)冷的CHAPS 裂解液(10mmol/L Tris-HCl, pH 7. 5, lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA, 0. lmmol/L PMSF, 5mmol/L巰基乙醇，0. 5 % w/v CHAPS (3-[ (3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-丙磺酸)，10 % w/v 甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期間用移液器反復(fù)抽吸3次，保證充分裂解。HOOOrpm離心 20min,吸取上清置-80°C保存?zhèn)溆?。延伸反?yīng)體系:50μ L 體系，包括 10 X TRAP 緩沖液(200mmol/L Tris_HCl，pH 8. 3， 15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl, lOmmol/L EGTA) 5 μ L, dATP、dTTP 和 dGTP 各50 μ mol/L, TS引物為150nmol/L,補(bǔ)加無(wú)菌DEPC水至46 μ L，加入2 μ L端粒酶提取物作為陽(yáng)性延伸，加入重蒸水為陰性延伸，在25°C保溫20min，反轉(zhuǎn)錄合成端粒酶延伸產(chǎn)物。吸取延伸產(chǎn)物1 μ L作為缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板進(jìn)行20 μ L體系擴(kuò)增擴(kuò)增體系20μ L 體系10 X Taq ligase buffer2 μ L, 50% PEG 1 μ L, P1, P2, Ρ3> P4 各 300nmol/L、Went(exo-)DNA polymerase 0. 5U、9° N ligase 3U、延伸產(chǎn)物 1 μ L、無(wú)菌水補(bǔ)充至20 μ L0反應(yīng)液90°C加熱3min滅活端粒酶，然后補(bǔ)充dGTP 8 μ mol/L。然后進(jìn)行連接酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增，反應(yīng)條件:90°C 45s，61°C 3min,28個(gè)循環(huán)。檢測(cè)體系250μL 體系25μ L Tris (80mmol/L)、10 μ L 分子信標(biāo)(3 μ mol/L)、 2μ L MgCl2(250mmol/L)、214yL 無(wú)菌水。將檢測(cè)體系于61 °C水浴鍋溫浴30min，加入連接產(chǎn)物平衡5min后以495nm熒光激發(fā)，510 620nm檢測(cè)熒光。結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織端粒酶延伸產(chǎn)物的連接產(chǎn)物能通過(guò)形成的長(zhǎng)的雙鏈分子信標(biāo)靶序列打開(kāi)分子信標(biāo)，在520nm產(chǎn)生明顯的熒光發(fā)射峰，而癌旁組織端粒酶延伸產(chǎn)物的連接產(chǎn)物由于形成的雙鏈靶序列分子的莖較短，因而打不開(kāi)分子信標(biāo)，所以在520nm沒(méi)有任何熒光發(fā)射峰。實(shí)施例5乳腺癌組織0. Img在液氮中研磨成粉末，(癌旁組織作為對(duì)照)加預(yù)冷的CHAPS 裂解液(10mmol/L Tris-HCl, pH 7. 5, lmmol/L MgCl2, lmmol/L EGTA，0. lmmol/L PMSF, 5mmol/L巰基乙醇，0. 5 % w/v CHAPS (3-[ (3-膽酰胺丙基)-二乙銨]-丙磺酸)，10 % w/v 甘油)200 μ L，冰浴裂解30min，期間用移液器反復(fù)抽吸3次，保證充分裂解。HOOOrpm離心 20min,吸取上清置_80°C保存?zhèn)溆谩Ｑ由旆磻?yīng)體系:50μ L 體系，包括 10 X TRAP 緩沖液(200mmol/L Tris_HCl，pH 8. 3， 15mmol/L MgCl2,1% Tween-20,630mmol/L KCl, lOmmol/L EGTA) 5 μ L, dATP、dTTP 和 dGTP 各50 μ mol/L, TS引物為150nmol/L,補(bǔ)加無(wú)菌DEPC水至46 μ L，加入2 μ L端粒酶提取物作為陽(yáng)性延伸，加入重蒸水為陰性延伸，在25°C保溫20min，反轉(zhuǎn)錄合成端粒酶延伸產(chǎn)物。吸取延伸產(chǎn)物1 μ L作為缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板進(jìn)行20 μ L體系擴(kuò)增擴(kuò)增體系20μ L 體系 JOXiTaq ligase buffer2 μ L, 50% PEG L 5 μ L、P”P(pán)2、P3、 P4 各 400nmol/L、Went(exo-)DNA polymerase 0. 3U、9° N ligase 2U、延伸產(chǎn)物 1 μ L、無(wú)菌水補(bǔ)充至20 μ L0反應(yīng)液90°C加熱:3min滅活端粒酶，然后補(bǔ)充dGTP 8 μ mol/L。然后進(jìn)行連接酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增，反應(yīng)條件:90°C 60s, 53°C 5min,30個(gè)循環(huán)。檢測(cè)體系250μ L 體系25 μ L Tris (50mmol/L)、10 μ L 分子信標(biāo)(1 μ mol/L)、 2μ L MgCl2(250mmol/L)、214yL 無(wú)菌水。將檢測(cè)體系于61 °C水浴鍋溫浴30min，加入連接產(chǎn)物平衡5min后以495nm熒光激發(fā)，510 620nm檢測(cè)熒光。結(jié)果顯示乳腺組織端粒酶延伸產(chǎn)物的連接產(chǎn)物能通過(guò)形成的長(zhǎng)的雙鏈分子信標(biāo)靶序列打開(kāi)分子信標(biāo)，在520nm產(chǎn)生明顯的熒光發(fā)射峰，而乳腺癌旁組織端粒酶延伸產(chǎn)物的連接產(chǎn)物由于形成的雙鏈靶序列分子的莖較短，因而打不開(kāi)分子信標(biāo)，所以在520nm沒(méi)有任何熒光發(fā)射峰。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種端粒酶活性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括步驟1 從待測(cè)樣品中獲得端粒酶；步驟2:在所述端粒酶的作用下延伸具有如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的TS引物， 得到端粒酶延伸產(chǎn)物；步驟3 將所述端粒酶延伸引物作為模板，在引物存在下進(jìn)行缺刻連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；步驟4 對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，得到所述端粒酶活性。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3中所述缺刻連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的引物為P” P2> P3和P4，其中P1具有SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，P2具有SEQ ID NO 3 所示核苷酸序列，P3具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列，P4具有SEQ ID NO 5所示核苷酸序列的所示核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3中擴(kuò)增的反應(yīng)條件為 900C 30 60s，45 61°C 3 8min，22 35 個(gè)循環(huán)。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3中擴(kuò)增前，還包括90°C加熱 3min滅活端粒酶后，補(bǔ)充dGTP 2 8 μ mol/L的步驟。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3中擴(kuò)增的反應(yīng)體系為 IOXTaq ligase buffer 10v%,50% PEG 0· 05 12. 5v%，P” P2、P3、P4 終濃度分別為 100 500nmol/L，Went(exo-)DNA polymerase 0· 2 0. 5U/20 μ L 體系，9° N ligase 2 4U/20 μ L體系，所述步驟2得到的端粒酶延伸產(chǎn)物0. 05ν%，余量為無(wú)菌水。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟4中所述檢測(cè)包括熒光檢測(cè)或電泳檢測(cè)。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟4中所述檢測(cè)為將步驟3中所述擴(kuò)增產(chǎn)物與如SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的分子信標(biāo)混合反應(yīng)后進(jìn)行熒光檢測(cè)。
8.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，以體積分?jǐn)?shù)計(jì)，所述步驟4中反應(yīng)體系為10% 50 100mmol/L 的 Tris，0. 04% 1 5 μ mol/L 的所述分子信標(biāo)，0. 004 0. 008% 250mmol/L的MgCl2，余量為無(wú)菌水。
9.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟4中反應(yīng)條件為ere水浴鍋溫浴30min，加入所述擴(kuò)增產(chǎn)物平衡5min。
10.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟4中熒光檢測(cè)條件為以 495nm熒光激發(fā)，510 620nm熒光檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種端粒酶活性的檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法從待測(cè)樣品中獲得具有活性的端粒酶后，延伸TS引物得到端粒酶延伸產(chǎn)物，將端粒酶延伸產(chǎn)物作為模板，在四個(gè)引物的存在下，進(jìn)行缺刻連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，將該擴(kuò)增產(chǎn)物與分子信標(biāo)混合反應(yīng)后，熒光檢測(cè)得到端粒酶活性。該檢測(cè)方法靈敏度高、特異性好，能夠有效檢測(cè)待測(cè)樣品中的端粒酶活性。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK102260739SQ20111018206
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者于聰, 劉丹, 廖冬麗, 張玉靜, 張青峰, 李文英, 楊越, 焦虎平, 王斌, 王方遠(yuǎn), 陳健 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所